一种丙二酸单酰基人参皂苷提取物的制备方法及应用

技术领域

本发明属于植物提取物应用领域，涉及一种丙二酸单酰基人参皂苷提取物的制备方法及应用。

背景技术

丙二酸单酰基人参皂苷(Malonyl-ginsenosides)大量存在于鲜人参和鲜西洋参及生晒参中。具有显著的降血糖，调节脂代谢和保护神经系统等作用。Dong-Sheng Wang等人采用高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱分析法(HPLC-ESI-MS/MS)，在人参中鉴定出16种丙二酸单酰基人参皂苷，并且证明其显著降低了空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平，并改善了胰岛素抵抗和葡萄糖耐量。同时，丙二酸单酰基人参皂苷通过降低天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶的表达来改善肝损伤。此外，Western印迹分析表明，丙二酸单酰基人参皂苷处理后，肝脏和骨骼肌中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK、p-ACC/ACC和GLUT4的蛋白表达水平显著上调。p-IRS-1/IRS-1、Fas和SREBP-1c的蛋白表达水平显著降低。这些发现表明，丙二酸单酰基人参皂苷具有通过激活IRS-1/PI3K/AKT和AMPK信号通路来改善糖脂代谢和胰岛素抵抗的潜力。但该类化合物极性大、亲水强，采用传统植化方法进行溶剂萃取时，会在水层富集而丢失，因为皂苷一般会在正丁醇层富集；结构不稳定，遇酸、碱或高温条件会发生转化，脱去丙二酸，变为相应的中性皂苷，给该类皂苷的富集制备带来很大困难。为了突破丙二酸单酰基人参皂苷制备难题，同时挖掘其其他方面潜在的药理活性，提出本专利。

发明内容

本发明提供了一种丙二酸单酰基人参皂苷提取物的制备方法及应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种丙二酸单酰基人参皂苷提取物的制备方法，其步骤为：

S1人参提取液的制备：将人参根洗净，放入闪提装置中加乙醇水闪提，得到的提取液离心后取上清液；

S2人参澄清液的制备：将S1中的提取上清液除醇后加水稀释过陶瓷膜澄清，得到澄清液；

S3丙二酸单酰基人参皂苷提取物的制备：将S2中的澄清液上装填极性反相硅胶填料的色谱柱，收集洗脱液冻干得丙二酸单酰基人参皂苷提取物。

其中，所述步骤S1中人参根与水的质量比为(1-4)：(5-15)，提取时间为1-3分钟，提取次数为1-3次。

其中，所述步骤S1中的离心时间为15-60分钟，转速为3000-8000rpm。

其中，步骤S2中所述陶瓷膜膜芯孔径为30-500nm,微滤过程中加纯水顶洗的体积为料液体积的1/5-1/8，温度为25-45℃。

其中，步骤S3中所述反相硅胶填料为极性C3、C8或C18，填料粒径10-60um，孔径100-300A。收集的洗脱液馏分为30-50％醇水洗脱液。

一种丙二酸单酰基人参皂苷提取物的应用，所述丙二酸单酰基人参皂苷提取物对癌细胞活力具有抑制作用。

其中，所述癌细胞为口腔鳞癌细胞、肾癌细胞。

本发明提供的技术方案具有如下优异效果：

(1)提取方法为低温全成分提取，耗时短，成本低，环境友好，可充分的提取丙二酸单酰基人参皂苷，且保证其不被破坏；

(2)陶瓷膜过滤过程及高效液相制备通用性强，操作简单方便，高效制备色谱柱效高，可为丙二酸单酰基人参皂苷与其他杂质和其他类型的皂苷提供充分的分离选择性；

(3)制备的丙二酸单酰基人参皂苷提取物具有很好的抗癌功效，如：口腔鳞癌、肾癌。

附图说明

图1丙二酸单酰基人参皂苷组分冻干粉；

图2丙二酸单酰基人参皂苷提取物色谱图；

图3人参皂苷对口腔鳞癌细胞体外增殖能力的影响；

图4人参皂苷对口腔鳞癌细胞迁移能力的影响；

图5人参皂苷对口腔鳞癌细胞侵袭能力的影响；

图6人参皂苷对肾癌细胞体外增殖能力的影响；

图7回流提取与闪提的人参提取液对比液相谱图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

实施例1：

丙二酸单酰基人参皂苷提取物的制备：将2kg人参根洗净加入闪提提取罐，利用60％乙醇水进行提取，料液比以质量计为1:5，提取温度为20-30℃，提取2mins。滤除溶液后将剩余残渣加60％乙醇水，以相同提取条件进行二次提取,合并两次提取液。提取液浓缩除去乙醇，加水稀释至提取液原体积，过500nm陶瓷膜，得澄清液。澄清液上C18YE(1.5kg，30μm)极性反相硅胶柱，先用2倍柱体积的去离子水淋洗去除强极性杂质；再用2倍柱体积的体积浓度为35％的乙醇洗脱原人参三醇组皂苷(以人参皂苷Rg1和Re为主)；再用2倍柱体积的体积浓度为45％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至无醇，冻干后得到粉末状固体即为丙二酸单酰基人参皂苷提取物(图1)；再用2倍柱体积的体积浓度为70％的乙醇洗脱原人参二醇组皂苷(以人参皂苷Rb1和Rd为主)。将该丙二酸单酰基人参皂苷提取物进行液质联用分析，条件如下：

