一种采用多相、同轴液体离心提取天然产物活性成分的方法

技术领域

本发明属于植物提取分离相关技术领域，且特别涉及一种采用多相、同轴液体离心提取天然产物活性成分的方法。

技术背景

天然产物是指动、植物提取物或微生物体内的组成成分或其代谢产物。其中主要为黄酮类、生物碱类、多糖类、挥发油类、醌类、萜类、皂苷类、酚酸类及氨基酸与酶等。天然产物早已在医药领域发挥不可忽视的作用：如从黄花蒿茎叶中提取得到的青蒿素是治疗疟疾耐药性效果最好的药物；从银杏叶中提取得到的银杏内酯B能抑制血小板活化因子；从侧柏叶中提取得到的雪松烯对艰难梭状芽胞杆菌和产气荚膜杆菌有明显的抑制作用。

而天然产物种类繁多，只对一种天然产物进行提取或对不同天然产物进行分步提取必然造成原料和试剂的浪费。但目前工业与实验室对天然产物的提取分离方法主要还是通过液-液两相萃取或者柱层析，它们的步骤繁琐，需要消耗大量的试剂和时间，且效率低下。此外，一些提取天然产物的新方法如超临界流体提取由于设备的昂贵，难以大范围推广；而微波、脉冲电场等提取方法也不适合工业上大规模的生产。现有利用离心机的提取技术中，存在离心萃取机与多级离心萃取系统的料仓与仪器零件不能分离、清洗较为困难等问题，不利于仪器的维护和其他天然产物的提取，且它们均是以液-液两相萃取为基础。

多相、同轴液体离心提取是一种利用多个提取液同时对原料进行提取的技术。多液相体系在离心时，会随转速增大而逐渐形成同一个轴心的多层空心液柱，此时两液体间的接触面积最大。物质将根据自身与提取液的性质在各个液层中进行分配、转移，离心时的轻微振荡也会加快物质的分配和转移，从而实现多液相的同时提取。若想同时用石油醚和乙酸乙酯分别提取天然产物中的色素和黄酮类化合物，可采用三液相体系；若想同时分别提取小极性化合物、中等极性化合物和大极性化合物，则可采用四液相体系。

多相、同轴液体离心提取技术通过利用多种提取液同时提取，能大大减少多步提取过程的时间，提高提取效率，在化工、制药等行业具有广阔的应用前景。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于针对现有技术的不足，创新性地开发了一种基于同轴液体离心机的多液相提取系统，提供一种同时提取天然产物不同部位的方法，从而增加天然产物提取效率，促进医药行业的发展。

技术方案

一种采用多相、同轴液体离心提取天然产物活性成分的方法，包括如下步骤：a、天然产物预处理：将中药材烘干、研磨成粉末后过筛，然后用水性溶剂或者有机溶剂预处理，得到天然产物预处理浸膏，备用；

b、多相提取溶剂的制备：制备一系列不同密度、不同亲/疏水性质的水性溶剂和有机溶剂，备用；

c、多相、同轴液体离心平台的构建：将提取溶剂与样品溶液依照密度从大到小的顺序加入样品瓶，构成三液相或多液相体系，并将样品瓶径向固定在离心机上；

所述的方法，其特征在于：所述步骤a中，天然产物粉末过筛目数为65～200目，天然产物粉末与水性溶剂或有机溶剂的料液比为1:1～1:50g/mL。

所述的方法，其特征在于：所述步骤b中，多相提取溶剂的种类包括石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、四氯乙烯、二氯甲烷、氯仿、聚乙二醇、二(2-乙基己基)磷酸酯等有机溶剂与包括柠檬酸钠、磷酸二氢钠等水溶液及上述溶剂的混合溶剂。

所述的一种用于天然产物活性成分提取的多相、同轴液体离心技术，其特征在于：所述步骤c中，各相溶液体积比为1:1～1:10，离心机转速为200～20000rpm，离心提取时间为5～360min，且样品瓶径向固定在离心机上。

