艾叶挥发油作为TRPA1通路抑制剂在抗炎止痒药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药技术领域，具体为艾叶挥发油作为TRPA1通路抑制剂在抗炎止痒药物中的应用。

背景技术

近年来，随着工业发展带来的新型环境污染，空气污染PM2.5的问题加剧，加之生活方式的影响，尘螨、花粉、宠物毛发、食品添加剂等诱发免疫过敏反应的各种过敏原的机率越来越高，如特异性皮炎/湿疹、过敏性哮喘、过敏性鼻炎、过敏性皮炎、敏感皮肤等过敏性问题发生率随之增高，引起了各方关注。

艾叶为菊科植物艾Artemisia argyi Levl.et Vant.的干燥叶，具有温经止血、散寒止痛、外用祛湿止痒等功效。研究发现艾叶主要含有挥发油、黄酮、有机酸和三萜类等化学成分，具有杀菌，抗炎，镇痛，抗氧化，抗肿瘤等药理作用。艾叶挥发油是艾叶的主要活性成分，具有平喘、祛痰、镇咳、抗菌、抗过敏等药理作用。现代研究也证明艾叶挥发油具有抗炎的作用，在如急性耳肿、足水肿以及关节炎等多种不同的炎症疾病中都可以降低IL-1β、TNF-α等炎性因子的表达。

变应性接触性皮炎是由过敏原特异性T细胞介导的IV型或迟发型超敏反应主要分为两个阶段。当人第一次接触过敏原时，第一阶段是致敏。过敏原是半抗原，被定义为低分子量的抗原，当与较大的载体结合时，可以引发免疫反应。最初，半抗原被朗格汉斯细胞或真皮树突状细胞吞噬，半抗原肽复合物迁移到皮肤的局部淋巴结，在那里它们引发在血液中增殖和循环的半抗原特异性T细胞Thl，Th2，Th17和T调节细胞，专门识别变应原的主要T细胞相容性复合物分子复合物的幼稚T细胞会扩增并成效应T细胞和记忆T细胞。下一阶段是激发，重新暴露于变应原导致被现在敏感的半抗原特异性T细胞识别，引起细胞因子和细胞浸润的炎性级联反应从而产生慢性过敏性接触性皮炎(ACD)的临床症状。

瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1)离子通道是瞬间受体电位离子通道大家族的一员，是介导疼痛信号传导的重要分子，选择性的抑制TRPA1，对炎性痛、内脏痛、神经痛等具有抑制作用。现已研发出TRPA1高特异性的拮抗剂，其药理作用也在炎性痛、内脏痛、神经痛等动物模型验证，但是TRPA1拮抗剂作用于过敏性接触性皮炎动物模型的研究还鲜有报道。

方酸二正丁酯(SADBE)模型是一种小分子半抗原，通常用于治疗斑秃，现已在小鼠中用作流行的ACD诱导剂，近年来，许多研究探究了SADBE引起的慢性瘙痒的神经免疫机理。表达TRPV4的上皮和皮肤中的免疫细胞中的瞬时受体电位(TRP)通道，表达TRPV1和TRPA1的感觉神经元或TRPV4是SADBE诱发的慢性瘙痒的分子和细胞基础。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供艾叶挥发油作为TRPA1通路抑制剂在制备抗炎止痒药物中的应用。

进一步，艾叶挥发油在制备治疗过敏性接触性皮炎药物中的应用。

进一步，所述过敏性接触性皮炎是由方酸二丁酯诱导的。

进一步，所述药物是通过下调MAPK和JAK/STAT3信号通路实现抗炎效果的。

进一步，所述药物是通过抑制细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-33和IL-4的表达实现抗炎效果的。

进一步，所述药物是通过抑制p-p38、p-ERK1/2和p-STAT3蛋白表达实现抗炎效果的。

进一步，所述药物是通过减轻自发性抓挠、表皮增厚和炎性细胞浸润，从而实现止痒效果。

进一步，所述艾叶挥发油的制备方法：以艾叶为原料，以水作为溶剂，采用索氏提取法制备，从提取器收集挥发油，经干燥即得。

进一步，所述艾叶为蕲艾。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

(1)本发明所提供的艾叶挥发油具有抗炎止痒的用途，能够显著减轻ACD小鼠的自发性抓挠、表皮增厚和炎性细胞浸润。

(2)本发明所提供的艾叶挥发油，可下调MAPK和JAK/STAT3信号通路，抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-33和IL-4炎症性细胞因子的表达水平，抑制p-p38、p-ERK1/2和p-STAT3蛋白表达，进而起到抗炎止痒疗效。在SADBE诱导的小鼠过敏性接触性皮炎瘙痒模型上，验证了该艾叶挥发油的抗炎止痒效果。

