一种褐藻胶裂解酶AlgX1989及其应用

技术领域

本发明属于生物技术技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶AlgX1989及其应用。

背景技术

褐藻胶(也称海藻酸盐)是海洋褐藻细胞壁中的主要成分，含量可占到藻体干重的40％，是来源丰富且产量巨大的生物资源。褐藻胶主要是由D-甘露糖醛酸(M)以及其差向异构体L-古罗糖醛酸(G)通过1,4糖苷键连接而成的直链酸性多糖。根据糖醛酸单体种类的不同，褐藻胶主要由聚甘露糖醛酸(Poly M)、聚古罗糖醛酸(Poly G)以及杂合的聚甘露糖醛酸/古罗糖醛酸(Poly MG或GM)这三种成分组成。褐藻胶广泛应用于能源、化工、食品、医药、饲料和农业等许多重要生产领域。近年来的研究表明，褐藻胶还具备抗菌、消炎、抗肿瘤、抗氧化、提高机体免疫力、刺激植物生长和防御、激活细胞因子以及增强肠道益生菌等许多生理活性功能，因而备受人们关注。然而，由于天然褐藻胶的粘度高，分子量大，不利于生物体的吸收和利用，其生物活性功能的发挥受到很大的制约，因此人们更倾向于利用分子量更小的褐藻胶降解产物—褐藻寡糖。褐藻寡糖的聚合度一般为2～25，主要分为甘露糖醛酸寡糖(M2～M25)和古罗糖醛酸寡糖(G2～G25)。更为深入的研究结果表明，褐藻寡糖特定的生物活性与种类和聚合度密切相关，如文献一(Unsaturated mannuronate oligosaccharideamelioratesβ-amyloid pathology through autophagy inAlzheimer’s disease cellmodels)报道了组分为M2～M11的褐藻寡糖能够通过促进细胞自噬作用抑制淀粉样蛋白-β(Aβ)1-42寡聚体的聚集，降低Aβ1-42蛋白的表达，有可能成为治疗阿尔茨默海病症的潜在天然药物或功能性食品。文献二(Identification and activation of TLR4-mediatedsignaling pathways by alginate-derived guluronate oligosaccharide in RAW264.7macrophages)报道了聚合度为2～8的古罗糖醛酸能够激活细胞TLR4/Akt/NF-κB、TLR4/Akt/mTOR以及MAPK信号通路，发挥显著的免疫刺激作用。文献三(Induction ofMultipleCytokine Secretion from RAW264.7Cells byAlginate Oligosaccharides)研究了不同类型(M和G)和聚合度大小(DP3-6)的褐藻寡糖对细胞因子分泌的刺激作用，发现与其他类型和聚合度的褐藻寡糖相比，M3能更有效地刺激RAW264.7细胞分泌TNF-α、G-CSF以及GM-CSF等多种细胞因子。因此，定向制备特定聚合度或不同类型的褐藻寡糖，对于充分挖掘褐藻寡糖的活性功能，发挥其最大效益，显得至关重要。

