一种肠癌原代细胞的培养基及体外培养方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及培养基及其应用，更具体涉及一种肠癌原代细胞的培养基及培养方法和用途。

背景技术

肠癌是由遗传和环境因素作用引起的疾病，是世界范围内最常见的消化道肿瘤之一。调查数据表明(郑树等，结直肠癌的预防，中华肿瘤杂志，2004，Vol.13，No.1，pp1～2)，肠癌为最常见的肿瘤之一，且发病率和死亡率整体呈上升趋势，是当前严重威胁生命健康的恶性肿瘤。手术结合术后化疗是肠癌目前的主要治疗方式，虽然近些年来外科技术的不断进步，肠癌患者的生存率得到了提高，但是肿瘤的转移和复发仍给病人带来不良预后。在结直肠癌的精准治疗方面，靶向药物的出现为晚期结直肠癌患者带来了希望，未来的发展方向是如何合理的选择靶向药物和制定个体化治疗方案。而药敏试验技术的不断革新为靶向药物、化疗药物以及靶向药物联合的疗效预测提供了有力的技术支持，为实现肠癌患者的个体化治疗奠定坚实的基础。

现有的体外培养的肠癌细胞系主要通过将正常细胞长期培养而自发永生化或者转染促使正常细胞永生化的癌基因获得。传统方法建立的细胞系依然是细胞、分子和癌生物学研究的主要支柱。但是，这些方法改变了细胞的遗传背景，长期培养的细胞系也容易造成基因组不稳定，可能导致肿瘤细胞系的表型和体内肿瘤细胞发生人为的改变。这些细胞系中通常缺乏原发肿瘤的复杂异质性，从而限制了这些细胞系对于预测肿瘤细胞反应的应用，影响肠癌的科学研究和药物研发的准确性。另外，从肠癌组织获得的细胞培养成癌细胞的过程中，常规培养方法较难得到癌细胞，培养过程中存在被成纤维细胞干扰，形成的克隆无法传代等问题，限制了人肠癌原代细胞的应用。

2017年，Xuefeng Liu等人使用辐照的小鼠成纤维细胞和Rho相关激酶抑制剂(Y-27632)来扩增上皮来源的细胞，该体系具有无需基因操作就能实现上皮来源细胞无限增长的能力(Xuefeng Liu等，Conditional reprogramming and long-term expansion ofnormal and tumor cells from human biospecimens.Nat.Protoc.2017,12,439)。但是，Xuefeng Liu等人建立的方法的培养周期较长，不能实现细胞的快速扩增，原代细胞与基质细胞的共培养不可避免，无法解决与基质细胞共培养等培养方案所存在的一系列问题，限制了该技术的应用。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种肠癌原代细胞的培养基及体外培养方法和应用。

本发明的一个方面在于提供一种肠癌原代细胞的培养基，所述培养基包含MST1/2激酶抑制剂；胰岛素；选自Y27632、法舒地尔、和H-1152中的至少一种的Rho蛋白激酶抑制剂；胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂；谷氨酰胺添加剂；神经调节蛋白1；牛脑垂体提取物；碱性成纤维生长因子；R-spondin1；前列腺素E2；和B27。

其中，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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R

优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受的盐、或溶剂化物中的至少一种。

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最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。

在本发明的实施方式中，本发明的培养基中各成分的含量满足以下任意一项或多项或全部满足：

(1)MST1/2激酶抑制剂在培养基中的含量为1.25～5μM；

(2)胰岛素在培养基中的含量为1～9μg/mL；

(3)Rho蛋白激酶抑制剂优选为Y27632，其在培养基中的含量为1.25～20μM；

(4)胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂相对于培养基的体积比为1:400～1:100；

(5)谷氨酰胺添加剂在培养基中的含量为0.5～2mM；

(6)神经调节蛋白-1在培养基中的含量为2.5～40ng/ml；

(7)牛脑垂体提取物相对于培养基的体积比为1:2000～1:125；

(8)碱性成纤维生长因子在培养基中的含量为2.5～20ng/ml；

(9)R-spondin1在培养基中的含量为1.25～10ng/mL；

(10)前列腺素E2在培养基中的含量为5～80nM；

(11)B27相对于培养基的体积比为1:200～1:12.5。

在本发明的实施方式中，所述培养基还含有选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。

在优选的实施方式中，当抗生素选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/mL，青霉素浓度范围为25～400U/mL，当抗生素选自两性霉素B时，浓度范围为0.25～4μg/mL，当抗生素选自Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL。