附图说明

图1中，A表示六种主要成分混合对照品的GC-MS图谱，B为蕲艾挥发油样品的GC-MS图谱。

图2为全细胞膜片钳检测图。

图3为钙成像检测图。A为野生型小鼠DRG成像检测图，B为TRPA1敲除鼠DRG成像检测图。

图4中，A为SADBE造模模式图，B为蕲艾挥发油对ACD模型中小鼠挠痒次数的影响。

图5为蕲艾挥发油对ACD小鼠皮肤病理变化的影响图，A为皮肤组织的H&E染色，B为皮肤组织的甲苯胺蓝染色，C为H&E染色的统计结果，D为甲苯胺蓝染色统计结果。

图6为蕲艾挥发油对ACD小鼠皮肤组织中炎性因子mRNA表达水平。

图7为蕲艾挥发油对ACD小鼠皮肤组织中ERK1/2、p38与STAT3的磷酸化水平。A为蛋白图，B、C、D分别为p-ERK1/2、p-p38与p-STAT3统计结果。

图3-6中所有数据均表示为平均值±SEM。使用Graph Pad Prism 6软件进行统计分析和绘图，使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行数据比较，p<0.05被认为具有统计学意义.与正常组比较，

具体实施方式

为便于本领域技术人员理解本发明内容，下面申请人结合具体实施例进一步描述本发明的技术方案，但以下内容不应以任何形式限制本发明权利要求书请求保护的范围。

实施例1.蕲艾挥发油的提取

称取湖北省蕲春县自然干燥的艾叶200g，适当粉碎处理后，置于5000mL圆底烧瓶中，加入2400mL水浸泡2h，开火煮沸后调中火保持微沸，6h后停止加热，静置片刻，从索式提取器收集挥发油，然后经无水硫酸钠干燥，得到蕲艾挥发油1.5256g。

实施例2.蕲艾挥发油含量测定

2.1对照品溶液的配制

精密量取桉油精127.90mg、(-)-α-侧柏酮112.00mg、(+)-樟脑110.30mg、(+)-冰片108.80mg、4-松油醇143.30mg、β-丁香烯115.00mg分别加至5mL容量瓶中，用色谱纯甲醇定容至刻度，制成储备液。取桉油精储备液1.00mL、(-)-α-侧柏酮储备液1.00mL、(+)-樟脑储备液1.00mL、(+)-冰片储备液0.50mL、4-松油醇储备液0.25mL、β-丁香烯储备液0.25mL，于5mL容量瓶用甲醇(色谱纯)定容(混标1)，将混标1再分别用甲醇稀释至2倍、10倍、20倍、和100倍。

2.2GC-MS的分析条件

色谱柱：DB-5(30m×0.32mm×0.25μm)，进样口：280℃(分流比5：1)，柱温箱：60℃保持1分钟，以10℃/min升温至250℃保持1min，检测器：FID280℃，载气为：高纯氦气，流速为：1.0mL/min。

2.3质谱(MS)实验条件：

能量源为：EI源，电子能量70ev，温度为250℃。

根据GC-MS结果，发现蕲艾挥发油中丁香烯、松油醇、侧柏酮、桉油精、樟脑和冰片的含量较高。GC-MS谱图如图1。其中主要六种成分含量如表1。

表1蕲艾挥发油主要成分GC-MS分析结果

实施例3.全细胞膜片钳

本发明使用全细胞膜片钳检测了蕲艾挥发油(简称为QA)对瞬时转染hTRPA1的HEK293T细胞的作用。将铺在盖玻片上的HEK239T细胞转移到具有细胞外液的玻璃皿中，在室温下，使用EPC 10(HEK Elektronik)放大器和配有GFP可视化滤光片的倒置显微镜台上进行全细胞膜片钳记录。使用电阻为2-4兆欧的含有140mMCsCl，10mMEGTA,10mM hepes,2mMMg-ATP(pH 7.3和315mOsm/lin渗透压)溶液的硅酸盐玻璃移液器，同时使用含有140mMNaCl，5mM KCl，2mM MgCl

结果如图2所示，80μg/ml的实施例1制备的蕲艾挥发油(挥发油先用DMSO配成母液，使用时用细胞外液稀释到所需浓度)和hTRPA1激动剂(30μM的AITC)共同给药几乎没有引起hTRPA1通道电流的变化，在缓冲液(细胞外液)冲洗之后，再次单独给予30μM AITC仍能够激活hTRPA1通道。该结果表明蕲艾挥发油对hTRPA1通道具有显著的抑制作用。

