控制水稻粒型蛋白OsPUB3及其在水稻粒型改良中的应用

一、技术领域

本发明属于水稻粒型改良的育种领域，涉及控制水稻粒型基因的克隆以及育种应用。

二、背景技术

水稻粒型对水稻产量以及稻米品质均具有重要影响。水稻粒型由谷粒长度、宽度和厚度决定。粒长和粒宽还是决定市场价值的重要指标。挖掘控制水稻粒型的基因是进行水稻品种粒型改良的基础。目前，从水稻自然变异群体已克隆25个控制粒型的数量性状座位(QTL)，它们分布在除第4、11和12染色体外的其余9条染色体上。大部分已克隆粒型基因的有利等位基因均都在现代改良品种中检测到，说明这些基因已广泛应用于育种实践，对水稻粒型改良起了重要作用。

应用分子标记辅助选择技术可准确将控制目标性状的基因导入水稻品种，该技术在水稻抗病、抗虫、耐逆等性状改良中取得显著成效。随着分子生物学技术不断发展，基因编辑技术迈入传统的水稻遗传育种，特别是CRSPR/Cas9技术成功应用于水稻后，为水稻定向改良育种提供了更快捷的方法，已在水稻香味、镉低积累以及抗除草剂等改良育种中发挥了重要作用，获得了许多重要的水稻新种质。

专利权人从珍汕97B和密阳46衍生群体中克隆了控制水稻粒型的基因OsPUB3。借助CRSPR/Cas9基因编辑技术将三系恢复系中恢161中的OsPUB3等位基因敲除，获得粒型明显改变的新种质，为水稻粒型改良提供新的基因资源。

三、发明内容

本发明提供了一个控制水稻粒型的蛋白OsPUB3，下述编码OsPUB3蛋白的氨基酸序列来自克隆该基因所用遗传群体的母本珍汕97B和父本密阳46。

SEQ ID NO：1所示的是来源于珍汕97B的编码OsPUB3蛋白的氨基酸序列；

SEQ ID NO：2所示的是来源于密阳46的编码OsPUB3蛋白的氨基酸序列。

此外，提供一种应用该基因进行水稻粒型改良的方法：借助CRSPR/Cas9基因编辑系统敲除三系恢复系中恢161的OsPUB3等位基因，获得千粒重和粒宽都降低的水稻新种质。

本发明采用以下技术方案：

应用图位克隆的方法在珍汕97B和密阳46衍生的高代回交群体中克隆了控制水稻粒型的基因OsPUB3。

针对OsPUB3的基因组序列，借助CRISPR-GE工具(http://skl.scau.edu.cn/home/)设计CRSPR/Cas9基因编辑系统的敲除靶序列，连入敲除载体，以三系恢复系中恢161为受体，进行转基因遗传转化。

通过对转基因植株的序列分析和表型鉴定，获得粒型改变的水稻新种质。

四、附图说明

图1中恢161与中恢161-Cri的粒长差异

图2中恢161与中恢161-Cri的粒宽差异

五、具体实施方式

实施例1：水稻粒型基因OsPUB3的克隆

1.OsPUB3的精细定位

应用珍汕97B和密阳46衍生的高代回交群体精细定位到1个控制水稻粒型的QTL，在其所在的57.7-kb区间内，注释基因OsPUB3编码E3泛素连接酶为最有可能的目标基因。

2.敲除载体构建和遗传转化

针对OsPUB3的基因组序列，借助CRISPR-GE在线工具，设计敲除靶点Cri-PUB3，其序列为5'-CGTCCGACGGGGAGCTGCTC-3'。从百格基因科技有限公司购买敲除载体BGK03，按照说明书构建完成OsPUB3的敲除表达载体BGK03-PUB3，以OsPUB3座位上为密阳46等位基因的近等基因系为转基因受体进行遗传转化。

3.敲除转基因植株的序列变异分析

应用标记Seq-PUB3(上游引物序列5'-GCCTCGAGATGGACGCGAAC-3'，下游引物序列5'-TCTGGCTCTTCGTCGGT-3')扩增转基因植株的靶区间序列，通过测序分析敲除转基因植株的序列变异，共获得3个独立来源的双等位突变敲除植株，分别命名为KO1，KO2和KO3。具体变异情况如下：

密阳46等位基因： CGTCCGACGGGGAGCTG CTC

KO1-1等位基因：CGTCCGACGGGGAGCTGaCTC +1bp

KO1-2等位基因：CGTCCGACGGGGAGCT-CTC-1bp

KO2-1等位基因：CGTCCGACGGGGAGCTGaCTC +1bp

KO2-2等位基因：CGTCCGACGGGGAGCT-CTC-1bp

KO3-1等位基因：CGTCCGACGGGGAGCTGaCTC +1bp

KO3-2等位基因：CGTCCGACGGGGAGCTGtCTC +1bp

4.敲除转基因植株的千粒重、粒长和粒宽鉴定

将敲除转基因T

表1：千粒重、粒长和粒宽在转基因敲除植株和受体间的差异

*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001

实施例2：应用CRSPR/Cas9基因编辑系统敲除OsPUB3获得新种质

1.OsPUB3敲除转基因苗获得

将实施例1中的敲除表达载体BGK03-PUB3导入三系恢复系中恢161中，获得转基因幼苗。提取幼苗叶片DNA，经潮霉素抗性标记检测筛选转基因阳性植株，然后，应用标记Seq-PUB3扩增敲除转基因植株的靶区间序列，测序分析获得1个转基因敲除纯合突变植株，命名为中恢161-Cri，自交加代。该转基因植株的序列变异情况：

中恢161等位基因 CGTCCGACGGGGAGCTG CTC

中恢161-Cri等位基因 CGTCCGACGGGGAGCTGaCTC +1bp

2.千粒重、粒长和粒宽的变异分析

将中恢161-Cri和中恢161种植于中国水稻研究所转基因基地，设3个重复，每重复种植36株，成熟后混收5株，自然晾干后考查千粒重、粒长和粒宽。通过T测验分析中恢161和中恢161-Cri之间的差异。如下表所示：中恢161-Cri的千粒重、粒长和粒宽都显著减小，粒型明显变小。

表2千粒重、粒长和粒宽在中恢161和中恢161-Cri之间的差异

*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001