根据第二个方面，本发明还提供一种肠癌原代细胞的体外培养方法。在本发明的肠癌原代细胞的体外培养方法中，使用本发明的肠癌原代细胞培养基对肠癌原代细胞进行体外培养。

本发明的肠癌原代细胞的体外培养方法包括以下步骤：

1.肠癌原代细胞的分离

(1)分离肠癌组织样本，按1:3的体积比加入基础培养基和组织消化液(注：组织消化液的加入量是1g肿瘤组织使用约5-10mL组织消化液)，置于恒温摇床中进行消化，消化温度为4～37℃，消化转速为200rpm～350rpm；

(2)消化充分直至未见明显组织块即可终止消化，消化时间为3～6小时；

(3)离心后弃去上清液，离心转速为1200～1600rpm，离心时间为2～6分钟，加入本发明的肠癌原代细胞培养基重悬备用。

其中，基础培养基配方包括选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。组织消化液配方包括1640培养基、胶原酶Ⅱ(1～2mg/mL)、胶原酶Ⅳ(1～2mg/mL)、DNA酶(50～100U/mL)、透明质酸酶(0.5～1mg/mL)、氯化钙(1～5mM)、牛血清白蛋白BSA(5～10mg/mL)。

2.使用本发明的肠癌原代细胞培养基进行培养

使用基础培养基按照50:1的体积比与基质胶(

在又一方面，本发明还提供一种评估或筛选用于治疗肠癌疾病的药物的方法，其包括以下步骤：

(1)使用本发明的肠癌原代细胞的培养方法培养肠癌原代细胞；

(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

(3)对(1)中培养得到的肠癌原代细胞添加各浓度梯度的所述药物；

(4)进行细胞活性测试。

本发明的技术方案能够取得以下技术效果：

(1)提高肠癌原代细胞培养的成功率，能够培养来源于结肠、直肠、十二指肠癌等多来样本源的肿瘤组织，成功率达到80％以上；

(2)体外培养的肠癌原代细胞能够保持病人的病理特性；

(3)所培养的肠癌原代细胞不受成纤维细胞、脂肪细胞等间质细胞的干扰；

(4)扩增效率高，可在一周左右时间内成功培养出肠癌原代细胞，扩增出的肠癌原代细胞还可以连续传代；

(5)培养成本可控，培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂等因子；

(6)培养基不含血清，并且可避免原代细胞与基质细胞的共培养，也解决了传统的含血清、与基质细胞共培养等培养方案所存在的一系列问题；

(7)所述技术培养获得的肠癌原代细胞数量大，均一化程度高，适合高通量筛选新候选化合物和为病人提供高通量药物体外敏感功能测试。

附图说明

图1为表示肠癌原代细胞培养基中不同添加因子组合对肠癌原代细胞生长的影响的图。

图2A-2K为显示肠癌原代细胞培养基的添加因子的不同浓度对肠癌原代细胞生长影响的图。

图3A-3F为利用显微镜观察使用本发明的肠癌原代细胞培养基培养得到的肠癌原代细胞的照片。

图4A-4D为原始肠癌组织细胞的免疫组化结果。

图5A-5D为使用本发明的肠癌原代细胞培养基培养原始肠癌组织细胞至第五代得到的肠癌原代细胞的免疫组化结果。

图6显示使用本发明的肠癌原代细胞培养基对肠癌原代细胞进行体外培养的细胞生长曲线。

图7显示分别使用本发明的肠癌原代细胞培养基和现有技术的文献培养基对肠癌原代细胞进行培养的增殖效率比较结果

图8A-8F显示使用本发明的肠癌原代细胞培养基培养至不同代数的肠癌原代细胞用于药物筛选的结果。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]

本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2结合并降低其活性的化合物。

1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯

2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。

2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)：在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃，接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H325.0。

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸(53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。

2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备

本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法合成，其结构及质谱数据如下表所示。

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实施例1肠癌原代细胞培养基中各添加因子对肠癌原代细胞生长的影响

