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一套用于筛选高抗炎活性β葡聚糖的生物标志物及其应用

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，特别涉及一套用于筛选高抗炎活性β葡聚糖的生物标志物及其应用。

背景技术

β葡聚糖是一种在植物和微生物中大量存在的非淀粉多糖，最常见的是谷物β葡聚糖、酵母β葡聚糖和食用真菌β葡聚糖。β葡聚糖主要由β1,3、β1,4、β1,6等糖苷键组成。与其他非淀粉多糖一样，β葡聚糖可以完整地通过消化系统并在大肠被肠道菌群发酵，产生多种代谢物，包括次级胆汁酸、短链脂肪酸、胆碱代谢物等。而肠道微生物群及其代谢物可以影响人体生理和能量平衡以及宿主的健康和疾病状态。近期研究表明，β葡聚糖具有调节肠道菌群组成、促进肠道发育、增强机体免疫反应、抑制肿瘤、缓解炎症等生物学功能。其中炎症是各种慢性病发生发展的前奏，且所有β葡聚糖的生物活性均与缓解慢性炎症有关，但没有报道比较它们的抗炎效果，可能是缺乏快速有效的评价方法，这严重阻碍了β葡聚糖的开发和应用。

目前大多数研究β葡聚糖活性的常规方法使用相对耗时的动物或细胞模型。因此，有必要筛选出一些能够快速有效评估不同来源β葡聚糖生物活性的生物标志物。β葡聚糖会在宿主的大肠中发酵并转化为发酵代谢物，从而改变肠道菌群及代谢物的丰度。因此，可以通过测定体外厌氧发酵过程后与β葡聚糖抗炎活性显著相关的菌群和发酵代谢物的丰度，并以此作为指标来筛选高抗炎活性的β葡聚糖。

发明内容

本发明的首要目的在于克服不同来源β葡聚糖抗炎活性比较的复杂性，提供了一套用于筛选高抗炎活性β葡聚糖的生物标志物。

本发明的另一个目的在于提供通过上述用于筛选高抗炎活性β葡聚糖的生物标志物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于筛选高抗炎活性β葡聚糖的生物标志物，包括细菌生物标志物和代谢生物标志物；其中，

细菌生物标志物包括：经黏液真杆菌属(Blautia)、毛螺菌科ND3007组(Lachnospiraceae ND3007group)、小类杆菌属(Dialister)和阿加杆菌属(Agathobacter)；

代谢物生物标志物包括：乙酸、丁酸、乳酸、二羟基苯乙酸、香兰素、2,3-二羟基苯甲酸、邻苯二酚和咖啡酸。

上述用于筛选高抗炎活性β葡聚糖的生物标志物在高抗炎活性β葡聚糖筛选中的应用。

一套筛选高抗炎活性β葡聚糖的方法，优选包括如下步骤：

(1)β葡聚糖的体外发酵：将待测β葡聚糖做为唯一碳源，配制得到发酵培养基；将得到的发酵培养基除菌或灭菌后，接种粪便菌群溶液并进行体外厌氧发酵；将得到的发酵液固液分离，得到固体和液体；同时，设置对照，对照即不含β葡聚糖的发酵培养基；

(2)生物标志物测定：使用实时荧光定量PCR测定步骤(1)得到的固体中的细菌生物标志物的丰度；测定步骤(1)得到的液体中的代谢物生物标志物的浓度；其中，细菌生物标志物的总丰度为T1，乙酸、丁酸和乳酸的总浓度为T2，二羟基苯乙酸、香兰素、咖啡酸、2,3-二羟基苯甲酸和邻苯二酚的总浓度为T3；

(3)筛选评价：根据细菌生物标志物的丰度和代谢物生物标志物的含量结合如下判定标准，得到待测β葡聚糖的抗炎活性；

判定标准：

1)满足以下情况，则判定该待测β葡聚糖的抗炎效果较强：T1≥2.1*TC1，T2≥2.9*TC2和(或)T3≥1.5*TC3；

2)满足以下情况，则判定该待测β葡聚糖的抗炎效果适中：1.6*TC1≤T1＜2.1*TC1，2.1*TC2≤T2＜2.9*TC2和(或)1.3*TC3≤T3＜1.5*TC3；

