一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用
文献发布时间:2023-06-19 19:28:50
技术领域
本发明涉及生物工程领域,尤其涉及一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术
丙氨酸是重要的氨基酸化合物,也是最小的手性分子之一,按照旋光性可以分为DL-丙氨酸、D-丙氨酸和消旋型的DL-丙氨酸。其中,消旋型DL-丙氨酸是一种重要的工业化合物,在食品、医药、农业等领域具有广泛应用。在食品领域中,DL-丙氨酸是甜味很强的氨基酸,还可以作为调味料和营养增补剂,可增强化学调味料的调味效果。在医药领域中,DL-丙氨酸是合成氧氟沙星原料氨基丙醇和维生素B6的主要原料。在农业领域中,DL-丙氨酸既可以作为饲料添加剂,也可以合成氨基酸农药。
DL-丙氨酸的生产方法主要包括化学合成法、酶催化法和发酵法。化学合成法包括Strecker法、Buchere法、α卤代羧酸氨化法、相转移催化合成法和L-丙氨酸化学消旋法,其中前4种方法存在安全性差、分离困难、收率低等问题,而L-丙氨酸化学消旋法存在原料价格高、设备易腐蚀、环境污染等问题,因此逐渐被淘汰。酶催化法先通过发酵将葡萄糖转化为L-丙氨酸,随后通过添加丙氨酸消旋酶将L-丙氨酸转化为DL- 丙氨酸。该方法生产周期较长、生产成本偏高,不容易实现大规模工业生产。发酵法以葡萄糖为底物,以基因工程手段构建菌株直接发酵生产DL-丙氨酸,具有原料廉价易得、产品得率高、成本低等优势,得到广泛关注。
相比于42℃以下的常温发酵,高温发酵能够显著降低污染风险、提高原料转化效率并降低热交换成本,在大规模发酵生产中有较高的应用价值。丙氨酸发酵通常以基因工程改造的大肠杆菌为生产菌株,但是该菌株的最适生长温度为37℃,无法进行高温发酵。
因此,本领域的技术人员致力于开发一种能够在高温条件下发酵生产DL-丙氨酸的菌株,以满足大规模生产的需求。
发明内容
有鉴于此,本发明所要解决的技术问题是提供可以在42℃以上的高温条件下生产DL-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用。
为实现上述目的,本发明的第一方面提供了一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法,包括如下步骤:
提供具有丙酮酸合成途径的起始菌;
进行步骤S200和S300对所述起始菌的基因组进行改造,构建两步法用基因工程菌株;或者,
进行步骤S200、S300和S400,构建过表达丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌株;
S200:插入6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝;
S300:插入具有42℃~55℃热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因GSald;
S400:失活或缺失丙氨酸消旋酶基因,再引入过表达的丙氨酸消旋酶基因。
本发明的第一方面构建得到的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株可以在42℃~55℃的高温条件下发酵生产DL-丙氨酸。
在本发明的一些实施方式中,所述起始菌还具有乳酸合成途径,且所述起始菌的基因组中含有乳酸脱氢酶基因;所述的构建方法还包括如下步骤:
S100:失活或缺失所述起始菌的基因组中的乳酸脱氢酶基因。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S400中,全部失活或缺失丙氨酸消旋酶基因alr1和丙氨酸消旋酶基因alr2;和/或,
所述步骤S400中,所述引入过表达的丙氨酸消旋酶基因通过插入强启动子和丙氨酸消旋酶基因实现;插入的丙氨酸消旋酶基因为丙氨酸消旋酶基因alr1或/和丙氨酸消旋酶基因alr2。
在本发明的第二方面,提供了本发明的第一方面所述的构建方法制得的基因工程菌株。
在本发明的第三方面,提供了本发明的第二方面所述的基因工程菌株在生产DL-丙氨酸中的应用。
在本发明的第四方面,提供了一种DL-丙氨酸的生产方法,对本发明的第二方面所述的基因工程菌株进行发酵培养,其中,发酵培养温度为42℃~55℃;
在本发明的一些实施方式中,所述发酵培养的方式选自以下任一种:
采用所述两步法用基因工程菌株,所述的生产方法包括发酵培养步骤和丙氨酸消旋酶处理步骤;或者,
采用所述过表达丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌株,所述的生产方法包括发酵培养步骤,不包括额外的丙氨酸消旋酶处理步骤;或者,
