一种呋喃甲醛耐受酵母突变体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种呋喃甲醛耐受酵母突变体及其制备方法和应用。

背景技术

微生物工业发酵过程中会产生乙酸、呋喃甲醛和羟甲基糠醛(HMF)等抑制物。这些抑制物可改变细胞膜结构，诱导氧化应激，影响线粒体功能，破坏DNA与蛋白质的合成，极大地影响微生物细胞生长和工业发酵生产。在呋喃甲醛的胁迫下，酵母细胞的代谢过程受到强烈的抑制，生长停滞期延长，导致产物得率降低。其中呋喃甲醛作为电子受体，与乙醛进行竞争，导致乙醛积累，从而推迟乙酸和乙醇的生成，并且呋喃甲醛的存在会抑制乙醇脱氢酶(ADH)、丙酮酸脱氢酶(PDH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的活性。此外，呋喃甲醛还可以诱发酵母细胞内总活性氧(ROS)水平的大量积累，引起细胞内线粒体、空泡、肌动蛋白、染色体的损伤，从而造成细胞死亡。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在耐受终浓度乙醇、葡萄糖转化率方面具有优势，但在耐受呋喃甲醛方面优势不明显。

为了改善发酵过程中菌株耐受呋喃甲醛的能力，可以在发酵培养基中额外添加一些物质来进行改善。比如，公开号为CN110029135A的发明公开了一种提高木质纤维素水解液发酵速率的方法，所述方法包括如下步骤：1)制备木质纤维素水解液，然后向木质纤维素水解液中加入生物质炭，混匀得混合溶液，2)向混合溶液中加入发酵培养液，然后接种微生物，进行发酵，即可。该发明通过加入生物质炭来减小木质纤维素水解液中抑制物乙酸、呋喃甲醛和酚类物质对微生物发酵的抑制作用，从而提高发酵速率。

也有研究表明，对菌株中的某些基因进行突变处理，也能够起到改善发酵过程中菌株耐受呋喃甲醛的能力。比如，公开号为CN104845924A的发明公开了一株耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，该耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌含有经突变改造后的rpoD基因，该基因编码的RpoD蛋白的点突变为K219E、V522G和Q649L，该耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌能耐受浓度至少为3g/L的呋喃甲醛；该耐呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的分类命名为Zymomonas.mobilis ZM4-MF，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC：NO.10616，保藏时间为2015年3月12日。

然而，对于作为发酵使用更常用的酿酒酵母如何提高对高浓度呋喃甲醛的耐受性能，还有待进一步研究。

发明内容

本申请研究发现通过同源重组的方法定向对酿酒酵母中SIZ1基因进行突变(Genomic Sequence:NC_001136.10；NCBI Reference Sequence:NM_001180717.3)，可显著提高酿酒酵母对呋喃甲醛的耐受性。

一种呋喃甲醛耐受酵母突变体，将酵母中SIZ1基因进行突变所得，SIZ1基因突变方式对应氨基酸序列的变化为以下一种：

(1)F268A：将氨基酸序列第268位由苯丙氨酸突变为丙氨酸；

(2)D345A：将氨基酸序列第345位由天冬氨酸突变为丙氨酸；

(3)S391D：将氨基酸序列第391位由丝氨酸突变为天冬氨酸；

(4)FKS删除：将氨基酸序列第268-270位点苯丙氨酸、赖氨酸、丝氨酸删除；

(5)AAA插入：在氨基酸序列第267位氨基酸位点后插入三个丙氨酸。

优选的，野生型SIZ1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，野生型SIZ1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明又提供了所述呋喃甲醛耐受酵母突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)构建突变用质粒，所述质粒包含针对突变位点的CRISPR引导序列和同源重组模板；

(2)将步骤(1)构建的突变用质粒转化靶标酵母菌株，获得突变后的呋喃甲醛耐受酵母突变体。

优选的，基因突变对应使用的gBlock序列为：

(1)F268A gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCAAATGAATTAAGGTGCAATAATGTTCAAATCAAAGATAATATAAGAGGTGCCAAGAGTAAGCCTGGCACAGCTAAGCCGGCGGATTTAACGCCTCATCTCAAACCTTATACTCAAAGAGGTTTCAAGAGTAAGCGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

(2)D345A gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACATCCAAAAATTATTAAACAAGCCACGTTACTTTACTTGAAAAAAACACTTAGAGAAGCTGAAGAAATGGGCTTGACTACCACATCTACTATCATGAGTCTGCAATGTCCTTGAAAAAAACACTTCGGGGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

(3)S391D gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCTATATCAATTTGACATACTGGGCATTGCCACGTAGGAATTTGTAGTTGGTCGTGTAGAAACCATAATGCATCAAAACATTGCAGATGCTTACAATTTATTGATTTTGAGAATTTGTAGTTGGGAGTGTGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

