一种防治青枯病的微生物及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种防治青枯病的微生物及其应用。

背景技术

烟草是我国重要经济作物之一，病害的发生一直是影响其优质稳产的重要限制因素。烟草青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的，发生面积最广、危害最为严重的一种土传病害。通常在我国长江流域以南各烟区发生，其中贵州、广东、安徽、四川及广西等地危害严重。青枯雷尔氏菌主要从烟草根部侵入，到达木质部继而破坏维管束组织，典型症状是根茎发黑，叶片发黄萎蔫，最终整株死亡，对烟株具有极强破坏力，常常导致烟田全部发病甚至绝收。

土壤中青枯雷尔氏菌的数量是造成烟草青枯病发生的关键因素之一，因此对土壤中青枯雷尔氏菌的定量检测极为重要。目前检测方法包括平板涂布分离法、PCR扩增技术和实时荧光定量PCR技术等。其中实时荧光定量PCR技术因灵敏度高、操作简单、适用范围广泛等优势引起人们的关注。已有文献【秦帅，实时荧光定量PCR技术用于土壤中烟草青枯病菌的定量检测及动态分析。硕士毕业论文，山东农业大学】建立了实时荧光定量PCR技术，成功对土壤中青枯雷尔氏菌定量检测，结果表明qPCR对青枯病菌的检测具有特异性、有效性和可靠性。

在我国绿色农业的蓬勃发展和烟草制品逐渐向无公害方向发展的趋势下，农业生产中，生物防治作为一种新的植物防病理念日益受到重视。将生防菌株研发成微生物菌剂，加入有机肥中所得到的生物有机肥施入土壤后，不仅可以给土壤带入新鲜的有机质，还有特定功能的微生物，这些有益微生物更易在根际土壤定殖和生长。生物有机肥可以改善土壤肥力和土壤生态环境，产生活性抗菌物质，刺激和调控农作物生长，降低作物病害的发生以及改善农产品品质。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种防治青枯病的微生物及其应用。

本发明采用以下技术方案来实现：

本发明提供了假单胞菌(Pseudomonas sp.)P菌株，该菌株的微生物保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.25601，保藏日期2022年8月29日。

该假单胞菌P菌株为革兰氏阴性菌，杆状，能运动，在牛肉膏蛋白胨培养基上的单菌落为小型圆形点状，黄色，表面光滑，菌落中央突起；16s基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)D菌株，该菌株的微生物保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.25602，保藏日期2022年8月29日。

该贝莱斯芽孢杆菌D菌株为革兰氏阳性菌，杆状，能运动，在牛肉膏蛋白胨培养基上的单菌落为不规则形，污白色，表面光滑，平坦；gyrB基因序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种防治青枯病的微生物，为假单胞菌(Pseudomonas sp.)P菌株，或贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)D菌株，或两种菌株的组合。

本发明提供了一种上述防治青枯病的微生物在防治烟草青枯病以及降低土壤中青枯病原菌中的应用。

本发明提供了一种防治烟草青枯病的微生物菌剂，该微生物菌剂中含有上述防治青枯病的微生物或其菌液。

本发明提供了一种利用上述微生物菌剂防治烟草青枯病的方法，将上述防治青枯病的微生物制成拮抗菌菌悬液对烟草进行灌根处理。

本发明提供了一种微生物有机无机复合肥，由有机肥和氮磷钾无机肥复合而成，其中，所述有机肥中接种上述假单胞菌(Pseudomonas sp.)P菌株的发酵产物和上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)D菌株的发酵产物。

优选地，所述有机肥包括15％菜籽饼和85％基础有机肥，所述有机肥中接种由所述P菌株的发酵产物和所述D菌株发酵产物组成的混合物。

优选地，所述P菌株的发酵产物和所述D菌株发酵产物的混合体积比为(1-2)：(1-2)，所述混合物接种量为基础有机肥质量的1％。

优选地，所述基础有机肥是以牛粪、猪粪、菌渣为原料，各占三分之一，按条垛型有机肥发酵工艺发酵60d以上，制作而成。

优选地，所述有机肥和无机肥复合的体积比为1.5：1。

本发明提供了上述微生物有机无机复合肥在防治烟草青枯病中的应用。

本发明提供了上述微生物有机无机复合肥的制备方法，包括以下步骤：

(1)液体发酵

挑取单菌落于LB液体培养基中，30℃、200±20r/min，振荡培养36h，制成种子液；以1‰转接量将种子液转接至发酵培养罐中，通气量为37.5m

(2)二次固体发酵

所用有机肥为15％菜籽饼+85％基础有机肥的复配产物，其已发酵20天以上备用(基础有机肥是以牛粪、猪粪、菌渣为原料，各占三分之一，按条垛型有机肥发酵工艺发酵60d以上，制作而成的有机肥)。菌株D发酵产物与菌株P发酵产物按1：2(V/V)的比例进行混配，在上述有机肥中的接种量为1％，接种时使用搅拌机将微生物菌剂D、P和有机肥进行充分混合，混匀后进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5-7d后结束，获得微生物有机肥。

