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TaHDA9-B基因中的C2308T SNP位点在辅助筛选不同株高小麦中的应用

文献发布时间：2023-06-19 19:28:50

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及TaHDA9-B基因中的C2308T SNP位点在辅助筛选不同株高小麦中的应用，C2308T SNP位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起的第2308位核苷酸。

背景技术

小麦(Triticum aestivum L.)是我国最主要的粮食作物之一。提升小麦单产是满足粮食需求不断提高的重要方式，同时也是保证粮食安全的战略目标。降低小麦株高可以增加抗倒伏能力，进而小麦产量增加。因此株高性状对于实现小麦的高产、稳产极其重要。

目前，研究者已经定位了大量调控株高的QTL：Gao等利用周842B×中国春的重组自交系群体鉴定到位于染色体2A、4A、4B、4D和5A的5个株高QTL；Zhang等在染色体1D、2B、3A、3D、4A、4B、5A和6B鉴定到8个与株高相关QTL；Guo等基于芯片标记技术对215个小麦品种进行关联分析，关联到11个与株高相关的QTL位点，分别被定位3A、3B、5B、6A、6B和7B染色体上；Yu等利用包含有110株系ITMI的RIL群体为材料，对小麦株高进行定位，共检测到10个控制株高的QTL位点，分别被定位3B、5A、5B、6A和7D染色体上；Bai等利用双单倍体材料(Avalon x Cadenza)，对小麦株高性状进行定位，共5个QTLs被检测到，分别被定位在2D、4D、3A、3B和6A。尽管已经定位了大量的与小麦株高相关的QTL，但由于绝大多数QTL的表型贡献率较小，且在不同年际及环境间重复性差，所以这些QTL难以应用于小麦株高的遗传改良。

CAPS标记又称为PCR-RFLP(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)，是一类以PCR为基础的共显性分子标记，揭示的是特异PCR片段的限制性长度变异信息，其基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。优点是避免了RFLP分析中繁琐的转移、杂交步骤，又能保持RFLP分析的精确度。然而，SNP恰好位于限制性酶切位点的情况比较少，因此，提出了dCAPS标记，即在CAPS标记的基础上通过在扩增引物中引入错配碱基，结合SNP位点引入新的限制性内切酶作用位点，产生和CAPS标记类似的多态性。

发明内容

本发明的目的为如何筛选或辅助筛选不同株高的小麦。

本发明首先保护筛选或辅助筛选不同株高小麦的方法。

本发明所保护的筛选或辅助筛选不同株高小麦的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I还是基因型II，基因型II的小麦的株高>基因型I的小麦的株高；

所述基因型I的小麦为基于C2308T SNP位点的基因型为CC纯合型的小麦；

所述基因型II的小麦为基于C2308T SNP位点的基因型为TT纯合型的小麦；

所述C2308T SNP位点为小麦基因组中SEQIDNO:1自5’末端起的第2308位核苷酸。

本发明所保护的筛选或辅助筛选不同株高小麦的方法，具体可为方法二，可依次包括如下步骤：

(A1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；

(A2)以所述PCR扩增产物P1为模板，采用引物F2和引物R2组成的引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P2；

(A3)将所述PCR扩增产物P2用限制性内切酶BamHI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果所述酶切产物为两条DNA片段，则待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I；如果所述酶切产物为一条DNA片段，则待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型II；

基因型II的小麦的株高>基因型I的小麦的株高；

所述引物F1为SEQ ID NO:4所示的单链DNA分子；

所述引物R1为SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子；

所述引物F2为SEQ ID NO:6所示的单链DNA分子；

所述引物R2为SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子。

本发明所保护的筛选或辅助筛选不同株高小麦的方法，具体可为方法三，可依次包括如下步骤：

(B1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；

(B2)以所述PCR扩增产物P1为模板，采用引物F2和引物R2组成的引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P2；

(B3)将所述PCR扩增产物P2用限制性内切酶BamHI进行酶切，得到酶切产物；然后进行如下评判：如果酶切产物中只具有78bp的DNA片段和22bp的DNA片段，则待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I；如果所述酶切产物中只具有100bp的DNA片段，则待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型II；