褐藻寡糖的制备方法主要有化学法、物理法和生物酶解法，生物酶解法具有效率高、条件温和、环境友好以及副产物少等优点，是目前研究最多的制备方法和今后的主要发展方向。到目前为止已经发现了多种类型的褐藻胶裂解酶以及相应的褐藻寡糖制备方法。然而，目前生物酶解法仍然存在产物特异性较差，底物利用率较低、单一酶解效率不高等缺点，限制了定向制备均一度褐藻寡糖技术的发展及相关制品的应用。比如文献四(Structural insights into a novel Ca2+-independent PL-6 alginate lyase fromVibrio OU02identify the possible subsites responsible forproductdistribution)提供了一种底物偏好于Poly G的新型褐藻胶裂解酶AlyF，主要产物为三聚的古罗糖醛酸寡糖。但是AlyF对PolyM的降解活性较差，在制备均一甘露糖醛酸寡糖中受到了限制，造成褐藻胶底物的利用效率降低。专利文件(发明名称：一种均一性褐藻三糖的制备方法，申请号201910736671.7)提供了一种褐藻胶裂解酶联合降解褐藻胶的方法，利用分别具有polyM和polyG底物特异活性的褐藻胶裂解酶AlyV和AlyF来降解褐藻胶，制备得到了褐藻三糖。该方法不但提高了底物转化利用效率，同时还进一步增加了产物的均一性。但是该方法需要同时使用到两种褐藻胶裂解酶，增加了酶的使用成本和制备步骤，总体生产效益仍需进一步提高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种褐藻胶裂解酶AlgX1989及其应用，采用本发明提供的褐藻胶裂解酶AlgX1989制备褐藻寡糖方法简单、高效、环保，产物均一性高，生物活性强，只需单一褐藻胶裂解酶AlgX1989就能高效制备均一性较高的褐藻寡糖，具有明显的综合效益。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种褐藻胶裂解酶AlgX1989，所述褐藻胶裂解酶AlgX1989的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了上述技术方案所述的褐藻胶裂解酶AlgX1989在制备褐藻寡糖中的应用。

优选的，制备褐藻寡糖的方法包括：

1)将原料与磷酸缓冲液混合，得到原料液；

所述原料包括聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸和海藻酸钠中的一种或多种；

2)将所述步骤1)得到的原料液与权利要求1所述的褐藻胶裂解酶AlgX1989混合、酶解，得到褐藻寡糖。

优选的，所述步骤1)原料液中原料的质量浓度为10～150g/L。

优选的，所述原料与褐藻胶裂解酶AlgX1989的质量比为1000:0.2～0.8。

优选的，所述步骤2)酶解的条件包括：温度为15～25℃，酶解时间为12～24h，静置酶解。

本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的褐藻胶裂解酶AlgX1989制备的褐藻寡糖在提高动物生长性能和/或改善健康状况中的应用。

优选的，所述动物包括肉牛。

优选的，所述应用包括：将所述褐藻寡糖与基础日粮混合后饲喂动物，早晚饲喂两次。

优选的，每千克基础日粮添加500～800mg褐藻寡糖。

本发明的有益效果为：

1.采用本发明提供的褐藻胶裂解酶AlgX1989制备的褐藻寡糖，组分均一性好，三糖的含量最高可达75％以上。利用了褐藻胶裂解酶AlgX1989的双功能特性和产物专一性高的优点，使PolyM、PolyG和海藻酸钠等原料充分降解，定向制备得到了特定聚合度的均一褐藻寡糖，与目前多数酶法制备褐藻寡糖的方法相比，具有底物利用效率高、酶用量较少、操作简单以及产物专一性强等优点，具备极高的规模化生产和应用的潜能。

2.本发明提供的褐藻胶裂解酶AlgX1989制备的褐藻寡糖，主要由褐藻三糖组成，作为为饲料添加剂拌入肉牛的日常饲料中进行喂养，能够明显提高肉牛的平均日增重，降低料重比，提高机体消化吸收能力，从而促进生长；同时能够有效提高机体蛋白代谢水平、免疫力及抗氧化性能，改善肉牛的健康状况；此外还能够提高瘤胃中蛋白和非纤维性碳水化合物类分解菌的相对丰度，并提高瘤胃氨态氮和挥发性脂肪酸的浓度，增强了瘤胃的消化功能；具有使用方便，用量少，无副作用，安全有效等优点，拓展了褐藻寡糖在畜牧养殖生产领域中的应用范围。