(1)肠癌原代细胞培养基的配制

首先配制含有初始培养基的基础培养基。初始培养基可选自本领域常用的DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640。在本实施例中，基础培养基的配方为：DMEM/F12培养基(购自Corning公司)+100μg/mL Primocin(购自InvivoGen公司，0.2％(v/v)，市售产品浓度50mg/ml)。在基础培养基内分别加入不同种类的添加剂(参见表1)配制成含有不同添加成分的肠癌原代细胞培养基。

(2)肠癌原代细胞的分离和处理

1样品选择

肠癌实体瘤组织样品(术中/内镜)由专业医疗机构的专业医务人员从患者获取，患者均签署了知情同意书。术中样本0.25cm

2材料准备

15mL无菌离心管、移液枪、10mL移液管、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。提前30分钟从4℃冰箱取出基础培养基，提前30分钟从-20℃冰箱取出组织消化液。

组织消化液：1640培养基(Corning，10-040-CVR)、胶原酶Ⅱ(2mg/mL)、胶原酶Ⅳ(2mg/mL)、DNA酶(50U/mL)、透明质酸酶(0.75mg/mL)、氯化钙(3.3mM)、BSA(10mg/mL)。

以上提及的胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、DNA酶、和透明质酸酶均购自Sigma公司；氯化钙购自生工生物工程(上海)股份有限公司；BSA购自Biofroxx公司。

3.肠癌原代细胞的分离

3.1超净台中取组织样品于培养皿中，去除带血液的组织，用基础培养基冲洗2次，将组织转移至另一培养皿中用无菌手术刀进行机械分离，将组织块分割为1×1×1mm

3.2将切割后的术中或内镜组织吸至15mL离心管中，加入5mL基础培养基，混匀，于1500rpm离心4分钟；

3.3弃上清，按1:3比例加入基础培养基和组织消化液(注：组织消化液的加入量是1g肿瘤组织使用约10mL组织消化液)，标记样品名称及编号，用封口膜密封，在37℃下于300rpm摇床(知楚仪器ZQLY-180N)中进行消化，期间每30分钟观察消化是否完成，判断依据为无肉眼可见的颗粒物，消化时间4小时；

3.4消化完成后，经100μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的组织团块用基础培养基冲洗入离心管中以减少细胞损失，于25℃下1500rpm离心4分钟；

3.5弃上清，观察是否有血细胞，若有血细胞，加8mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解20分钟，期间颠倒混匀一次，25℃下1500rpm离心4分钟；

3.6弃上清，加入2mL基础培养基重悬细胞，备用。

4细胞计数及处理

4.1镜下观察：移取少量重悬细胞平铺于培养皿中，显微镜(CNOPTEC，BDS400)下观察癌细胞密度和形态；

4.2活细胞计数：取重悬的细胞悬液12μL，12μL台盼蓝染液(生工生物工程(上海)股份有限公司)充分混合后，取20μL加入细胞计数板(Countstar，规格：50片/盒)，细胞计数仪(Countstar，IC1000)下计算出活的大细胞(细胞粒径>10μm)百分率＝活细胞数/总细胞数×100％。

(3)肠癌原代细胞的培养

将按照上述步骤(2)从3例肠癌组织(编号为OE(O)001、OE(O)002、OE(E)003)分离得到的肠癌原代细胞用基础培养基重悬并计数。使用基础培养基按照50:1的比例与基质胶(

其中，“+”表示与基础培养基相比，加入该添加剂的培养基对从肠癌组织分离出的肠癌原代细胞中的两例有促进增殖的作用；“－”表示添加该添加剂的培养基对从肠癌组织分离出的肠癌原代细胞中的至少一例显示有抑制增殖的作用；“○”表示添加该添加剂的培养基对从肠癌组织分离出的肠癌原代细胞中的至少两例的增殖没有明显的影响。

根据以上结果，拟选A8301、胰岛素、Y-27632、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、谷氨酰胺添加剂、神经调节蛋白-1、牛脑垂体提取物、碱性成纤维生长因子、noggin、R-spondin1、化合物1、前列腺素E2、B27、Forsklin等因子进行进一步培养实验。