仪器：岛津超高效液相色谱AB SCIEX X500系列QTOF质谱仪；

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)；

流动相：A：乙腈；B：0.1％甲酸/水。

洗脱条件：

流速：0.4mL/min；

柱温：40℃；

波长：203nm；

进样量：2L。

质谱分析方法：

(1)离子源：ESI离子源；负离子模式；气帘气：35psi；Gas1：40psi；Gas2：40psi；温度：450℃；离子化压力：-4500V，去簇电压：-60V；全扫描范围：m/z100-2000；裂解电压：-5V。CE Spread：0V。

(2)离子源：ESI离子源；正离子模式；气帘气：35psi；Gas1：40psi；Gas2：40psi；温度：500℃；离子化压力：4500V，去簇电压：60V；全扫描范围：m/z100-1500；裂解电压：5V。CESpread：0V。

分析谱图及成分指认结果如图2所示。

活性评价：评价了人参皂苷对口腔鳞癌细胞活力抑制的影响。CCK-8实验可以通过测定细胞活力来检测细胞的增殖能力，为了确定人参皂苷能否影响口腔鳞癌细胞的活性，分别用不同浓度(250、500、1000μg/mL)的人参皂苷处理口腔鳞癌细胞处理24h后，通过酶标仪测得各组的OD值，分析后发现阳性对照5-FU浓度为5μg/ml对口腔鳞癌细胞活力具有明显抑制作用，抑制率达90％以上(p＜0.01)；丙二酸单酰基人参皂苷随着浓度升高，对口腔鳞癌细胞的抑制作用显著增强，抑制率呈极显著升高(p＜0.01)；与丙二酸单酰基人参皂苷相比，原人参二醇和三醇组皂苷对细胞活力抑制作用相对较弱，如图3所示(图3中：#：与对照组相比差异不显著(p＞0.05)；*：与对照组相比差异显著(p＜0.05)；**：与对照组相比差异极显著(p＜0.01))。另外，评价了人参皂苷对口腔鳞癌细胞迁移能力的影响。划痕实验在一定程度上可以反映细胞的运动能力。用规格合适的划痕棒在生长状态良好的单细胞层划出一道空白，一定时间后可根据划痕空白愈合的程度来判断细胞运动能力的变化。制造划痕后，加入不同浓度的人参皂苷提取物处理口腔鳞癌细胞12h，观察划痕大小的变化。结果发现，与对照组相比，三种人参皂苷提取物均能降低细胞相对迁移率(p＜0.05)，但同浓度比较后丙二酸单酰基人参皂苷对癌细胞迁移能力抑制作用更明显，且呈浓度依耐性，如图4所示(图4中：**：与对照组相比差异极显著(p＜0.01))。还评价了人参皂苷对口腔鳞癌细胞侵袭能力的影响。按照Transwell的实验方法加入不同浓度的人参皂苷(250、500、1000μg/mL)处理口腔鳞癌细胞12h后，结果发现，和对照组相比，人参皂苷处理组的细胞相对侵袭率显著降低(p＜0.05)，且呈剂量依赖性，尤其丙二酸单酰基人参皂苷对癌细胞侵袭能力的抑制极其显著，如图5所示(图5中：**：与对照组相比差异极显著(p＜0.01))。

实施例2：

丙二酸单酰基人参皂苷提取物的制备：将2kg人参洗净加入闪提提取罐，利用60％乙醇水进行提取，料液比以质量计为1:7，提取温度为25-30℃，提取5mins。滤除溶液后将剩余残渣加60％乙醇水，以相同的提取条件进行二次提取，合并两次提取液。提取液浓缩除去乙醇，加水稀释至提取液原体积，过30nm陶瓷膜，得澄清液。澄清液上X1(1.5kg，40μm)极性反相硅胶柱，先用2倍柱体积的去离子水淋洗去除强极性杂质；再用2倍柱体积的体积浓度为25％的乙醇洗脱原人参三醇组皂苷(以人参皂苷Rg1和Re为主)；再用2倍柱体积的体积浓度为35％的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至无醇，冻干后得到粉末状固体即为丙二酸单酰基人参皂苷提取物；再用2倍柱体积的体积浓度为50％的乙醇洗脱原人参二醇组皂苷(以人参皂苷Rb1和Rd为主)。

活性评价：评价了人参皂苷对肾癌细胞抑制活力的影响。通过酶标仪测得各组的OD值，分析后发现阳性对照5-FU浓度为5μg/ml对肾癌细胞活力具有明显抑制作用(p＜0.01)；丙二酸单酰基人参皂苷对肾癌细胞具有极显著抑制作用(p＜0.01)，且呈剂量依赖性；而原人参二醇和三醇组皂苷在低浓度时不具有统计学意义，高浓度时对肾癌细胞活力抑制作用较弱，如图6所示(注：#：与对照组相比差异不显著(p＞0.05)；*：与对照组相比差异显著(p＜0.05)；**：与对照组相比差异极显著(p＜0.01)。)。

对比例1：

闪提和回流提取对丙二酸单酰基人参皂苷的影响：闪提条件同实施例1；回流提取条件为：将2kg人参洗净加入回流提取罐，利用60％乙醇水进行提取，料液比以质量计为1:7，提取温度为80-90℃，提取2h。滤除溶液后将剩余残渣加60％乙醇水，以相同的提取条件进行二次提取，合并两次提取液。取闪提提取液和回流提取液进行对比分析，色谱条件同实施例1。液相分析谱图，如图7所示，在人参闪提提取液中主要丙二酸单酰基人参皂苷(M-Rb1、M-Rc、M-Rb2和M-Rd)的占比明显增加。实验结果说明低温闪提有利于避免丙二酸单酰基人参皂苷长时间高温受热分解，可提高其提取效率。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。