附图说明

图1为Poly M酶解产物TLC图；

图2为Poly M酶解主要产物ESI-MS图；

图3为PolyM酶解产物分离图；

图4为Poly G酶解产物TLC图；

图5为Poly G酶解主要产物ESI-MS图；

图6为Poly G酶解产物分离图；

图7为海藻酸钠酶解产物TLC图；

图8为海藻酸钠酶解主要产物ESI-MS图；

图9为海藻酸钠酶解产物分离图；

图10为AlgX1989对不同底物的酶解活性分析。

具体实施方式

本发明提供了一种褐藻胶裂解酶AlgX1989，所述褐藻胶裂解酶AlgX1989的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

NSTATMVDPFPNNQETGADILTPVTITASSHDGNVPELLFDQDIMTRWSANGDGEWATLDYGSVYEFDAIQASFSKGNERVTKFDIQFSTDGENWVTVIEGAQSSGRALGLERFQFKPAVKARYVRYVGHGNTKNQWNSVTELAAVNCGINACPASHIITDDVVKAEAAIIAEMKAEQNAQKALLKENRKGDFGEPIVRPCETTVTCDLTKAMPSPTLPATPIATNAPGQNFDLTRWKLTTPFDHNKDGRADDIDEWDMANGFQHPDIFFTADDGGMVFKSYVKGARTSKNTKYARTELRTMLRAGEKSYSTKGVNPNNWVFSSAPVEDQKAAGGVDGTLEATLKIDHATVTGQSHEVGRFIIGQIHDKDDEPIRLYYRKLPDQPTGTVYFAHEKTKTGTEDYYDLVGDMTGEVGEDGIALGEKFSYIIDVKGNTMTVTVKRDGKDDVVQVVDMSDSGYDEGGRYMYFKAGVYNQNMYGNPDDYAQATFYKLKQSFGKYKG。

在本发明中，编码所述褐藻胶裂解酶AlgX1989的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

ATGAAACATATTTTCCTTAAGAGCTTGTTAGCTTCTTCTGTTCTTGTTGCTGTTGGCTGCAACAGC(编码信号肽碱基)ACAGCAACCATGGTAGACCCATTCCCAAATAACCAAGAAACCGGCGCTGACATTCTGACTCCTGTTACAATTACAGCAAGCAGCCATGATGGTAACGTACCTGAGTTGCTTTTTGACCAAGATATAATGACACGTTGGTCGGCAAACGGCGACGGTGAGTGGGCGACGTTGGATTACGGCTCAGTTTATGAGTTCGATGCCATCCAAGCGTCTTTTAGTAAAGGTAATGAGCGTGTCACCAAGTTTGATATTCAGTTCAGCACTGATGGTGAAAATTGGGTGACGGTAATTGAAGGAGCACAAAGCTCTGGCCGCGCTCTTGGCCTAGAACGCTTCCAGTTCAAACCGGCAGTAAAAGCGCGCTATGTTCGTTACGTTGGTCATGGTAATACCAAGAACCAATGGAATTCAGTCACAGAGCTAGCAGCAGTCAATTGTGGAATCAACGCATGCCCTGCAAGCCACATCATTACCGATGATGTTGTTAAAGCTGAAGCAGCTATAATTGCGGAAATGAAAGCAGAGCAAAATGCACAGAAAGCGTTGCTGAAAGAGAACCGTAAAGGTGATTTCGGAGAACCAATCGTTCGCCCTTGTGAAACGACTGTGACGTGTGACCTAACTAAAGCGATGCCTTCCCCTACGTTGCCAGCAACTCCAATAGCCACAAATGCACCGGGCCAAAACTTTGACCTGACGCGCTGGAAACTGACGACGCCATTTGATCATAATAAAGACGGGCGTGCTGATGATATCGATGAGTGGGATATGGCAAACGGCTTCCAACACCCGGATATCTTCTTCACCGCTGATGACGGTGGCATGGTGTTTAAGAGCTATGTAAAAGGTGCACGTACCTCTAAAAACACTAAGTATGCACGTACAGAGCTACGTACTATGCTACGTGCTGGTGAGAAGTCCTACAGCACAAAAGGTGTGAATCCAAATAACTGGGTATTCAGTTCAGCGCCAGTAGAGGATCAAAAAGCAGCAGGTGGGGTCGATGGCACGCTTGAAGCAACTCTAAAGATTGACCACGCAACAGTCACTGGTCAGTCACACGAGGTTGGTCGCTTCATTATTGGCCAAATTCATGATAAAGATGATGAGCCAATTCGTCTTTACTACCGTAAGCTACCAGATCAACCAACAGGTACGGTTTACTTCGCTCACGAGAAAACTAAAACAGGTACAGAGGATTACTACGATCTAGTCGGTGATATGACTGGTGAAGTCGGTGAAGACGGTATCGCTCTTGGTGAGAAATTTAGCTACATCATTGATGTGAAAGGCAACACAATGACGGTTACGGTAAAACGTGATGGTAAAGATGATGTTGTTCAAGTCGTTGACATGAGTGACAGCGGCTACGATGAAGGAGGTCGCTACATGTACTTCAAAGCTGGTGTTTACAACCAGAATATGTACGGTAATCCAGACGATTACGCACAAGCGACGTTCTATAAGCTAAAGCAGTCTTTCGGTAAATATAAAGGCTAG。