3)满足以下情况，则判定该待测β葡聚糖抗炎效果较弱：1.1*TC1≤T1＜1.6*TC1，1.3*TC2≤T2＜2.1*TC2和(或)1.1*TC3≤T3＜1.3*TC3。

4)满足以下情况，则判定该待测β葡聚糖的抗炎效果不显著：1.1*TC1≤T1＜1.6*TC1，1.3*TC2≤T2＜2.1*TC2和(或)1.1*TC3≤T3＜1.3*TC3。

步骤(1)中所述的β葡聚糖的来源优选为燕麦、大麦、小麦、青稞、酵母、灵芝、灰树花和云芝中的至少一种；更优选为燕麦、大麦、青稞、酵母和灵芝中的至少一种。

步骤(1)中所述的β葡聚糖优选通过乙醇脱脂、热水浸提、淀粉酶处理、浓缩醇沉、sevage法除蛋白、透析冻干的步骤提取得到；更优选通过如下步骤制备得到：

1)使用浓度为70～90％(v/v)的乙醇溶液浸泡原料脱脂并干燥；

2)按1g脱脂干燥后的原料：15～25mL水的比例将脱脂干燥后的原料和水混合，在70～90℃浸提，得到浸提液；

3)然后在浸提液中加入α-高温淀粉酶，在70～90℃下反应30～90min，将得到的酶解液浓缩；

4)将步骤3)得到的浓缩液用无水乙醇2～6℃过夜醇沉，收集沉淀，加水重新溶解沉淀；

5)用sevage法对步骤(4)得到的沉淀进行除蛋白，浓缩上清液，将得到的浓缩液进行透析和真空冷冻干燥，得到β葡聚糖。

步骤1)中所述的乙醇溶液的用量为能浸没原料为基准；更优选按料液比1g：3～5mL计算；最优选按料液比1g：4mL计算。

步骤1)中所述的乙醇溶液的浓度优选为80％(v/v)。

步骤1)中所述的浸泡的时间为12h以上；更优选为20～28h；最优选为24h。

步骤2)中所述的比例优选为1g：20mL。

步骤2)中所述的水优选为去离子水或超纯水。

步骤2)中所述的浸提的温度优选为80℃。

步骤2)中所述的浸提的次数优选为至少2次，每次浸提2h，每次浸提后将水溶液用四层纱布过滤，得到的滤渣用于下一轮加水浸提；合并滤液，即为浸提液。

步骤3)中所述的反应的条件优选为在80℃下反应60min。

步骤3)中所述的浓缩的方式优选为旋转蒸发。

步骤3)中所述的浓缩的程度优选为浓缩至原溶液体积的1/3。

步骤3)中所述的α-高温淀粉酶的用量优选为在浸提液中的浓度为0.3～1％(w/w)；更优选为0.5％(w/w)。

步骤4)中所述的无水乙醇的体积用量优选为相当于浓缩液体积的3～5倍；更优选为相当于浓缩液体积的4倍。

步骤5)中所述的除蛋白的次数优选为3次。

步骤5)中所述的浓缩的方式优选为旋转蒸发。

步骤(1)中所述的发酵培养基的组成优选如下：β葡聚糖10mg/mL、酵母提取物2.0mg/mL、蛋白胨2.0mg/mL、胆汁盐0.5mg/mL、血红素0.02mg/mL、L半胱氨酸0.5mg/mL、碳酸氢钠2.0mg/mL、氯化钠0.1mg/mL、六水合氯化钙0.01mg/mL、七水合硫酸镁0.01mg/mL、磷酸氢二钾0.04mg/mL、磷酸二氢钾0.04mg/mL、维生素K

所述的pH值优选为7.2。

步骤(1)中所述的灭菌的条件优选为121℃灭菌15～30min。

步骤(1)中所述的粪便取自三名健康成年志愿者，志愿者无消化疾病或饮食限制，并在过去3个月内未服用任何抗生素，以及过去2周内未服用任何益生菌产品。

步骤(1)中所述的粪便菌群溶液制备方法为：收集的粪便样本并立即放入厌氧室，使用生理盐水按粪便：生理盐水＝1g:9mL的量和粪便样本混合均匀，然后通过四层纱布过滤，获得粪便菌群溶液。