基因型II的小麦的株高>基因型I的小麦的株高；

所述引物F1为SEQ ID NO:4所示的单链DNA分子；

所述引物R1为SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子；

所述引物F2为SEQ ID NO:6所示的单链DNA分子；

所述引物R2为SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子。

本发明所保护的筛选或辅助筛选不同株高小麦的方法，具体可为方法四，可依次包括如下步骤：

(C1)以待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1；

所述引物F1为SEQ ID NO:4所示的单链DNA分子；

所述引物R1为SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子；

(C2)将所述PCR扩增产物P1进行测序，然后进行如下评判：

如果所述PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2自5’末端起第1793-2606位所示，则待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I；

如果所述PCR扩增产物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3自5’末端起第1793-2606位所示，则待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型II；

基因型II的小麦的株高>基因型I的小麦的株高。

本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦株高的试剂盒。所述试剂盒可包括检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I还是基因型II的物质；

所述基因型I为基于C2308T SNP位点的基因型为CC纯合型的TaHDA9-B基因；

所述基因型II为基于C2308T SNP位点的基因型为TT纯合型的TaHDA9-B基因；

所述C2308T SNP位点为小麦基因组中SEQ ID NO:1自5’末端起的第2308位核苷酸。

所述试剂盒具体可由检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I还是基因型II的物质组成。

上述任一所述检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I还是基因型II的物质可包括引物F1和引物R1组成的引物对甲和/或引物F2和引物R2组成的引物对乙；

所述引物F1为SEQ ID NO:4所示的单链DNA分子；

所述引物R1为SEQ ID NO:5所示的单链DNA分子；

所述引物F2为SEQ ID NO:6所示的单链DNA分子；

所述引物R2为SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子。

上述任一所述检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I还是基因型II的物质具体可由所述引物对甲和所述引物对乙组成。

上述任一所述检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I还是基因型II的物质具体可由所述引物对甲组成。

上述任一所述检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I还是基因型II的物质还可包括限制性内切酶BamHI。

上述任一所述检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I还是基因型II的物质具体可由所述引物对甲、所述引物对乙和限制性内切酶BamHI组成。

本发明还保护上述任一所述试剂盒的应用，可为(z1)-(z4)中至少一种：

(z1)筛选或辅助筛选不同株高小麦；

(z2)鉴定或辅助鉴定小麦株高；

(z3)鉴定或辅助鉴定小麦TaHDA9-B基因的基因型；

(z4)小麦育种。

本发明还保护SEQ ID NO:1所示的分子标记。

本发明还保护SEQ ID NO:1所示的分子标记的应用，可为(z1)-(z4)中至少一种：

(z1)筛选或辅助筛选不同株高小麦；

(z2)鉴定或辅助鉴定小麦株高；

(z3)鉴定或辅助鉴定小麦TaHDA9-B基因的基因型；

(z4)小麦育种。

上文中，当分子标记中的C2308T SNP位点的基因型为CC纯合型，则判定为基因型I的小麦；C2308T SNP位点的基因型为TT纯合型，则判定为基因型II的小麦。所述C2308T SNP位点为小麦基因组中SEQIDNO:1自5’末端起的第2308位核苷酸。基因型II的小麦的株高>基因型I的小麦的株高。

上文中，所述>具体可为统计学上的>。

实验证明，采用本发明所提供的方法检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型可以筛选或辅助筛选小麦株高性状。本发明在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。

附图说明

图1为自然群体中部分小麦品种TaHDA9-B基因的基因型检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的小麦材料均来自国家作物种质库(网址为：http://icscaas.com.cn/jiguoku/zhongzhiku.htm)，材料信息见中国作物种质信息网(网址为：http://icgr.caas.net.cn)。由于小麦材料均为栽培种，因此通常被默认为是高度纯合的植物材料，基因型均为纯合型。

实施例1、小麦TaHDA9-B基因中C2308T SNP的发现及小麦基于TaHDA9-B基因的基因型分型方法的建立

一、小麦TaHDA9-B基因中C2308T SNP的发现

本发明的发明人经过大量实验，在小麦TaHDA9-B基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)上发现了一个SNP位点，命名为C2308T SNP。C2308T SNP位于SEQ ID NO:1自5’末端起的第2308位，基因型为CC纯合型和TT纯合型。由于基因组DNA是由反向互补的两条单链DNA分子组成双链DNA分子，因此一般将编码蛋白质的DNA分子命名为正义DNA分子；将与正义DNA分子的反向互补的DNA分子命名为反义DNA分子。C2308T SNP的基因型均为正义DNA的基因型。SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列为从http://plants.ensembl.org/index.html网站下载的参考序列，Gene ID为TraesCS2B02G309700。