本发明对获取褐藻胶裂解酶AlgX1989的方法没有特殊限定，本领域技术人员采用常规基因工程的方法获取即可，如：

根据去除编码信号肽碱基的基因序列，分别设计上游PCR引物(SEQ ID No.3)：GGAATTC

AlgX1989酶液制备：挑取E.coli BL21-AlgX1989单菌落于含有50μg/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床过夜培养获得种子培养液。将种子培养液按1％的接种量接入含有50ug/ml硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养至OD

本发明还提供了上述技术方案所述的褐藻胶裂解酶AlgX1989在制备褐藻寡糖中的应用。

在本发明中，制备褐藻寡糖的方法优选包括：

1)将原料与磷酸缓冲液混合，得到原料液；

所述原料包括聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸和海藻酸钠中的一种或多种；

2)将所述步骤1)得到的原料液与上述技术方案所述的褐藻胶裂解酶AlgX1989混合、酶解，得到褐藻寡糖。

本发明将原料与磷酸缓冲液混合，得到原料液；所述原料包括聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸和海藻酸钠中的一种或多种。在本发明中，所述磷酸缓冲液的浓度优选为50mM，pH值为7.4。在本发明中，所述磷酸缓冲液优选为磷酸钠缓冲液。在本发明中，所述原料液中原料的质量浓度优选为10～150g/L，优选为20～100g/L。在本发明中，所述原料与褐藻胶裂解酶AlgX1989的质量比优选为1000:0.2～0.8。在本发明中，所述酶解的条件优选包括：温度为15～25℃，酶解时间为12～24h，静置酶解。本发明优选在酶解结束后加热灭活酶，采用常规冷冻干燥得到褐藻寡糖。在本发明中，所述褐藻寡糖中以三糖为主。

本发明还提供了一种利用上述技术方案所述的褐藻胶裂解酶AlgX1989制备的褐藻寡糖在提高动物生长性能和/或改善健康状况中的应用。在本发明中，所述动物优选包括肉牛。在本发明中，所述应用优选包括：将所述褐藻寡糖与基础日粮混合后饲喂动物，早晚饲喂两次，自由采食。在本发明中，每千克基础日粮优选添加500～800mg褐藻寡糖。本发明对所述基础日粮没有特殊限定，采用常规饲喂肉牛使用的基础日粮即可，如基础日粮配方(％，风干基础)：青贮玉米50、玉米10、木薯粉15、玉米皮10、豆粕8，白酒糟5、氯化钠0.15、小苏打0.1、预混料1.75。(注：预混料为每公斤基础日粮提供：0.25g FeSO