所述中药材为侧柏叶。

本发明的关键点：

1、并非任何活性成分和有机溶剂都适用于多液相提取，理由如下：

三液相体系可由有机相A-水相-有机相B、水相A-有机相-水相B或有机相-双水相构成。

在有机相A-水相-有机相B体系或水相A-有机相-水相B体系中，可将原料分散在中间相中，相A与相B同时对中间相的活性成分进行提取。由此可知，相A与相B存在竞争关系，因而当两者性质相似时，性质相似的活性成分将同时被相A提取，而相B则不能发挥作用。因而对于有机相A-水相-有机相B体系或水相A-有机相-水相B，应用的两种提取液应当对不同活性成分具有较大亲和力差异。

在有机相-双水相体系中，原料分散在双水相中的盐溶液中。已有研究表明双水相中的聚合物相能提取大多数的天然产物，且提取效率高。有机相-双水相体系反应时，双水相中的聚合物溶液先对盐溶液中的活性成分进行提取，同时有机相对聚合物溶液中的活性成分进行提取，直至活性成分在盐溶液-聚合物溶液-有机相三相中达到动态平衡。由于活性成分和采用的有机溶剂的亲和力不同，与有机溶剂亲和力高的将被提取到有机相，与有机溶剂亲和力弱的活性成分将留在聚合物相，由此实现两种试剂对不同物质的同时提取。但如果有机相的提取能力太弱，有机相将不能从聚合物相提取到活性成分。因而有机溶剂和双水相的组成和配比应当依据待提取活性成分的性质合理设计。

2、并非任何溶剂都可以实现本发明的目的，理由如下：

聚合物与盐按照一定比例混溶于水中，可得到分层的双水相。在双水相基础上叠加一种不与水混溶的有机溶剂即可得到三液相体系；叠加两种不与水混溶且密度差异较大的有机溶剂即可得到四液相体系。除利用双水相的特点外，也可使用两种密度差异较大的有机溶剂与水构成三液相，在此基础上再叠加密度更大的盐水溶液即可得到四液相。

要构成稳定的多液相体系，各相溶液必需不能混溶成均一溶液。如构成有机相加双水相的三液相体系时，双水相中盐与聚乙二醇的质量分数必须高于该盐与聚乙二醇的双水相相图曲线；有机溶剂不与水混溶，且不会溶解聚乙二醇。在构成组成为有机相-水相-有机相的三液相体系时，需考虑有机溶剂与水是否混溶和有机溶剂的密度(两有机溶剂必须一个密度大于水溶液，另一个密度小于水溶液)。构成四液相体系所需考虑因素与上述三液相相同。

为此本发明筛选了不同溶剂体系，具体如下：

表1：有机相-双水相体系

表2：有机相A-水相-有机相B体系

结果显示：除影响双水相形成的因素外，有机相-双水相体系的构成还与有机溶剂的性质有关。

如果盐和聚合物的质量分数在双水相曲线之下，则不能形成双水相，而形成一个同时溶有盐和聚合物的均匀水溶液。如表1中含磷酸二氢钠的体系，质量分数为40％的聚乙二醇溶液会与质量分数为20％的磷酸二氢钠溶液混溶，但增大磷酸二氢钠的质量分数至40％，聚乙二醇溶液与磷酸二氢钠溶液形成双水相。因此盐和聚合物的质量分数必须在双水相曲线之上。

当有机溶剂能溶解聚乙二醇时(如表1中的二氯甲烷与正丁醇)，双水相中的聚乙二醇会被提取到有机相，双水相中的聚乙二醇的质量分数降低，则双水相变为一个水相。因而在选择有机溶剂时要注意其是否干扰双水相的形成。

而对于有机相A-水相-有机相B体系或水相A-有机相-水相B体系，有两种不同的溶剂分别位于中间相的两侧，则相A与相B两种溶剂的密度需要有明显差异。如表2中正丁醇/二氯甲烷(2:1,v/v)混合溶液的密度为0.98，小于水的密度，则在依次加入溶液构成三液相体系时，加入的水溶液会直接穿过混合有机溶剂到体系的最下层。因此，在构建多相体系前，应测定混合溶液的密度。

为获得侧柏叶中黄酮，本发明最终选择如下三种条件：

对侧柏叶中黄酮提取的三液相体系最佳条件是，乙酸乙酯、水和正丁醇/二氯甲烷溶液体积比为2:1:2，其中正丁醇/二氯甲烷溶液为正丁醇与二氯甲烷按体积比1:1混合所得，转速为1000rpm，离心提取时间为30min；