实施例4.钙成像

DRG神经元被种植在涂层玻片上。12小时后，将其置于含有4μM Fura-2AM(中国上海)和0.01％F-127的无Ca

结果如图3A所示，低、高剂量(40、80μg/ml)QA均可显著抑制10μM AITC刺激诱导的[Ca

实施例5.行为学实验

5.1蕲艾擦剂的配制

分别配制低、中、高剂量浓度为：15％(15μL/100μL)、30％(30μL/100μL)、60％(60μL/100μL)的蕲艾挥发油擦剂。步骤为：精密量取150μL、300μL、600μL的实施例1制备的蕲艾挥发油(每100μL蕲艾挥发油重量为93.25mg)，然后分别加入丙二醇定容至1mL，涡旋混匀并低速短离心，现配现用。

5.2实验方法

适龄C57BL/6小鼠在SPF级实验室适应性饲养一周后，采用丙酮-方酸二正丁酯(SADBE)造模建立小鼠ACD模型。具体步骤是：造模开始前三天将小鼠腹部及颈部的毛剃掉，区域范围为1.5cm×1.5cm。第四天开始造模，将SADBE和丙酮(1：200)混合液按照20μL/只的剂量均匀涂于其腹部剃毛区域，等待30s左右使其充分吸收；每日一次(早9点)连续处理3天。造模开始后第4天至第8天休息，将小鼠每日早9点置于行为学观察盒中适应1.5h左右，造模第9天至第11天每日早9点将SADBE和丙酮(1：200)混合液按照20μL/只的剂量均匀涂于其颈部剃毛区域，等待30s左右使其充分吸收。造模第11天造模结束0.5h后，所有小鼠均录像约1.5h，记录行为学数据，完成行为学数据统计后，将造模成功的小鼠随机分为6笼：正常组(NC，8只)、模型组(SADBE，8只)、低剂量组(QA-L，8只)、中剂量组(QA-M，8只)、高剂量组(QA-H，8只)、阳性药组(HC，8只)。造模第12天至15天每日早9点给药组开始给予药物溶液，按照100μL/只将药物溶液均匀涂抹于小鼠颈部剃毛位置，等待1min利于其吸收，于给药后0.5h，录像约1.5h，记录行为学数据。

结果如图4B所示，与空白组相比，经SADBE诱导的ACD小鼠在第12天到15天的抓挠次数明显增加。在使用实施例1制备的蕲艾挥发油治疗后的ACD小鼠中，抓挠次数呈下降的趋势，统计学上出现明显的差异。行为学的结果表明蕲艾挥发油能够抑制SADBE引起的瘙痒。

实施例6.H&E染色和甲苯胺蓝染色

将小鼠颈部皮肤组织剪取约1cm x1.5 cm大小，固定在4％多聚甲醛中12小时后用20％和25％的糖溶液梯度脱水，石蜡包埋切片后脱蜡，依次将切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各10min，再加入无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ中各5min，乙醇梯度浸泡，95v/v％、90v/v％、80v/v％、70v/v％每个浓度浸泡5min，最后用蒸馏水洗。再将切片于苏木素中染色5min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗。再将切片分别浸入伊红染液和甲苯胺蓝浸染(甲苯胺蓝染液1:100)中染色2min。再将切片依次放入95％酒精Ⅰ和95％酒精Ⅱ中各5min，无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ中各5min，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各5min，脱水透明，最后将切片从二甲苯中拿出稍晾干，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析(图5A和5B)。每个切片随机拍5-8个不同视野，然后在每个视野里测量5-8个不同位置的皮肤厚度和肥大细胞数量以求取平均值，最后统计每只小鼠的皮肤厚度的平均值作为统计结果。

结果统计如图5C和5D所示。与空白对照组相比，SADBE模型组的颈部皮肤表现出明显的表皮增生。与模型组相比，蕲艾挥发油和丁酸氢化可的松乳膏治疗组(HC组)的皮肤厚度降低明显且相关炎性细胞浸润减少。SADBE模型组的肥大细胞平均数比空白对照组明显增加，而给予蕲艾挥发油和丁酸氢化可的松乳膏(HC)干预后，肥大细胞数目显著减少。