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

以Poly M为底物制备褐藻寡糖：

称取聚甘露糖醛酸(PolyM,含量≥97％，青岛博智汇力)干粉，按照50g/L的浓度加入50mM，pH值7.4的磷酸钠缓冲液，搅拌充分溶解后，加入AlgX1989裂解酶，使其终浓度达到0.08mg/ml，混合均匀后，室温下(25℃)静置酶解12h，酶解结束后，加热灭活酶，然后将溶液直接冷冻干燥制备得到褐藻寡糖粉末。取适量酶解结束后的溶液点样于硅胶板上，进行产物薄层层析分析(TLC)。硅胶板：德国默克；展开剂：正丁醇:甲酸:水＝3:2:1(V/V)；显色剂：10％硫酸，50％乙醇，1mg/ml 1,3萘二酚；同时采用Mono Q

实施例2

以Poly G为底物制备褐藻寡糖：

称取聚古罗糖醛酸(Poly G,含量≥97％，青岛博智汇力)干粉，按照20g/L的浓度加入50mM，pH值7.4的磷酸钠缓冲液，搅拌充分溶解后，加入AlgX1989裂解酶，使其终浓度达到0.08mg/ml，混合均匀后，室温下(25℃)静置酶解12h，酶解结束后，加热灭活酶，然后将溶液直接冷冻干燥制备得到褐藻寡糖干粉。取适量酶解结束后的溶液点样于硅胶板上，进行产物薄层层析分析(TLC)。硅胶板：德国默克；展开剂：正丁醇:甲酸:水＝3:2:1(V/V)；显色剂：10％硫酸，50％乙醇，1mg/ml 1,3萘二酚；同时采用Mono Q

实施例3

以海藻酸钠为底物制备褐藻寡糖：

称取海藻酸钠(SA,含量≥98％，阿拉丁试剂)干粉，按照100g/L的浓度加入50mM，pH值7.4的磷酸钠缓冲液，搅拌充分溶解后，加入AlgX1989裂解酶，使其终浓度达到0.08mg/ml，混合均匀后，室温下(25℃)静置酶解24h，酶解结束后，加热灭活酶，然后将溶液直接冷冻干燥制备得到褐藻寡糖干粉。取适量酶解结束后的溶液点样于硅胶板上，进行产物薄层层析分析(TLC)。硅胶板：德国默克；展开剂：正丁醇:甲酸:水＝3:2:1(V/V)；显色剂：10％硫酸，50％乙醇，1mg/ml 1,3萘二酚；同时采用Mono Q

实施例4

AlgX1989的底物特异性分析：

用50mM，pH值7.4的磷酸钠缓冲液分别配制0.1％(质量分数)的海藻酸钠(SA，含量≥98％，阿拉丁试剂)、聚甘露糖醛酸(Poly M,含量≥97％，青岛博智汇力)和聚古罗糖醛酸(Poly G,含量≥97％，青岛博智汇力)底物溶液。在上述不同的反应底物溶液中加入相同量的AlgX1989稀释酶液(酶终浓度为1.0μg/mL)，置于25℃的水浴中反应20min，沸水浴10min结束反应。反应溶液用分光光度计检测235nm的吸光值(OD值)。酶活单位定义为：在上述酶反应体系中每分钟增加0.1OD值所需的酶量定义为一个酶活力单位。以海藻酸钠底物的酶活力作为100％，分别计算PolyM和PolyG为底物的相对酶活力。分析结果表明(如图10所示)，AlgX1989具有广泛的底物适应性，对SA、PolyM和Poly G这三种底物均表现出高效的降解活性，其相对酶活力分别为100％，109％和79％，是一种高效的双功能褐藻胶裂解酶。

实施例1、实施例2、实施例3和实施例4表明，裂解酶AlgX1989具有广泛的底物适应性，能够彻底降解Poly M、PolyG和海藻酸钠(含Poly M和Poly G)，制备不同类型且均一性较高的褐藻寡糖。