或二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯、聚乙二醇溶液和侧柏叶水溶液的体积比为3:1:1，其中二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯为二(2-乙基己基)磷酸酯与乙酸乙酯按体积比1:10混合所得，转速为3000rpm，离心提取时间为15min；

对侧柏叶中黄酮提取的四液相体系最佳条件是，二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯、聚乙二醇溶液、侧柏叶水溶液和石油醚/四氯乙烯的体积比为2:1:1:3，其中二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯为二(2-乙基己基)磷酸酯与乙酸乙酯按体积比1:10混合所得，石油醚/四氯乙烯为石油醚与四氯乙烯按体积比1:1混合所得，转速为8000rpm，离心提取时间为35min。

有益效果

本发明可通过有机相A-水相-有机相B体系同时得到乙酸乙酯和正丁醇两个部位的侧柏叶黄酮提取物，在三次提取后三种黄酮类化合物在水中的残留量均小于10％，提取效率高；或通过有机相-双水相体系获得乙酸乙酯和聚合物相两个部位的提取物或乙酸乙酯、聚合物相和石油醚三个部位的提取物。

本发明使用多种溶剂对天然产物不同有效成分进行同时提取，能同时获得乙酸乙酯、正丁醇、聚合物相、石油醚等不同部位的产物；能减少天然产物的提取步骤，显著减少提取时间。

附图说明

图1、同轴液体离心时多液相形态正视图(a)与俯视图(b)；

图2、三液相(a)与四液相(b)构成示意图；

图3、样品瓶径向安装示意图；

图4、正丁醇与二氯甲烷的不同混合体积比对侧柏叶中黄酮提取的影响；

图5、各相体积比对侧柏叶黄酮提取的影响；

图6、不同转速对侧柏叶中总黄酮提取的影响；

图7、不同离心提取时间对侧柏叶中黄酮提取的影响。

具体实施例

以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。

实施1

将2kg侧柏叶烘干、研磨成粉末后用80目筛网过筛，备用。

将侧柏叶粉末用75％乙醇浸泡过夜，料液比为1:10g/mL，微沸回流提取6h，重复三次，合并乙醇，旋蒸后得到乙醇浸膏。浸膏分散在2L水中，备用。

正丁醇与二氯甲烷按照体积比0:1～1:1混合，得到不同浓度的正丁醇/二氯甲溶液，备用。

将正丁醇/二氯甲烷溶液、侧柏叶水溶液和乙酸乙酯依照密度由大到小顺序加入样品瓶，构成三液相体系，将样品瓶径向固定在离心机上。

1、设置转速为1000rpm，离心提取10min，各溶液体积比为1:1:1，三相分离后即可同时得到乙酸乙酯和正丁醇两个部位的侧柏叶提取物，测定三相的总黄酮量，以水相中总黄酮量最少的正丁醇/二氯甲烷混合体积比为最佳溶剂混合比例。

结果如图4所示，正丁醇/二氯甲烷混合溶液中，正丁醇含量越高，水相中总黄酮量越少，黄酮提取率越高。因而在体积比0:1～1:1范围内，正丁醇与二氯甲烷的最佳混合体积比为1:1。

2、设置转速为1000rpm，离心提取10min，正丁醇与二氯甲烷按体积比1:1混合，各溶液体积比为1～2:1:1～2，三相分离后即可同时得到乙酸乙酯和正丁醇两个部位的侧柏叶提取物，测定三相的总黄酮量，以水相中总黄酮量最少的三液相体积比为最佳提取体积比。

结果如图5所示，有机相体积越大，水相中总黄酮量越少，黄酮提取率越高。因而在体积比1～2:1:1～2范围内，2:1:2为三液相最佳体积比。

3、设置转速500～1000rpm，离心提取10min，正丁醇与二氯甲烷按体积比1:1混合，各溶液体积比为1:1:1，三相分离后即可同时得到乙酸乙酯和正丁醇两个部位的侧柏叶提取物，测定三相的总黄酮量，以水相中总黄酮量最少的转速为最佳转速。