(4)FKS删除gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCAAATGAATTAAGGTGCAATAATGTTCAAATCAAAGATAATATAAGAGGTAAGCCTGGCACAGCTAAGCCGGCGGATTTAACGCCTCATCTCAAACCTTATACTCAAAGAGGTTTCAAGAGTAAGCGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

(5)AAA插入gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCAAATGAATTAAGGTGCAATAATGTTCAAATCAAAGATAATATAAGAGGTGCTGCTGCTTTCAAGAGTAAGCCTGGCACAGCTAAGCCGGCGGATTTAACGCCTCATCTCAAACCTTATACTCAAAGAGGTTTCAAGAGTAAGCGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

优选的，靶标酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741。

优选的，构建突变用质粒使用的质粒骨架为酿酒酵母pCRCT质粒。

更优选的，将包含针对突变位点的CRISPR引导序列和同源重组模板的基因片段使用金门法与酿酒酵母pCRCT质粒组装在一起，生成突变用质粒。

本发明还提供了所述呋喃甲醛耐受酵母突变体在作为生物反应器中的应用。

本发明利用CHAnGE cassette，一种由CRISPR-Cas9和同源性定向修复组成的工程方法，在酵母中快速输出特定的遗传变异。通过创建基因破坏集合，构建酵母突变菌株，定向筛选对呋喃甲醛有强耐受能力的菌株。

与现有技术相比，本发明构建得到的呋喃甲醛耐受酵母突变体能够耐受高浓度呋喃甲醛，不仅为酿酒酵母工程菌株的定向改造提供了技术基础，还可为燃料乙醇发酵生产工艺提供适用菌株，推动工业生产力。

附图说明

图1为SIZ1突变位点及同源重组模板序列，其中，A：SIZ1基因F268A突变位点及同源臂重组序列信息；B：SIZ1基因D345A 突变位点及同源臂重组序列信息；C：SIZ1基因S391D突变位点及同源臂重组序列信息；D：SIZ1基因I363A突变位点及同源臂重组序列信息；E：SIZ1基因F250A和F299A突变位点及同源臂重组序列信息；F：SIZ1基因FKS删除位点及同源臂重组序列信息；G：SIZ1基因AAA插入位点及同源臂重组序列信息。

图2为SIZ1突变体和野生型菌株在10mM浓度的呋喃甲醛存在下的菌落生长情况。

具体实施方式

YPAD液体培养基组成：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L，溶剂为去离子水，pH值为5.5。

实施例1

酿酒酵母中SIZ1基因(Genomic Sequence：NC_001136.10；NCBI ReferenceSequence：NM_001180717.3)是一个编码E3 sumo蛋白连接酶的基因。野生型SIZ1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，野生型SIZ1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

包含SIZ1突变位点的CHAnGE cassette同源臂的构建：

突变体信息如表1所示。

表1

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在一个单寡核苷酸中合成了CRISPR引导序列和同源重组(HR)模板(CHAnGEcassette)。在CHAnGE cassette中引入SIZ1序列突变信息的片段为CHAnGE cassette_SIZ1DNA片段。

其中，SIZ1Δ1的gRNA+PAM编码序列为：TCACAGTACGTTCTATGGAGGGG；其他SIZ1突变位点的gRNA+PAM序列及CHAnGE cassette同源重组模板信息见图1。

CHAnGE cassette SIZ1突变位点gBlock序列为：

SIZ1Δ1的gBlock序列为：

TATCTACACGGGTCTCACCAAAACACGCTTTAAGAAAGGGTACCCCATTGAGTGCTATCACAGTACGTTCTATGTCCCACGGTGCAGCAGCAATCACCTTCCGTTATTAGGCAGTCTCCCACTCTCACAGTACGTTCTATGGAGGTTTTAGAGAGAGACCAGCGTAACTC。

SIZ1 F268A gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCAAATGAATTAAGGTGCAATAATGTTCAAATCAAAGATAATATAAGAGGTGCCAAGAGTAAGCCTGGCACAGCTAAGCCGGCGGATTTAACGCCTCATCTCAAACCTTATACTCAAAGAGGTTTCAAGAGTAAGCGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

SIZ1 D345A gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACATCCAAAAATTATTAAACAAGCCACGTTACTTTACTTGAAAAAAACACTTAGAGAAGCTGAAGAAATGGGCTTGACTACCACATCTACTATCATGAGTCTGCAATGTCCTTGAAAAAAACACTTCGGGGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

SIZ1 I363A gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACAGATGCTTACAATTTATTGATTTTGAAGGGTATTTCATTCTTGTGTACGATGCTGGACATTGCAGACTCATGATAGTAGATGTGGTAGTCAAGCCCATTTCTTTTCATTCTTGTGTACGAAATGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