实施例5

肉牛饲喂试验

称取2kg市售食品级海藻酸钠粉末(青岛明月海藻)，加入20L磷酸钠缓冲液(50mM，pH值7.4)，充分搅拌后加入200ml AlgX1989裂解酶溶液(浓度为8mg/ml)，继续搅拌均匀，置于室温下(25℃)静置酶解24h酶解结束后，将溶液冷冻干燥得到主要聚合度为3的均一性较高的褐藻寡糖干粉(含M和G组分)，作为后续饲喂试验的饲料添加剂样品。

基础日粮配方(％，风干基础)：青贮玉米50、玉米10、木薯粉15、玉米皮10、豆粕8，白酒糟5、氯化钠0.15、小苏打0.1、预混料1.75。(注：预混料为每公斤日粮提供:0.25gFeSO

饲喂试验方法：选取20头7月龄、体重为202kg、健康状况良好的安格斯肉牛，随机分为对照组和试验组两个处理组，每组10个重复。对照组饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加700mg/kg褐藻寡糖。饲喂的日粮为同一批次的原料。早晚饲喂2次(8：00，16：00)，自由采食，自由饮水。预饲期7d，正式试验期56d。

1)生长性能分析

分别在正式试验期的第1、28和56d测量肉牛的体重，用于计算平均日增重量。试验期间每天记录肉牛的饲喂量与剩料量，用于计算干物质采食量和料重比。

平均日采食量＝每头牛试验期内采食量/试验天数

平均日增重＝(末重－初重)/试验天数

料重比＝每头牛平均日采食量/平均日增重

试验结果如表1所示，结果表明，褐藻寡糖在各个饲喂阶段均提高了肉牛的平均日增重，降低料重比。特别是在29-56d这一饲喂阶段表现更加明显。说明褐藻寡糖饲喂前期作用效果并没有这么迅速，但是随着饲喂时间的增长，增重效果和饲料利用率的到了明显的提高。

表1褐藻寡糖对肉牛生长性能的影响

2)血清生化指标测定与分析

在试验最后1d的晨饲前对肉牛进行尾根静脉血采集，将采集的血液样品3500r/min离心15min，将血清用1.5ml离心管分装，置于-20℃冰箱临时保存，然后送检分析。检测指标包括总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GKOB)、白球比(A/G)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)。

检测结果如表2所示。肉牛血清总蛋白含量提高了10.29％，血清球蛋白含量提高了22.53％。表明褐藻寡糖能够提高肉牛的营养水平，促进肉牛机体的蛋白代谢水平；血清尿素氮的含量降低，表明褐藻寡糖可以提高机体对蛋白质的利用率，减少对饲粮蛋白的浪费；血清碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶的含量增加，但对谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平没有影响，表明褐藻寡糖对肉牛的脏器机能均负面影响。血清总胆固醇和甘油三酯含量无明显差异，表明褐藻寡糖对肉牛的脂质代谢、营养摄入以及心血管状况没有产生负面影响。

表2褐藻寡糖对肉牛血清生化指标的影响

3)抗氧化及免疫指标测定与分析

血清总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量的测定采用商业试剂盒进行，具体操作按照商品说明书进行。

检测结果如表3所示。抗氧化指标方面，血清总超氧化物歧化酶的含量明显增高，增幅达到17.19％，表明褐藻寡糖能够显著提高肉牛机体的抗氧化性能；免疫指标方面，肉牛血清免疫球蛋白G、免疫球蛋白A和免疫球蛋白M的含量均有不同程度的增加，其中免疫球蛋白G的含量增加最为明显，表明肉牛的免疫力得到了有效的提高。