结果如图6所示，转速越大，水相中总黄酮量越少，总黄酮提取率越高，因而在转速500～1000rpm范围内，1000rpm为最佳转速。

4、设置转速为1000rpm，正丁醇与二氯甲烷按体积比1:1混合，各溶液体积比为1:1:1，离心提取5～35min，三相分离后即可同时得到乙酸乙酯和正丁醇两个部位的侧柏叶提取物，测定三相的总黄酮量，以水相中总黄酮量最少的离心提取时间为最佳离心提取时间。

结果如图7所示，离心提取时间在5～30min范围内，提取时间越长，水相中总黄酮量越少，黄酮提取率越高；离心提取时间为30～35min时，总黄酮量在三相中的变化不大，说明对总黄酮的提取达到平衡。

综上，对侧柏叶中黄酮提取的三液相体系最佳条件是，乙酸乙酯、水、正丁醇/二氯甲烷溶液体积比为2:1:2，其中正丁醇/二氯甲烷溶液为正丁醇与二氯甲烷按体积比1:1混合所得，转速为1000rpm，离心提取时间为30min。

将侧柏叶浸膏分散在水中，用乙酸乙酯和正丁醇/二氯甲烷溶液按照上述最佳条件对侧柏叶水相中的黄酮进行提取，重复提取三次，分别合并乙酸乙酯溶液与正丁醇/二氯甲烷溶液，测定三相中杨梅苷、槲皮苷与穗花杉双黄酮的含量，结果如下：

表3多相、同轴液体离心提取侧柏叶中的杨梅苷、槲皮苷与穗花杉双黄酮

如表3所示，同时得到乙酸乙酯和正丁醇两个部位的侧柏叶黄酮提取物。三次提取后三种黄酮类化合物在水中的残留量均小于10％，其中穗花杉双黄酮被全部提取到两个有机相。

实施例2

将2kg侧柏叶烘干、研磨成粉末后用100目筛网过筛，备用；

将侧柏叶粉末用75％乙醇浸泡过夜，料液比为1:10g/mL，微沸回流提取6h，重复三次，合并乙醇，旋蒸后得到乙醇浸膏。浸膏分散在质量分数为35％柠檬酸钠水溶液中，备用。

制备质量分数为40％的聚乙二醇2000水溶液，备用。

二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按照体积比0:10～1:10混合，得到不同浓度的二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯溶液，备用。

将侧柏叶浸膏溶液、聚乙二醇溶液、乙酸乙酯溶液依照密度由大到小顺序加入样品瓶，构成三液相体系，将样品瓶径向固定在离心机上。

设置转速为1000rpm，离心提取10min，(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按照体积比0:10～1:10混合，各溶液体积比为1:1:1，三相分离后即可同时得到乙酸乙酯和聚乙二醇两个部位的侧柏叶提取物，测定三相中槲皮苷的含量，以能在乙酸乙酯中提取到最多槲皮苷的二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯混合体积比为最佳混合比例。在0:10～1:10范围内，二(2-乙基己基)磷酸酯与乙酸乙酯最佳混合体积比为1:10。

设置转速为1000rpm，离心提取10min，二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按体积比1:10混合，各相溶液体积比为1～10:1～10:1，三相分离后即可同时得到乙酸乙酯和聚乙二醇两个部位的侧柏叶提取物，测定三相中槲皮苷的含量，以能在乙酸乙酯中提取到最多槲皮苷的三液相体积比为最佳比例。在各相溶液体积比为1～10:1～10:1范围内，3:1:1为最佳。

设置转速为400～10000rpm，离心提取10min，二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按体积比1:10混合，各相溶液体积比为3:1:1，三相分离后即可同时得到乙酸乙酯和聚乙二醇两个部位的侧柏叶提取物，测定三相中槲皮苷的含量，以能在乙酸乙酯中提取到最多槲皮苷的转速为为最佳转速。在400～10000rpm范围内，3000rpm为最佳。

设置离心提取时间为10～60min，转速3000rpm，二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按体积比1:10混合，各相溶液体积比为3:1:1，三相分离后即可同时得到乙酸乙酯和聚乙二醇两个部位的侧柏叶提取物，测定三相中槲皮苷的含量，以能在乙酸乙酯中提取到最多槲皮苷的转速为为最佳提取时间。在10～60min范围内，15min为最佳。