SIZ1 S391D gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCTATATCAATTTGACATACTGGGCATTGCCACGTAGGAATTTGTAGTTGGTCGTGTAGAAACCATAATGCATCAAAACATTGCAGATGCTTACAATTTATTGATTTTGAGAATTTGTAGTTGGGAGTGTGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

SIZ1 F250A F299A gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCCTCTTATATTATCTTTGATTTGAACATTATTGCACCTTAATTCATTTGGAGCTGGAAATTGGATGGGTTCATTACCTCGGGATCCTAATGGATTAATCATCCCACCTTAATTCATTTGGGAAGTTTTAGAGCTATGCTGTTTTGAATGGTCCCAAAACGGAGTGATCATTTCTACAATGTACCCAAATAGCTTGTATTCCTTCGTGGTAGCTGCATATATCAGCTCCACATTGTTTTGTTGAGTATAAGGTTTGAGATGAGGCTTGTATTCCTTCGTGGTGAGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

SIZ1 FKS deletion gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCAAATGAATTAAGGTGCAATAATGTTCAAATCAAAGATAATATAAGAGGTAAGCCTGGCACAGCTAAGCCGGCGGATTTAACGCCTCATCTCAAACCTTATACTCAAAGAGGTTTCAAGAGTAAGCGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

SIZ1 AAA insertion gBlock序列为：

CTTTGGTCTCACCAAAACCAAATGAATTAAGGTGCAATAATGTTCAAATCAAAGATAATATAAGAGGTGCTGCTGCTTTCAAGAGTAAGCCTGGCACAGCTAAGCCGGCGGATTTAACGCCTCATCTCAAACCTTATACTCAAAGAGGTTTCAAGAGTAAGCGTTTTAGAGAGAGACCTTTC。

实施例2

SIZ1基因突变质粒的构建：

10ng设计好的包含SIZ1突变信息核苷酸链混合物Oligonucleotide pool)(即实施例1中的各gBlock序列，由测序公司合成)用作模板，使用引物BsaI-LIB-for和BsaI-LIB-rev进行PCR扩增，可以得到包含不同突变信息的序列。

引物DNA序列(5’-3’)

BsaI-LIB-for：TATCTACACGGGTCTCACC，

BsaI-LIB-rev：GAGTTACGCTGGTCTCTCT。

PCR循环条件为98℃ 5min；(98℃ 45s，41℃ 30s，72℃ 6s)×24个循环；72℃10min；然后保存在4℃。

使用金门法(Golden Gate assembly method)将15ng凝胶纯化的PCR产物与50ng酿酒酵母pCRCT质粒组装在一起，生成含CHAnGE cassette_SIZ1 DNA片段的质粒。进行金门组装反应(合并25次平行实验)后，使用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化所得DNA。

使用Gene Pulser Xcell电穿孔系统(Bio-Rad，Hercules，CA)将纯化的DNA转化到NEB5α电感受态细胞(New England Biolabs，Ipswich，MA)中。进行20次的平行转化，将合并的转化培养物接种到四个24.5cm×24.5cm LB平板上，并补充有100μg/mL羧苄青霉素(Corning，New York，NY)。将平板置于37℃下孵育过夜。集落形成单位的总数估计在1.2×10

实施例3

SIZ1基因突变质粒的转化：

(1)酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741的获取：挑取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741接种至20ml YPD液体培养基(10g/l酵母粉，20g/l蛋白粉，20g/l葡萄糖，80mg/l腺嘌呤半硫酸，溶剂为去离子水，pH值5.5)中，30℃、200rpm培养12-16h。吸取1ml培养液转接到25ml YPD液体培养基中，30℃、200rpm培养4-6h(OD600值为0.5)，沉淀用无菌水洗两遍，获得菌体细胞(wild type)。

(2)将质粒转化至酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741菌体：将酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4741菌体细胞约10

实施例4

呋喃甲醛耐受型酿酒酵母菌株的筛选：

将BY4741野生型和SIZ1突变型菌株从甘油储备中接种到2ml的YPAD培养基中，在30℃条件下培养，250rpm过夜，然后在新鲜的YPAD平板上划线。每个菌株做三个生物重复，接种在3ml合成完全(SC)培养基中，并在30℃培养，在250rpm振荡过夜。第二天早晨，将50μL培养物接种到3mL新鲜SC培养基中，30℃培养，250rpm振荡过夜，以同步生长阶段。24h后，将0.03OD的细胞接种于添加终浓度为5mM呋喃甲醛的3mL新鲜SC培养液(pH 4.5)中，在30℃，250rpm振荡培养，48小时后检测BY4741野生型和SIZ1突变型菌株在600nm下的OD值。

结果如图2所示，结果显示在5mM呋喃甲醛条件下的SIZ1 F268A、D345A、S391D、FKSΔ和AAA插入突变型酿酒酵母的生物量累积远远高于野生型酿酒酵母。