实施例2肠癌原代细胞培养基中不同添加因子的组合对肠癌原代细胞增殖的影响

根据表2中的成分配制不同添加因子组合的肠癌原代细胞培养基，考察不同添加因子组合对肠癌原代细胞的促增殖作用。

表2不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从肠癌组织(编号为OE(O)001、OE(O)002、OE(E)060、OE(E)071)获得肠癌原代细胞，将所获得的细胞悬液平均分成16份，1500rpm离心4分钟。离心后分别使用200μLBM和No.1～15号培养基重悬。使用基础培养基按照50:1的比例与基质胶(

48孔板中细胞长至85％以上，弃培养基，使用100μL 0.05％胰蛋白酶(购自Gibco公司)润洗1遍，吸去后再每孔加入200μL 0.05％胰蛋白酶。置于37℃、5％CO

根据图1的结果可知，与基础培养基相比，在使用上述No.1～No.15培养基时，均能够不同程度地促进肠癌原代细胞的增殖。当省略添加因子A8301(No.2)、noggin(No.12)、Forsklin(No.15)时，培养基配方的促增殖作用更为明显。因此，在使用含有胰岛素、Y-27632、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、谷氨酰胺添加剂、神经调节蛋白-1、牛脑垂体提取物、碱性成纤维生长因子、R-spondin1、化合物1、前列腺素E2、B27等添加成分的培养基培养肠癌原代细胞时，增殖效果最好。

实施例3肠癌原代细胞培养基所含添加因子的不同浓度对肠癌原代细胞的增殖作用

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从内镜组织样本(编号为OE(E)060、OE(E)078、OE(O)014、OE(O)015、OE(E)071)获得肠癌原代细胞。使用实施例2中的有效因子的组合培养基进行培养。使用基础培养基按照50:1的比例与基质胶(

所获得的肠癌原代细胞，按照活细胞密度2.4×10

配制以下11种配方的培养基进行实验。

配方1：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含胰岛素；

配方2：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含Y-27632；

配方3：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂；

配方4：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含谷氨酰胺添加剂；

配方5：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含神经调节蛋白-1；

配方6：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含牛脑垂体提取物；

配方7：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含碱性成纤维生长因子；

配方8：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含R-spondin1；

配方9：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含化合物1；

配方10：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含前列腺素E2；

配方11：上述肠癌原代细胞培养基组分中不含B27；

每孔加入20μl含1x10

在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的胰岛素每孔1mL，胰岛素的终浓度分别为1μg/mL、3μg/mL、9μg/mL、27μg/mL、81μg/mL；并使用配方1的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的Y-27632每孔1mL，Y-27632的终浓度分别为1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM；并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂每孔1mL，胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的终浓度分别为1:800(V/V)、1:400(V/V)、1:200(V/V)、1:100(V/V)、1:50(V/V)；并使用配方3的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的谷氨酰胺添加剂每孔1mL，谷氨酰胺添加剂的终浓度分别为0.5mM、1mM、2mM、4mM、8mM；并使用配方4的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的神经调节蛋白-1每孔1mL，神经调节蛋白-1的终浓度分别为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL；并使用配方5的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的牛脑垂体提取物每孔1mL，牛脑垂体提取物的终浓度分别为1:2000(V/V)、1:1000(V/V)、1:500(V/V)、1:250(V/V)、1:125(V/V)；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的碱性成纤维生长因子每孔1mL，碱性成纤维生长因子的终浓度分别为1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方8的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的R-spondin1每孔1mL，R-spondin1因子的终浓度分别为1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方9的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的化合物1每孔1mL，化合物1的终浓度分别为1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM；并使用配方9的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方10的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的前列腺素E2每孔1mL，前列腺素E2的终浓度分别为5nM、10nM、20nM、40nM、80nM；并使用配方10的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方11的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别添加配制好的B27每孔1mL，B27的终浓度分别为1:200(V/V)、1:100(V/V)、1:50(V/V)、1:25(V/V)、1:12.5(V/V)；并使用配方11的培养基设置对照孔(BC)。

待细胞扩增至48孔的85％左右消化计数，分别参比对照孔(BC)细胞数计算增殖倍数，将结果分别示于图2A～2K。图2A～2K中，比值为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一代得到的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基；比值小于1，则说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基促增殖效果弱。