(3)与无机肥混配

将上述微生物有机肥与无机肥(N：P：K＝10：10：24)按1.5：1(V/V)的比例进行混配，得到固体剂型微生物有机无机复合肥，其中的有效活菌总数为≥1×10

本发明的有益效果是：

本发明利用假单胞菌(Pseudomonas sp.)P菌株和贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)D菌株的发酵产物，制作有机肥，基于本发明方法获得的微生物有机无机肥，田间施用后对烟草青枯病具有较好的防治效果，还能降低土壤中青枯病菌数量。

附图说明

图1是本发明假单胞菌P菌株基于16s基因序列构建的系统发育树；

图2是本发明贝莱斯芽孢杆菌D菌株基于gyrB基因序列构建的系统发育树；

图3是本发明P和D菌株与青枯雷尔氏菌平板拮抗图；

图4是本发明2021年遵义正安试验田烟草青枯病发病情况。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明，

1、材料

本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。

假单胞菌(Pseudomonas sp.)P菌株，该菌株的微生物保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCCNo.25601，保藏日期2022年8月29日。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)D菌株，该菌株的微生物保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路，保藏编号为CGMCC No.25602，保藏日期2022年8月29日。

2、方法

2.1菌株的分离纯化

本发明的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)D菌株和假单胞菌(Pseudomonas sp.)P菌株是从烟草根际通过稀释涂板法和平板划线法分离纯化获得的。分离方法为：取10g根际土放入带有玻璃珠的90mL生理盐水中，180r/min震荡30min，制成10-1稀释液。吸取100μL10-1稀释液于900μL无菌水中得到10-2稀释液，按此方法依次获得10-3和10-4稀释液。分别吸取100μL 10-3、10-4倍稀释液涂布于LB固体培养基平板上，37℃恒温培养48h后，挑取LB固体培养基上不同形态的细菌菌落于LB固体培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化细菌菌株，分别编号保存并进行菌种筛选。

2.2P、D菌株的鉴定

2.2.1P菌株鉴定

提取P菌株的基因组DNA，采用16s引物进行PCR扩增，扩增产物测序后通过NCBI数据库在线比对，利用MEGA软件构建系统发育树。

16s引物序列为：

上游引物：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；

下游引物：5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’；

其中，M、Y为兼并碱基，M表示A/C，Y表示C/T。

P扩增产物序列如SEQ ID No.1所示。

如图1所示，P与假单胞菌相似度最高，因此将P归入假单胞菌(Pseudomonas)，命名为假单胞菌P菌株。

2.2.2D菌株鉴定

提取D菌株的基因组DNA，采用gyrB引物进行PCR扩增，扩增产物测序后通过NCBI数据库在线比对，利用MEGA软件构建系统发育树。

gyrB引物序列为：

上游引物：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3’；

下游引物：5’-GAAGTCATCATGA CCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTT YGA-3’；

其中，R、N、Y为兼并碱基，R表示A/G，N表示A/G/C/T，Y表示C/T。

D扩增产物序列如SEQ ID NO.2所示。

如图2所示，D与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)相似度最高，因此将D归入贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为贝莱斯芽孢杆菌D菌株。

2.3D、P及复合菌剂防治烟草青枯病盆栽试验

2.3.1D、P及复合菌剂平板抑菌效果

菌株D和P在LB固体平板生长12h，挑取单菌30℃振荡培养24h，用无菌LB液体培养基调节浓度至1×10

表1D、P及复合菌剂平板

2.3.2D、P及复合菌剂防治烟草青枯病盆栽试验

试验用土为混配营养土(V(蛭石)∶V(营养土)＝1:1)。待烟草(云烟87)长至4-5片叶，挑取长势一致的烟苗，用D、P或复合拮抗菌菌悬液(D：P＝1：2)进行灌根处理，2天后接种烟草青枯病菌。每个处理组3个重复，每个重复种植10株烟苗，28-35℃防虫条件下培养。

烟草青枯病分级标准如下(GB/T23222-2008)：0级：全株无病；1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下叶片凋萎；3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2，或病侧1/2～2/3叶片凋萎；5级：茎部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达植株顶部，或病侧2/3以上叶片凋萎；7级：茎部黑色条斑到达植株顶部，或病株叶片全部凋萎；9级：病株基本枯死。

病情指数＝∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100。

防效(％)＝(空白对照组病情指数—处理组病情指数)/空白对照组病情指数×100％。

表2烟草青枯病发病情况统计

由表2可知，P菌剂、D菌剂和复合微生物菌剂(D+P)处理均对烟草青枯病具有较好的防治效果，相对防效分别为43.32、29.99和53.35。其中复合微生物菌剂处理效果优于单菌处理。