根据小麦TaHDA9-B基因的不同将小麦分为两种基因型：TaHDA9-B-C(以下简称基因型I)和TaHDA9-B-T(以下简称基因型II)。基因型I小麦的TaHDA9-B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。基因型II小麦的TaHDA9-B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

二、合成用于扩增包括C2308T SNP的靶序列的引物对甲和引物对乙

设计并合成用于扩增包括C2308T SNP的靶序列的引物对甲和引物对乙。引物对甲由引物F1和引物R1组成。引物对乙由引物F2和引物R2组成。

各个引物的核苷酸序列具体如下：

引物F1：5′-GATTTACCTCAAGGGAACACAATAAGATGG-3′(SEQ ID NO:4)

引物R1：5′-GCTCTGAAGATCAGTGAGACACATCCTATC-3′(SEQ ID NO:5)

引物F2：5′-AGCTTCTCAAGTATCATGCTAGGAT-3′(SEQ ID NO:6)

引物R2：5′-AGCATGAACCTGTCAGTGAAATAGA-3′(SEQ ID NO:7)

引物对甲扩增的靶序列如SEQ ID NO:1自5’末端起第1793-2606位所示。

三、小麦基于TaHDA9-B基因的基因型分型方法的建立

1、提取待测小麦的基因组DNA。

2、以步骤1的待测小麦的基因组DNA为模板，采用引物F1和引物R1组成的引物对甲进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P1。

反应体系为10μL，由3.6μL ddH

2×Taq酶Mix为南京诺唯赞公司的产品，产品目录号为P131。

反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃15s，72℃15s，32次循环；72℃10min；16℃保存。

3、完成步骤2后，以PCR扩增产物P1的稀释液(1体积份PCR扩增产物P1和9体积份水混合而成)为模板，采用引物F2和引物R2组成的引物对乙进行PCR扩增，得到PCR扩增产物P2。

反应体系为10μL，由3.6μL ddH

反应条件为：95℃3min；95℃15s，56℃15s，72℃10s，32次循环；72℃10min；16℃保存。

4、将步骤3得到的PCR扩增产物P2用限制性内切酶BamHI进行酶切消化，得到酶切产物；将酶切产物进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，进行如下判断：如果酶切产物为带型A(显示两条带，分别为78bp和22bp)，则待测小麦C2308T SNP为CC纯合型，即待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I；如果酶切产物为带型B(显示一条带，为100bp)，则待测小麦C2308T SNP为TT纯合型，即待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型II。

实施例2、小麦TaHDA9-B基因的基因型与小麦株高的关联分析及验证

1、自然群体中各个小麦TaHDA9-B基因的基因分型

采用实施例1中步骤三的方法对自然群体中的各个小麦品种进行基因分型。自然群体由295个小麦品种(均为六倍体)组成。小麦品种名称详见表1。

部分检测结果见图1(M为DNA Marker，其它泳道为不同小麦品种；其中T为基因型II的小麦品种，C为基因型I的小麦品种)。

295个小麦品种基于TaHDA9-B基因的基因型见表1：62个小麦品种基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型II，233个小麦品种基于TaHDA9-B基因的基因型为基因型I。

表1

注：I为基因型I，II为基因型II。

2、株高性状检测

将295个小麦品种分别种植于九个环境，分别统计不同种植条件下两种基因型的小麦的平均株高。

统计结果见表2。

表2

注：P value为关联分析的显著性水平，“

3、关联分析

利用Tassel2.1软件选择单线性模型+群体结构(GLM+PCA)方法将自然群体中小麦TaHDA9-B基因的基因型与株高进行关联分析，结果见表2。

结果表明，295个小麦品种组成的自然群体中，“基因型II的小麦”的株高>“基因型I的小麦”的株高；所述“>”为在统计学上的>。对自然群体的研究表明，基因型I是降低小麦株高的优异基因型。

上述结果表明，通过检测待测小麦基于TaHDA9-B基因的基因型可以筛选或辅助筛选小麦株高性状，在小麦分子标记辅助育种过程中具有重要的应用价值。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>河北师范大学

<120>TaHDA9-B基因中的C2308T SNP位点在辅助筛选不同株高小麦中的应用

<160> 7

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5993

<212> DNA

<213> Triticum aestivum L.

<220>

<221>

<222> (2308)…(2308)

<223> m为c或t

<400>1

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<211>5993

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<400>2