根据图2A～2K的结果，胰岛素、Y-27632、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、谷氨酰胺添加剂、神经调节蛋白-1、牛脑垂体提取物、碱性成纤维生长因子、R-spondin1、化合物1、前列腺素E2、B27对肠癌原代细胞有明显的促增殖作用。根据本实施例的结果，胰岛素的含量优选为1μg/mL～9μg/mL，浓度为9μg/mL时细胞增殖效果最明显；Y-27632的含量优选为1.25μM～20μM，更优选为5μM～20μM，浓度为10μM时细胞增殖效果最明显；胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂的含量优选为1:400(V/V)～1:100(V/V)，浓度为1:200(V/V)时细胞增殖效果最明显；谷氨酰胺添加剂的含量优选为0.5mM～2mM，浓度为2mM时细胞增殖效果最明显；神经调节蛋白-1的含量优选为2.5ng/ml～40ng/ml，浓度为10ng/mL时细胞增殖效果最明显；牛脑垂体提取物含量优选为1:2000(V/V)～1:125(V/V)，更优选为1:1000(V/V)～1:250(V/V)，浓度为1:500(V/V)时细胞增殖效果最明显；碱性成纤维生长因子的含量优选为2.5ng/ml～20ng/ml，浓度为5ng/mL时细胞增殖效果最明显；R-spondin1的含量优选为1.25ng/ml～10ng/ml，更优选为1.25ng/ml～5ng/ml，浓度为2.5ng/mL时细胞增殖效果最明显；化合物1的含量优选为1.25μM～5μM，浓度为2.5μM时细胞增殖效果最明显；前列腺素E2的含量优选为5nM～80nM，更优选为20nM～80nM，浓度为40nM时细胞增殖效果最明显；B27含量优选为1:200(V/V)～1:12.5(V/V)，更优选为1:50(V/V)～1:25(V/V)，浓度为1:50(V/V)时细胞增殖效果最明显。

采用上述培养基中各添加因子的最优选浓度，作为下面实施例中使用的本发明的肠癌原代细胞培养基，其含有：基础培养基BM、9μg/mL胰岛素、10μM Y-27632、1:200胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、2mM谷氨酰胺添加剂、10ng/mL神经调节蛋白-1、1:500牛脑垂体提取物、5ng/mL碱性成纤维生长因子、2.5ng/mL R-spondin1、2.5μM化合物1、40nM前列腺素E2、1:50 B27(以下称为“CA-2”培养基)。

实施例4肠癌原代细胞的培养

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从内镜组织样本(编号为OE(E)088、OE(E)089、OE(E)099、OE(E)100、OE(E)101、OE(E)104)获得肠癌原代细胞，并使用CA-2培养基进行培养。使用基础培养基按照50:1的比例与基质胶(

使用显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)观察培养得到的肠癌原代细胞，图3A～3F是在10倍物镜下拍摄得到的照片，细胞在镜下呈紧密排列，形态略不规则。

实施例5肠癌原代细胞培养的组化鉴定

从一例结直肠癌患者的术中组织(样本编号OE(O)015)取出约0.25cm

图4A-4D和5A-5D分别是原始组织细胞和采用该细胞以本发明的肠癌原代培养基CA-2培养而获得的肠癌原代细胞的免疫组化结果对比图。图4A和图5A分别是肠癌组织和培养后的肠癌原代细胞的标记ki-67抗体的图片，图4B和图5B分别是肠癌组织和培养后的肠癌原代细胞的标记CK20抗体的图片，图4C和图5C分别是肠癌组织和培养后的肠癌原代细胞的标记CDX-2抗体的图片，图4D和图5D分别是肠癌组织和培养后的肠癌原代细胞的标记villin抗体的图片。由此可以确认，采用本发明技术培养的肠癌原代细胞培养至第5代时，肠癌原代细胞上与肠癌相关的生物标记物的表达情况与肠癌原代细胞来源的原始组织切片的标记物表达情况基本一致。说明采用本发明技术所培养的肠癌原代细胞保持了肠癌病人癌组织的原始病理特性。

实施例6肠癌原代细胞培养周期和细胞数统计及Population Doubling(PD)值计算

按照实施例1步骤(2)之3的方法从4例肠癌内镜样本(编号为OE(E)067、OE(E)071、OE(E)090、OE(E)099)获得肠癌原代细胞。所获得的肠癌原代细胞，按照活细胞密度2.4×10