步骤(1)中所述的粪便菌群溶液的接种量优选为体积百分比10％。

步骤(1)中所述的厌氧发酵的条件优选为36～38℃恒温、恒pH厌氧发酵7～9h；更优选为37℃恒温、恒pH厌氧发酵8h。

步骤(1)中所述的固液分离的方式优选为离心。

所述的离心的条件为：在4℃、12000×g条件下离心10min。

步骤(2)中所述的细菌生物标志物的丰度采用实时荧光定量PCR测定，优选通过如下步骤测定：

A)提取微生物群落总DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用紫外分光光度计测定DNA的浓度和纯度；

B)通过实时荧光定量PCR测定步骤(1)得到的发酵沉淀中细菌生物标志物的含量；

实时荧光定量PCR的引物为：

Blautia上游引物：5’-AGTCTGATGTGAAAGGCGGG-3’；

Blautia下游引物：5’-AGCCTCAACGTCAGTTACCG-3’；

Lachnospiraceae ND3007 group上游引物：5’-GCGTAGACGGCAATGCAAG-3’；

Lachnospiraceae ND3007 group下游引物：5’-ACGCATTTCACCGCTACACT-3’；

Dialister上游引物：5’-CTAGTGGCAAACGGGTGAGT-3’；

Dialister下游引物：5’-TCAGACGCAAACCCCTCTTC-3’；

Agathobacter上游引物：5’-GCTAAATACGTGCCAGCAGC-3’；

Agathobacter下游引物：5’-AATGCAGTACCGGGGTTGAG-3’；

338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；

806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。

步骤B)中所述的实时荧光定量PCR的体系如下：2×ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix 10μL，上游引物(10μM)0.4μL，下游引物(10μM)0.4μL，模板DNA 10ng，最后用ddH

步骤B)中所述的实时荧光定量PCR的条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s、60℃退火30s，40个循环；溶解曲线绘制条件为：95℃保持15s，60℃保持60s，95℃保持15s。

步骤(2)中所述的乙酸和所述的丁酸优选通过气相色谱法进行测定；更优选通过如下步骤测定得到：将步骤(1)得到的液体通过0.45μm膜过滤，然后将0.02mL浓度为6mol/L的盐酸溶液和0.03mL浓度为0.04mol/L的2-乙基丁酸溶液添加到0.45mL过滤的液体中；用带有氢火焰离子化检测器的GC2010 Plus系统的气相色谱仪以及DBWAX毛细管柱进行检测侧，检测条件如下：载气为N

步骤(2)中所述的乳酸优选为使用乳酸试剂盒检测，然后测定530nm处的吸光度。

步骤(2)中所述的二羟基苯乙酸、香兰素、2,3-二羟基苯甲酸、邻苯二酚、咖啡酸优选通过液相色谱法进行测定；更优选通过如下步骤测定得到：使用标准品定量，具体步骤如下：

①将步骤(1)得到的液体和提取液混合均匀，于4～5℃、35～45KHz超声提取25～35min后于18～25℃静置20～40min，然后离心，移取上清液，氮气吹干后用复溶液复溶，于4～5℃、35～45KHz超声提取3～6min，离心，收集上清液至进样小瓶中；提取液为乙腈和甲醇按体积比1：1混合得到；复溶液为乙腈和水按体积比1：1混合得到；

②色谱柱：BEH C18色谱柱，进样量：10μL，流动相A为浓度为体积百分比0.1％的甲酸水溶液，流动相B为按体积比1：1混合得到的乙腈/异丙醇溶液，其中含体积百分比0.1％的甲酸；流速为0.40mL/min，柱温为40℃；

③分离梯度：0-3min，流动相A从线性95％降至80％，流动相B从线性5％升至20％；3-9min，流动相A从线性80％降至5％，流动相B线性从20％升至95％；9-13min，流动相A线性维持5％，流动相B线性维持95％；13.01-3.1min，流动相A线性从5％升至95％，流动相B线性从95％降至5％；13.1-16min，流动相A线性维持95％，流动相B线性维持5％。