采用所述过表达丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌株,所述的生产方法包括发酵培养步骤,还包括丙氨酸消旋酶处理步骤。
本发明公开的技术方案所带来的有益效果包括:
以嗜热菌作为起始菌,构建得到的菌株可实现在42℃~55℃(例如50℃)高温下进行DL-丙氨酸的生产。通过增强糖酵解途径或/和引入热稳定性的丙氨酸脱氢酶,可构建得到两步法用基因工程菌株,该菌株在发酵结束后添加微生物丙氨酸消旋酶,即可高产消旋型DL-丙氨酸。在上述两步法用基因工程菌株的基础上,失活或缺失丙氨酸消旋酶基因后,再引入过表达的丙氨酸消旋酶基因,构建得到的菌株可通过直接发酵法生产消旋型DL-丙氨酸,简化工艺、节约成本,也可以与外源添加丙氨酸消旋酶相结合来更精准地控制消旋型DL-丙氨酸的光学纯度。对于存在乳酸合成途径的起始菌,通过阻断乳酸合成途径,可以增加丙酮酸合成途径的比例,进而实现DL- 丙氨酸的增产。上述手段的组合可实现高温条件下高产DL-丙氨酸的协同增效。
本发明所构建的基因工程菌株和提供的发酵工艺解决了现有技术中生产DL-丙氨酸发酵温度低、成本高等问题,实现了DL-丙氨酸的高温生产(例如42℃~55℃),在发酵过程中具有能耗低、抗污染等优点,有效降低了生产成本,具有较高的工业化利用价值。还实现了高产消旋型DL-丙氨酸,具有良好的应用前景。DL-丙氨酸的产量可实现120g/L以上,部分可实现130g/L以上;所得DL-丙氨酸接近消旋型,其中L-丙氨酸的光学纯度极为接近50%,具体地,L-丙氨酸光学纯度基本可以控制在 49.5%到50.5%之间。
以能够50℃高温发酵的地衣芽孢杆菌为例,从高产D-乳酸的地衣芽孢杆菌BN11出发,通过消除其D-乳酸的合成途径,增强糖酵解途径的通量,引入热稳定的异源丙氨酸脱氢酶,消除内源的D-丙氨酸合成途径,再另外引入过表达的丙氨酸消旋酶基因,所构建的基因工程菌株可实现消旋型DL-丙氨酸在高温条件下的直接发酵生产。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明,以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图,对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会阐述得更清晰:
图1是本发明的一个实施例中,以地衣芽孢杆菌为例的工程菌中丙氨酸的合成和代谢途径示意图;
图2是本发明的一个实施例中,一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株BDLA-1在 5L发酵罐50℃分批补料发酵生产DL-丙氨酸的发酵曲线图(▲,OD600;■,葡萄糖;●,丙氨酸);
图3是本发明的一个实施例中,一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株BDLA-1在 5L发酵罐50℃两步法生产DL-丙氨酸的发酵曲线图(▲,OD600;■,葡萄糖;●,丙氨酸);
图4是本发明的一些实施例中所用的PKVM载体的结构图,其包含ampR(氨苄青霉素抗性基因)和ermC(红霉素抗性基因)两个抗生素抗性基因,以及编码半乳糖苷酶的bgaB基因,均可作为筛选标记;该质粒具有一个热敏型复制起始位点oriT pE194ts,还有在大肠杆菌和地衣芽孢杆菌的复制起始位点ori和oriT。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明提供的具体事实方式作详细说明。
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施方式和优选实施例,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施方式和实施例来得以体现,本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施方式和实施例。
应理解,本发明的上述各技术特征和在下文(包括但不限于实施方式和实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以通过任意合适的方式互相组合,从而构成新的或优选的技术方案,只要能够用于实施本发明的即可。
本发明中,“优选”、“特别”、“具体”、“进一步”、“更进一步”等词语仅表示效果较佳的或者较为具体的实施方式或实施例,应当理解,并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中,“和/或”、“或/和”均表示所列项目中的任一种或任意组合。