综上，二(2-乙基己基)磷酸酯与乙酸乙酯的最佳混合比为1:10，最佳转速为3000rpm，离心提取时间为15min，二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯、聚乙二醇溶液和侧柏叶水溶液的体积比为3:1:1。

实施例3

将2kg侧柏叶烘干、研磨成粉末后用100目筛网过筛，备用；

将侧柏叶粉末用75％乙醇浸泡过夜，料液比为1:10g/mL，微沸回流提取6h，重复三次，合并乙醇，旋蒸后得到乙醇浸膏。浸膏分散在质量分数为35％柠檬酸钠水溶液中，备用。

制备质量分数为40％的聚乙二醇2000水溶液，备用。

二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按照体积比0:10～1:10混合，得到不同浓度的二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯溶液，备用。

石油醚和四氯乙烯按照体积比0:1～1:1混合，得到不同浓度的石油醚/四氯乙烯溶液，备用。

将四氯乙烯溶液、侧柏叶浸膏溶液、聚乙二醇溶液、乙酸乙酯溶液、依照密度由大到小顺序加入样品瓶，构成四液相体系，将样品瓶径向固定在离心机上。

设置转速为10000rpm，离心提取10min，二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按体积比0:10～1:10混合，石油醚和四氯乙烯按体积比0:1混合，各相溶液体积比为1:1:1:1，四相分离后即可同时得到乙酸乙酯、聚乙二醇和四氯乙烯三个部位的侧柏叶提取物，测定四相中槲皮苷的含量，以能在乙酸乙酯中提取到最多槲皮苷的二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯混合体积比为最佳混合比例。在0:10～1:10范围内，1:10为二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯的最佳混合比例。

设置转速为10000rpm，离心提取10min，二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按体积比1:10混合，石油醚和四氯乙烯按体积比0:1～1:1混合，各相溶液体积比为1:1:1:1，四相分离后即可同时得到乙酸乙酯、聚乙二醇和四氯乙烯三个部位的侧柏叶提取物，测定四氯乙烯中α-蒎烯的含量，以能在四氯乙烯中提取到最多α-蒎烯的石油醚/四氯乙烯混合体积比为最佳混合比。在0:1～1:1范围内，1:1为石油醚和四氯乙烯的最佳混合比例。

设置转速为10000rpm，离心提取10min，各溶液体积比为1～10:1～10:1:1～10，四相分离后即可同时得到乙酸乙酯、聚乙二醇和四氯乙烯三个部位的侧柏叶提取物，测定槲皮苷和α-蒎烯在乙酸乙酯和四氯乙烯两有机溶剂中的含量，以槲皮苷和α-蒎烯的分离度最大的四液相体积比为最佳。在各溶液体积比为1～10:1～10:1:1～10范围内，2:1:1:3为最佳比例。

设置转速为5000～15000rpm，离心提取10min，二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按体积比1:10混合，石油醚和四氯乙烯按体积比1:1混合，各相溶液体积比为2:1:1:3，四相分离后即可同时得到乙酸乙酯、聚乙二醇和四氯乙烯三个部位的侧柏叶提取物，测定乙酸乙酯中槲皮苷的含量以及四氯乙烯中α-蒎烯的含量，以槲皮苷和α-蒎烯的分离度最大的转速为最佳。在5000～15000rpm范围内，8000rpm为最佳转速。

设置转速为8000rpm，离心提取时间为5～60min，二(2-乙基己基)磷酸酯和乙酸乙酯按体积比1:10混合，石油醚和四氯乙烯按体积比1:1混合，各相溶液体积比为2:1:1:3，四相分离后即可同时得到乙酸乙酯、聚乙二醇和四氯乙烯三个部位的侧柏叶提取物，测定乙酸乙酯中槲皮苷的含量以及四氯乙烯中α-蒎烯的含量，以槲皮苷和α-蒎烯的分离度最大的转速为最佳提取时间。在5～60min范围内，35min为最佳离心提取时间。

综上，二(2-乙基己基)磷酸酯与乙酸乙酯的最佳混合体积比为1:10，石油醚与四氯乙烯的最佳混合体积比为1:1，最佳转速为8000rpm，离心提取时间为35min，二(2-乙基己基)磷酸酯/乙酸乙酯、聚乙二醇溶液、侧柏叶水溶液和石油醚/四氯乙烯的体积比为2:1:1:3。