图6显示采用Graphpad Prism软件绘制的、使用本发明的肠癌原代细胞培养基CA-2培养的4例原代细胞的生长曲线，横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。从图6中可以确认，本发明的培养基培养的肠癌原代细胞持续培养扩增至少80天时，细胞扩增速率基本保持不变，仍具有继续扩增的能力。

实施例7与文献培养基培养效果的比较

(1)培养基的配制

文献培养基(Seungil Kim等，Original Research，2020,Vol.25(7)744–754)，其配方为DMEM/F12+10％(v/v)胎牛血清+1％青霉素/链霉素+1％(v/v)谷氨酰胺添加剂(购自thermo)+1％(v/v)HEPES(购自Gibco)+N2 1:100(v/v)(购自Gibco)+B27 1:50(v/v)(购自Gibco)+1mM N-乙酰半胱氨酸(购自陶素生化)+50ng/mL表皮细胞长因子(购自R&D)+100ng/mL Noggin(购自R&D)+10mM烟酰胺(购自MCE)+500nM A8301(购自MCE)+10μM SB202190(购自MCE)+0.01μM前列腺素E2(购自Tocris)(以下简称为“文献”培养基)。

(2)肠癌原代细胞获取与培养

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从内镜组织样本(编号为OE(E)124)获得肠癌原代细胞。使用基础培养基按照50:1的比例与基质胶(

根据图7的结果可知，与文献培养基相比，本发明的肠癌原代细胞培养基体外培养肠癌细胞的增殖效率明显更优。

实施例8使用本发明的培养基扩增得到的肠癌原代细胞用于药物筛选和疗效评估

1、细胞培养和铺板

按照实施例1的步骤(2)之3的方法分离得到肠癌原代细胞(编号为OE(E)113)，作为一代，并使用本发明的肠癌原代细胞培养基CA-2进行培养，待细胞扩增至85％，进行传代。按照实施例1中步骤(2)之4将细胞传代计数，将细胞按照活细胞密度1×10

2、筛选药物配制

按照下表配制6个浓度梯度的6种药物(阿糖胞苷、多柔比星、硼替佐米、帕比司他、阿扎胞苷、高三尖杉酯碱；均购自MCE公司)，在384孔药板(购自赛默飞公司)每孔中添加30μL，保存待用。

表3药物作用浓度设置

3、高通量加药

取出配制好的药板，置于室温，于离心机(贝克曼)中室温1000rpm离心1分钟后取出。采用高通量自动化加样系统(Perkin Elmer公司JANUS)进行高通量加药。对培养有人肠癌原代细胞的384孔板在每孔加入0.1μL对应浓度的筛选药物。加药结束后，384孔板表面消毒后移至培养箱中，72小时后测定细胞活性。

4、细胞活性测试

4℃冰箱取出CellTiter-Glo发光试剂(购自Promega公司)，取10毫升试剂置于加样槽中。培养箱中取出待检测384孔板，每孔加入10μL CellTiter-Glo发光试剂，静置10分钟后混匀，使用多功能酶标仪(Perkin Elmer公司Envision)检测。

5、数据处理

按照公式细胞抑制率(％)＝100％-加药孔化学发光数值/对照孔化学发光数值×100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞抑制率，使用graphpad prism软件计算药物对细胞作用的半数抑制率(IC

由图8A-8F可以确认，使用本发明的肠癌原代细胞培养基CA-2培养得到的肠癌原代细胞进行药物筛选，相同药物对于培养的不同代数细胞的抑制效果基本保持一致(抑制曲线基本保持一致)。同一病人的细胞对不同药物在人体内最大血药浓度时的敏感性不同。根据结果可以判断肠癌患者在临床使用该种药物时的有效性，同时可以说明根据本发明培养方法得到不同代数的肿瘤细胞对药物的敏感性是稳定的。

工业应用性

本发明提供一种用于体外培养肠癌原代细胞的原代细胞培养基及培养方法，可将培养得到的细胞应用于药物的疗效评估和筛选。因而，本发明适于工业应用。

尽管本文对本发明作了详细说明，但本发明不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。