步骤①中所述提取液的用量优选按液体：提取液＝体积比1：3～5配比；更优选按液体：提取液＝体积比1：4配比。

步骤①中所述的离心的条件优选为于4℃，13000×g离心15min。

步骤①中所述的复溶液的用量优选为120μL。

步骤②中所述的BEH C18色谱柱的规格为100mm×2.1mm，孔径为1.8μm。

上述生物标志物或方法在制备抗炎制剂中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供了一组生物标记物，包括经黏液真杆菌属(Blautia)、毛螺菌科ND3007组(Lachnospiraceae ND3007 group)、小类杆菌属(Dialister)阿加杆菌属(Agathobacter)、二羟基苯乙酸、香兰素、咖啡酸、2,3二羟基苯甲酸、邻苯二酚、乙酸、丁酸和乳酸，可以用于筛选高抗炎活性的β葡聚糖，且步骤简单，易于实现，有利于降低实验和检测成本；

在本申请所述的体外厌氧发酵条件下，获得的β葡聚糖发酵细菌生物标志物和代谢物生物标志物丰度可以用于快速判断未知β葡聚糖的抗炎活性，有利于节约β葡聚糖抗炎的研究和筛选周期，促进以β葡聚糖为来源的医药、食品、饲料等产品的快速研发和推广应用。

附图说明

图1是样品组和对照组在属水平上(前30)菌群相对丰度的热图。

图2是阴离子或阳离子模式下不同样品与对照组中不同代谢物基于多维统计分析OPLS-DA模型的S图；其中，纵坐标表示主成分与代谢物的相关系数，横坐标表示主成分与代谢物的协相关系数，浅灰色的点表示这些代谢物的VIP值大于等于1。

图3是不同样品与对照组的差异代谢物火山图；其中，横坐标为代谢物在两组间表达差异的倍数变化值，即log2FC，纵坐标为代谢物表达量变化差异的统计学检验值，即-log10(p value)值。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。本发明中涉及的化学试剂均为分析纯。

酵母β葡聚糖购自上海源叶生物科技有限公司，CAS号：9041229；α高温淀粉酶自上海源叶生物科技有限公司，CAS号：9001198；小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(通用型，50X)购自上海碧云天生物技术有限公司。

所述的粪便取自三名健康成年志愿者，志愿者无消化疾病或饮食限制，并在过去3个月内未服用任何抗生素，以及过去2周内未服用任何益生菌产品。在每个实施例中均用来自这三名健康成年志愿者的粪便样品进行接种，得到的结果基本相同。

实施例1

(1)β葡聚糖的体外发酵：

按乙醇脱脂、热水浸提、淀粉酶处理、浓缩醇沉、sevage法除蛋白、透析冻干的步骤提取青稞中的青稞β葡聚糖，具体步骤如下

1)用80％(v/v)乙醇溶液浸泡青稞24h(料液比为1：4g：mL)脱脂，抽滤后将滤渣置于60℃烘箱处理1h；

2)按1g原料：20mL超纯水的比例将脱脂干燥后的青稞和超纯水混合，在80℃浸提2次，每次2h，第一次浸提后将水溶液用四层纱布过滤，得到的滤渣加水浸提，条件同第一次，合并两次滤液；

3)在滤液中加入α高温淀粉酶(终浓度为0.5％w/w)并在80℃下反应1h，随后采用旋转蒸发将水溶液浓缩至原溶液体积的1/3；

4)按浓缩液：无水乙醇＝体积比1：4的配比加入无水乙醇，4℃过夜醇沉，收集沉淀，加水(添加量与原浓缩液体积相等)重新溶解沉淀得到多糖溶液；

5)sevage法(氯仿和正丁醇按体积比4：1混合，多糖溶液和氯仿/正丁醇混合液按体积比1：4混合，每次振摇30分钟，4000rpm离心1min)除3次蛋白，用旋转蒸发仪浓缩上清液并去除残余的氯仿及正丁醇，将上清液进行透析(透析袋的截留分子量为3500Da)和真空冷冻干燥，得到β葡聚糖。

