一种评估抗体偶联药物稳定性的方法

技术领域

本发明涉及一种评估药物的方法，具体涉及一种评估抗体偶联药物稳定性的方法。

背景技术

抗体偶联药物(简称ADC)是由抗体链接小分子毒素组成的新型药物分子，这一类型的药物一般有静脉给药进入体内，在体循环过程中到达靶组织，抗体与肿瘤细胞表面抗原结合，在肿瘤细胞中连接子发生断裂，释放出小分子毒素。连接子能否在合适的时机合适的器官发生断裂，是ADC药物成功与否的关键。

而ADC药物一般半衰期较长，其能否在漫长的体循环中稳定存在，也是评价ADC药物是否会产生脱靶毒性的一个指标。根据不同适用场景，用于评价ADC药物稳定性的体系分为缓冲盐体系、血清、血浆、全血等。其中全血、血浆孵育体系由于其最能体现静脉给药环境，所以在药物设计时优选作为稳定性考察的体系，但是由于全血/血浆本身富含各种蛋白，不宜用于长时间孵育。而ADC药物在体内的循环时间均长于数天。如何能够更好地延长血液体系孵育时间，用于评价ADC药物的稳定性，就变得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，通过考察各孵育因素的影响，优化血浆孵育条件，提供了一种评估抗体偶联药物稳定性的方法，所述方法较好地体现了ADC药物在体循环中的稳定性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种评估抗体偶联药物稳定性的方法，包括以下步骤：

1)将药物加入到血浆中，药物终浓度在0.1-1mg/mL；

2)设置特定的条件(使用抗氧化剂vs不使用抗氧化剂、通入氧气vs不通入氧气、孵育pH＝7.4vs pH＝5.0)，在体外将抗体偶联药物与血浆进行孵育，模拟体循环中药物长时间与血液接触的条件下药物的稳定性变化；

3)对血浆样品进行提取，获得孵育后血浆中产生的小分子代谢物；

4)利用高分辨质谱检测检测血浆提取后的样本，从质谱数据中鉴定推测的药物代谢产物，评价建立的孵育体系的培养条件是否能产生特定代谢产物，以及产生的代谢物的响应的高低，以获得优化的培养条件。

进一步的，采用正交实验分组，每次控制1个单一变量进行不同分组，考察抗氧化剂的使用、氧气的参与、孵育pH值，设定长时间孵育(如孵育14-30天)模拟ADC药物在体循环中的时间，考察不同孵育条件下(是否添加抗氧化剂、不同的孵育pH值)，血浆长时间孵育后的外观的变化(如颜色、蛋白沉降等)，并通过有机溶剂提取、质谱检测等技术，寻找特定代谢产物，通过对比特定代谢产物峰强度，评估孵育效果，只有能检测到特定的预测代谢产物的体系条件，才被认为是正常产生代谢的环境，特定代谢产物的强度高低可以用于评价孵育体系条件的优劣。

进一步的，可以用于评估的孵育条件包括抗氧化剂的使用、氧气的参与、孵育pH值的变化，通过质谱仪器检测中获得的特定代谢产物的响应高低以确定优化的孵育体系条件。孵育过程在CO

进一步的，本发明方法中使用pH＝7.4的磷酸缓冲液稀释血浆，稀释比例为1︰1(v:v)。

本发明的优点是：

1.通过考察不同孵育条件的影响，确定血浆样品的保鲜程度，并通过质谱检测特定代谢产物的生成量评估血浆孵育的效果。

2.通过对比，筛选出适用于长时间血浆体外孵育的条件。

3.采用本发明方法用于评价ADC药物的稳定性能有效解决如何能够更好地延长血液体系孵育时间的问题，填补了抗体偶联药物这一新型药物类型的稳定性评价体系的空白。

附图说明：

图1是用于评估孵育结果的特定代谢产物的质谱信号图。

图2是特征代谢产物离子(m/z 447.18)在不同孵育条件下的质谱响应对比结果。

具体实施方式

实施例1：

在血浆中孵育抗体偶联化合物(antibody-drug conjugate，商品名：Kadcyla)，孵育体积400μL，孵育终浓度1mg/mL。通过以下不同分组，对比不同孵育条件产生的小分子裂解代谢物的能力。

1.抗氧化剂的使用

平行孵育不同分组，包括血浆中加入与不加入抗氧化剂柠檬酸(10μL，1mg/mL)，通过对比血浆孵育21天前后的颜色变化及沉降，确定稀释血浆对于长时间孵育的改善。

2.氧气参与的考察

平行孵育不同分组，包括充入氧气后密封孵育管、敞口孵育每日补充磷酸缓冲液(pH＝7.4)至起始体积，通过对比血浆孵育21天前后的颜色变化及沉降，确定稀释血浆对于长时间孵育的改善。

3.孵育体系pH条件的考察

平行孵育不同分组，包括用pH＝7.4的磷酸缓冲液或pH＝5.0的醋酸钠缓冲液1︰1(v︰v)稀释血浆，通过对比血浆孵育21天前后的颜色变化及沉降，确定稀释血浆对于长时间孵育的改善。

4.以上各组孵育完成后，通过3倍体积乙腈沉淀提取血浆，并采用高分辨质谱检测特定代谢产物，通过对比特定代谢产物峰强度，评估孵育效果。

结果：

图1提供的是用于评价孵育体系是否成功的质谱检测结果，其中目标分子的信号为m/z 447.1797。通过比较这个目标代谢物分子的信号高低，对于不同孵育条件的效果。表1总结了不同孵育条件下该目标分子的信号值。

表1

在不同孵育条件下，经过21天孵育，各组孵育的血浆均发生了不同程度的沉降，其中由于敞开环境并37℃孵育，水分蒸发速度较快，需要及时加入磷酸缓冲液，蛋白沉降情况明显。不适用于高通量孵育样本的操作。

抗氧化剂柠檬酸的加入均会抑制某些酶的活性，其代谢产物的含量低于不含柠檬酸的组别。

酸性条件的血浆孵育中没有产生预期的代谢产物，在选用血浆时应注意pH值(控制在7-8之间)的控制。

结论：

在不同孵育条件下，经过21天孵育，经过有机溶剂提取，并使用高分辨质谱检测特征代谢产物M1(m/z 447.18)，如图2所示，对比结果如下：

通过对比可以确定，不含柠檬酸的体系以及pH＝7.4的条件更适合产生特征裂解产物，可以适用于评价血浆中抗体偶联化合物的稳定性。