2.4应用

2.4.1制备微生物有机无机复合肥

(1)液体发酵

挑取单菌落于LB液体培养基中，30℃、200±20r/min，振荡培养36h，制成种子液；以1‰转接量将种子液转接至发酵培养罐中，通气量为37.5m

(2)二次固体发酵

所用有机肥为15％菜籽饼+85％基础有机肥的复配产物，其已发酵20天以上备用(基础有机肥是以牛粪、猪粪、菌渣为原料，各占三分之一，按条垛型有机肥发酵工艺发酵60d以上，制作而成的有机肥)。菌株D发酵产物与菌株P发酵产物按1：2(V/V)的比例进行混配，在上述有机肥中的接种量为1％，接种时使用搅拌机将微生物菌剂D、P和有机肥进行充分混合，混匀后进行固体发酵，发酵过程中每天翻堆1次，发酵5-7d后结束，获得微生物有机肥。

(3)与无机肥混配

将上述微生物有机肥与无机肥(N：P：K＝10：10：24)按1.5：1(V/V)的比例进行混配，得到固体剂型微生物有机无机复合肥，其中的有效活菌总数为≥1×10

2.4.2烟草青枯病田间防治试验

材料：使用2.3.1的方法所生产的微生物有机无机复合肥进行田间试验；

地址：2021年于贵州省遵义市正安县进行田间试验，供试试验田为以前烟草土传病害发生较重的田块，地势较高不易淹水，肥力均匀，地面相对较平，形状相对较规则，面积1-2亩(每亩烟株数为1000株)。

试验设置4个处理，分别为CK：60kg/亩常规复合肥(N：P：K＝10：10：24)+15kg/亩常规追肥(N：P：K＝10：10：24)；A1：105kg/亩有机无机肥(不含微生物)+19kg/亩专用追肥(N：P：K＝10：10：24)；A2：105kg/亩低剂量复合微生物有机无机复合肥[2kg复合微生物菌剂(贝莱斯芽孢杆菌D和假单胞菌P的发酵菌剂按照按1：2(V/V)的比例进行混配后，接种至63kg有机肥中二次发酵后，再与42kg无机肥充分混匀制成微生物有机无机肥)]+19kg/亩专用追肥；

A3：105kg/亩高剂量微生物有机无机复合肥[4kg复合微生物菌剂(贝莱斯芽孢杆菌D和假单胞菌P的发酵菌剂按照按1：2(V/V)的比例进行混配后，接种至63kg有机肥中二次发酵后，再与42kg无机肥充分混匀制成微生物肥料]+19kg/亩专用追肥。每个处理重复3次。上述试验于烟草移栽期开展，不同处理组肥料进行穴施处理。

在烟草采烤期(烟草土传病害发病盛期)进行不同处理组烟草青枯病害的调查，以株为单位，一般在晴天中午以后调查。各处理均调查50株，详细记录每处理发病株数，并对每株进行病情分级，计算病情指数和防效。

烟草青枯病分级标准如下：0级：全株无病；1级：茎部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下叶片凋萎；3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2，或病侧1/2～2/3叶片凋萎；5级：茎部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达植株顶部，或病侧2/3以上叶片凋萎；7级：茎部黑色条斑到达植株顶部，或病株叶片全部凋萎；9级：病株基本枯死。

病情指数＝∑(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表值)×100。

防效(％)＝(空白对照组病情指数—处理组病情指数)/空白对照组病情指数×100％。

表3遵义市正安县烟草青枯病病情及菌剂防效

由表3可以看出，正安县试验田的对照组(常规复合肥)的平均病情指数为22.16，低剂量的A1(仅施有机无机肥)的平均病情指数为21.93，中剂量A2处理组(有机无机肥+2kg/亩微生物菌剂)的平均病情指数为16.78，高剂量A3处理组微生物菌剂(有机无机肥+4kg/亩微生物菌剂)的平均病情指数为15.49。通过对上述不同处理组青枯病的发病率和病情指数的比较分析，可知中剂量A2处理组和高剂量A3处理组相对于对照组，烟草青枯病的病情指数呈下降趋势。

2.5微生物有机无机复合肥施用后土壤烟草青枯病菌数量调查

烟草移栽期进行微生物有机无机复合肥施用，并于烟草采烤期进行不同处理组根际土壤样品的采集，采用土壤DNA提取试剂盒进行土壤DNA的提取。利用实时荧光定量PCR技术对土壤中青枯雷尔氏菌进行检测。

表4 2021年遵义市正安县土壤样品中烟草青枯病菌数量检测

2021年于遵义市正安县试验点在烟草移栽期进行微生物有机无机复合肥施用，并于烟草采烤期进行不同处理组根际土壤样品的采集以及土壤中烟草青枯病菌DNA含量检测。如表5所示，正安试验地的CK、A1、A2、A3(如图4所示)四个处理组中发病植株中的青枯菌含量大小依次为2021.8正安CK发病(10

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。