按1g青稞β葡聚糖：100mL水的配比将青稞β葡聚糖和水混合，并加入酵母提取物(终浓度为2.0mg/mL)、蛋白胨(终浓度为2.0mg/mL)、胆汁盐(终浓度为0.5mg/mL)、血红素(终浓度为0.02mg/mL)、L半胱氨酸(终浓度为0.5mg/mL)、碳酸氢钠(终浓度为2.0mg/mL)、氯化钠(终浓度为0.1mg/mL)、六水合氯化钙(终浓度为0.01mg/mL)、七水合硫酸镁(终浓度为0.01mg/mL)、磷酸氢二钾(终浓度为0.04mg/mL)、磷酸二氢钾(终浓度为0.04mg/mL)、维生素K

(2)生物标志物测定：

1)提取微生物群落总DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用Nanodrop测定DNA的浓度和纯度。

通过实时荧光定量PCR测定步骤(1)得到的发酵沉淀中细菌生物标志物的含量；

实时荧光定量PCR的引物为：

Blautia上游引物：5’-AGTCTGATGTGAAAGGCGGG-3’；

Blautia下游引物：5’-AGCCTCAACGTCAGTTACCG-3’；产物为168bp；

Lachnospiraceae ND3007 group上游引物：5’-GCGTAGACGGCAATGCAAG-3’；

Lachnospiraceae ND3007 group下游引物：5’-ACGCATTTCACCGCTACACT-3’；产物为123bp；

Dialister上游引物：5’-CTAGTGGCAAACGGGTGAGT-3’；

Dialister下游引物：5’-TCAGACGCAAACCCCTCTTC-3’；产物为165bp；

Agathobacter上游引物：5’-GCTAAATACGTGCCAGCAGC-3’；

Agathobacter下游引物：5’-AATGCAGTACCGGGGTTGAG-3’；产物为132bp；

此外采用通用引物序列对DNA样本进行扩增，用于计算特异菌群的相对丰度，包括：338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)、806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。

使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix试剂盒进行实时荧光定量PCR，实时荧光定量PCR的体系如下：2×ChamQ UniversalSYBR qPCR Master Mix 10μL，上游引物(10μM)0.4μL，下游引物(10μM)0.4μL，模板DNA10ng，最后用ddH

实时荧光定量PCR的条件为：95℃预变性30s；95℃变性10s、60℃退火30s，40个循环；溶解曲线绘制条件为：95℃保持15s，60℃保持60s，95℃保持15s。

2)用气相色谱测定步骤(1)中发酵上清液中乙酸和丁酸的含量：上清液通过0.45μm膜过滤，然后将0.02mL浓度为6mol/L的盐酸溶液和0.03mL浓度为0.04mol/L的2-乙基丁酸添加到0.45mL过滤的发酵上清液中。用带有氢火焰离子化检测器的GC2010 Plus系统的气相色谱仪(日本岛津)以及DBWAX毛细管柱(30cm×0.25mm×0.25μm，安捷伦)。检测条件如下：载气为N

3)用乳酸试剂盒测定步骤(1)中发酵上清液中乳酸的含量，用全自动酶标仪(Multiskan MK3)测定530nm处的吸光度；

4)用液相色谱测定步骤(1)中发酵上清液中其余代谢物生物标志物的含量，使用标准品定量，标准品为二羟基苯乙酸、香兰素、2,3-二羟基苯甲酸、邻苯二酚、咖啡酸，具体步骤如下：

A、取100μL发酵上清液于1.5mL离心管中，加入400μL提取液(乙腈：甲醇＝体积比1：1)涡旋混匀，低温超声(5℃，40KHz)提取30min后于20℃静置30min，然后于4℃，13000×g离心15min，移取上清液，氮气吹干后用120μL复溶液(乙腈：水＝体积比1：1)复溶，低温超声萃取5min(5℃，40KHz)，4℃、13000×g离心5min，收集上清液至进样小瓶中；

B、色谱柱：BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.8μm)，进样量：10μL，流动相A：水(含0.1％v/v甲酸)，流动相B：乙腈/异丙醇(体积比1：1，含0.1％v/v甲酸)，流速为0.40mL/min，柱温为40℃；

C、分离梯度：0-3min，流动相A从线性95％降至80％，流动相B从线性5％升至20％；3-9min，流动相A从线性80％降至5％，流动相B线性从20％升至95％；9-13min，流动相A线性维持5％，流动相B线性维持95％；13.0-13.1min，流动相A线性从5％升至95％，流动相B线性从95％降至5％；13.1-16min，流动相A线性维持95％，流动相B线性维持5％。