表3褐藻寡糖对肉牛抗氧化及免疫指标的影响

4)健康评分

正式试验期内每隔3d对晨饲前肉牛进行一次健康评分，评分标准见表4。

表4健康评分标准表

试验结果见表5，褐藻寡糖对眼睛分泌物、鼻腔分泌物、耳朵评分、咳嗽评分和粪便评分等指标均有减少趋势，特别是显著减少了肉牛的眼睛分泌物，表明褐藻寡糖对肉牛的健康状况起到促进作用。

表5褐藻寡糖对肉牛健康评分的影响

5)褐藻寡糖对肉牛瘤胃参数及瘤胃细菌区系的影响

在正式试验的最后1天，从各试验组随机挑选5头肉牛进行晨饲前瘤胃液抽取，将刚抽取的瘤胃液弃掉，随后抽取50ml分装于3个15ml离心管中，立马置于液氮中临时保存。之后对采集的样液分别进行瘤胃液pH、氨态氮、挥发性脂肪酸含量测定以及瘤胃细菌区系的测定和菌群多样性分析。

5.1褐藻寡糖对肉牛瘤胃pH值、氨态氮及VFA(挥发性脂肪酸)含量的影响

由表6可知，两组试验牛的瘤胃液pH值在正常范围内波动，表明日粮中添加褐藻寡糖不会影响肉牛瘤胃微生物的正常代谢；瘤胃液中的氨态氮含量提高，表明褐藻寡糖能够提高瘤胃对日粮蛋白质的消化速度，从而使肉牛瘤胃中氨态氮的含量显著升高；褐藻寡糖均提高了瘤胃中乙酸和丙酸的含量，表明促进了日粮碳水化合物在瘤胃中的降解。

表6褐藻寡糖对肉牛瘤胃pH值、氨态氮及VFA的影响

5.2褐藻寡糖对肉牛瘤胃细菌门水平的影响

由表7可知，日粮中添加褐藻寡糖提高了瘤胃拟杆菌门Bacteroidetes的相对丰度，拟杆菌数量的增多，预示着反刍动物拥有更加健康的瘤胃内环境，从而具有更强的抗病、抗应激能力；螺旋体门Spirochaetae的相对丰度显著提高，说明褐藻寡糖有利于肉牛对纤维类物质的消化吸收。

表7褐藻寡糖对肉牛瘤胃细菌门水平的影响(相对丰度％)

5.3褐藻寡糖对肉牛瘤胃细菌科水平的影响

普雷沃氏菌科Prevotellaceae是拟杆菌门的主要细菌，在反刍动物瘤胃中主要负责蛋白质和碳水化合物的降解。由表8可看出，普雷沃氏菌科Prevotellaceae的相对丰度提高。表明褐藻寡糖可以提高肉牛对蛋白质和半纤维素类物质的消化吸收，提高育肥效果；此外，褐藻寡糖还显著提高了瘤胃球菌科Ruminococcaceae和拟杆菌目BS11菌群Bacteroidales_BS11_gut_group的相对丰度，提高了肉牛对纤维素的消化吸收。

表8褐藻寡糖对肉牛瘤胃细菌科水平的影响(相对丰度％)

5.4褐藻寡糖对肉牛瘤胃细菌属水平上的影响

如表9所示，褐藻寡糖提高了普雷沃菌科UGG-003菌属Prevotellaceae_UCG-003和普雷沃菌科UCG-001菌属Prevotellaceae_UCG-001相对丰度，有可能会促进肉牛对复杂多糖的利用。

表9褐藻寡糖对肉牛瘤胃细菌属水平上的影响(相对丰度％)

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综上，本发明提供的一种特定聚合度为3的均一褐藻寡糖制品，制备方法简单、原料利用效率高、产物专一性强，以相对廉价易得的海藻酸钠为原料时，制备得到的褐藻三糖含量达到75％以上，可用于农业、畜牧业以及水产养殖等生产领域。特别是做为饲料添加剂拌入肉牛日常饲料进行饲喂，可有效促进肉牛的生长性能和改善健康状况，具有使用方便、添加量少、无副作用、增效明显等优点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。