实施例7.实施例1制备的蕲艾挥发油对皮肤组织炎性因子的影响

已分离出来的小鼠颈部皮肤组织置于2mL离心管中，每管加入1ml的Trizol试剂、两个3mm锆珠，放入匀浆底座，65Hz迅速匀浆90s，充分研磨组织。将裂解液在4℃条件下，12000rpm离心5min。小心吸取上清转移至新的1.5mL离心管中，向裂解液中加入1/5体积的氯仿。盖紧管盖，涡旋15s。震荡成乳浊液，静置5min。将乳浊液在4℃条件下12000rpm离心15min。小心取出离心管，小心吸取上层水相到新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。然后在4℃条件下，12000rpm离心10min。小心吸取弃除上清液，加入1mL用DEPC水和无水乙醇配置的75v/v％乙醇，充分洗涤管盖和管壁，并轻弹管底让沉淀悬浮，静置5min。4℃条件下7500rpm离心5min，弃上清，在洁净的环境中室温敞口干燥沉淀5min后，加入30μL无RNA酶的水溶解沉淀，涡旋15s后用超微量检测板检测每个样品的mRNA浓度。采用反转录试剂盒，按照说明书，将所提RNA反转成cDNA后进行实时荧光定量PCR(q-PCR)，按照使用说明书进行标准操作。结果以β-Actin作为参照基因进行标准化，引物序列见表2。

表2检测细胞因子基因引物序列

本发明检测了小鼠颈部皮肤中TRPA1的mRNA表达水平。结果发现，TRPA1的mRNA水平在SADBE组较NC组显著升高。蕲艾挥发油与丁酸氢化可的松乳膏施用后显著下降。另外，本发明还检测的小鼠颈部皮肤中相关炎症介质(TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-33和IL-4)的mRNA表达水平。结果如图6所示，与NC组比较，SADBE组小鼠皮肤中上述炎症介质的mRNA水平均表达升高。在局部治疗施用蕲艾挥发油和丁酸氢化可的松乳膏后，显著逆转了小鼠皮肤中的上述炎症因子mRNA水平的升高。这些结果表明蕲艾挥发油能够显著降低ACD小鼠皮肤中与瘙痒相关TRPA1通道mRNA表达水平，并改善ACD疾病的免疫细胞聚集，表明蕲艾挥发油可以通过抑制炎症介质的产生而发挥抗炎作用。

实施例8.Western blot

按照配胶试剂盒说明书中的配方配制SDS-PAGE凝胶。下层胶配胶完成后室温放置1h使其凝固再配置上层胶。上层胶入制胶板中，插上梳子，胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入电泳液盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。开始上样，样品的两边点Marker，多余的孔加蛋白上样缓冲液(1×)。电泳时，上层浓缩胶的电压为恒压80V，时间为1h左右。当Marker的彩色条带开始出现分离时，说明到了分离胶层，此时将电压调整为100V，待最下层的蓝色条带到达玻璃板底部时停止电泳。PVDF膜使用前用甲醇浸泡5min，然后在20V电压下用转膜仪进行半干转20min，转膜结束以后将PVDF膜放在TBST中漂洗5min，然后用6％的BSA溶液封闭一小时。封闭完成以后，根据目的蛋白分子量的大小，在合适的膜的位置剪下相关目的条带，敷一抗，4℃过夜。使用的一抗包括抗β-TubuLin、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38、p38、STAT3、p-STAT3。第二天，首先回收一抗，然后在摇床上用TBST洗膜五次，每次7min，在洗膜间隙配二抗。二抗分为鼠抗和兔抗，β-TubuLin敷鼠抗(1:10000)，其他的目的条带敷兔抗(1:20000)。在室温下将膜在二抗中孵育60min。二抗敷育完后，用TBST洗膜5次，每次7min。最后使用ECL显影液使蛋白条带可视化，在化学发光仪下检测蛋白丰度，并使用成像系统进行灰度值半定量分析。

通过Western Blot对这一问题进行了探究。结果如图7所示，与NC组相比，SADBE组小鼠皮肤中的p-ERK1/2、p-p38和p-STAT3的水平显著上升。施用蕲艾挥发油和丁酸氢化可的松乳膏后小鼠皮肤中的ERK1/2、p38和STAT3的磷酸化水平明显下降。表明蕲艾挥发油可以通过抑制MAPK和JAK/STAT3中ERK1/2、p38和STAT3等关键酶的活化而发挥抗炎作用，减弱ACD小鼠的炎症反应。

结论

综上所述，本发明提供的蕲艾挥发油具有抗炎止痒的作用。能够抑制AITC激活的hTRPA1电流和显著抑制鼠神经元上的TRPA1通道，且在TRPA1基因被消融后该作用消失。局部涂抹外用可以减轻ACD小鼠的自发性抓挠、表皮增厚和炎性细胞浸润。同时它还抑制皮肤中TRPA1的mRNA表达；并减少皮肤中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-33和IL-4等促炎细胞因子的产生。此外，蕲艾挥发油处理还可以减弱ACD小鼠中ERK1/2、p38和STAT3的磷酸化蛋白表达水平。通过抑制皮肤中炎症因子的增加，MAPK和JAK/STAT3炎症通路的激活发挥抗炎止痒作用。