本发明中,“其组合”、“任何组合”、“任意组合”、“任意组合方式”,均指所列相关项目的任意合适的组合方式,以能够顺利实施本发明为准。构成组合的相关项目的数量等于2或大于2。
本发明中,“多个”,在数量上,等于2或大于2。
本发明中涉及百分比浓度,如无特别限定或说明,表示在相关体系中的终浓度。
本发明中的数值范围,如无特别说明,均包括两个端点。
本发明中,“以上”、“以下”如无特别限定,均包括本数。
本发明上文及下文中涉及的各技术特征可以以任意合适的方式进行组合,只要不存在矛盾,且组合后的技术方案能够顺利实施并能够解决本发明的技术问题。所述任意合适的方式,以能够实现本发明的技术方案,解决本发明的技术问题,且能够实现相应的技术效果为准。
在本发明中,“出发菌”和“起始菌”具有相同含义,可以互换使用。
本发明中涉及温度控制,允许为恒温,也允许存在一定的温度波动范围。
在本发明中,高温生产DL-丙氨酸,是相对于常温(指低于42℃,通常为37℃以下),本文中的高温生产,如无特别限定,指在42℃~55℃条件下进行发酵生产,举例包括但不限于42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、52℃、53 ℃、54℃、55℃。
本发明中,如无特别说明,“丙酮酸合成途径”是指碳源经过糖酵解合成丙酮酸的途径。本发明中,“具有丙酮酸合成途径”是指具有内源性合成丙酮酸的能力。
本发明中,如无特别说明,“乳酸合成途径”是指:从丙酮酸转化为乳酸的合成途径。本发明中,如无特别说明,具有“乳酸合成途径”是可通过乳酸合成途径生产乳酸,也即,“具有乳酸合成途径”指具有内源性合成乳酸的能力。
本发明中,如无特别说明,“丙氨酸合成途径”是指:从丙酮酸转化为丙氨酸的合成途径。本发明中,如无特别说明,具有“丙氨酸合成途径”是可通过丙氨酸合成途径生产丙氨酸,换言之,指具有内源性合成丙氨酸的能力。本发明中,具有丙氨酸合成途径时,如无特别说明,同时具有从丙酮酸合成L-丙氨酸的途径,以及从L-丙氨酸合成D-丙氨酸的途径。
本发明中,如无特别说明“D-丙氨酸的合成途径”是指,从L-丙氨酸合成D-丙氨酸的途径。“具有D-丙氨酸的合成途径”指具有内原性合成D-丙氨酸的能力。
本发明中,基因簇片段是指,相关基因单元的数量至少2个,相关基因单元可以为相同或不同的基因。如果为相同基因构成的基因簇片段,“重复”应进行广义理解,允许相邻地依次出现,也可以在任两个基因单元之间存在间隔序列。
本发明中,缺失相关基因的典型方式之一为基因敲除。
表1.部分术语的简写和中英文全称
表2部分术语的中外译文对照
本发明中涉及的氨基酸和核苷酸序列汇总于表3。
表3
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SEQ ID NO.1(GSald):ATGAAAATCGGCATCCCGAAAGAAATCAAAAACAACGAAAACC GCGTCGCGATCACGCCGGCGGGCGTCATGACGCTGGTCAAAGCGGGCCATGACGTCTATGTCGA AACGGAAGCGGGCGCGGGCAGCGGCTTTAGCGACAGCGAATATGAAAAAGCGGGCGCGGTCAT CGTCCCGAACGCGGAAGACGCGTGGACGGCGGAAATGGTCCTGAAAGTCAAAGAACCGCTGGC GGAAGAATTTCGCTATTTTCGCCCGGGCCTGATCCTGTTTACGTATCTGCATCTGGCGGCGGCGG AAGCGCTGACGAAAGCGCTGGTCGAACAGAAAGTCGTCGGCATCGCGTATGAAACGGTCCAGC TGGCGAACGGCAGCCTGCCGCTGCTGACGCCGATGAGCGAAGTCGCGGGCCGCATGAGCGTCCAGGTCGGCGCGCAGTTTCTGGAAAAACCGCATGGCGGCAAAGGCATCCTGCTGGGCGGCGTCCC GGGCGTCCGCCGCGGCAAAGTCACGATCATCGGCGGCGGCACGGCGGGCACGAACGCGGCGAA AATCGCGGTCGGCCTGGGCAGCGACGTCACGATCCTGGACATCAACGCGGAACGCCTGCGCGA ACTGGACGACCTGTTTGGCGACCATGTCACGACGCTGATGAGCAACAGCTATCATATCGCGGAA TGCGTCCGCGAAAGCGACCTGGTCGTCGGCGCGGTCCTGATCCCGGGCGCGAAAGCGCCGAAA CTGGTCACGGAAGAAATGGTCCGCAGCATGACGCCGGGCAGCGTCCTGGTCGACATCGCGATCG ACCAGGGCGGCATCTTTGAAACGACGGACCGCGTCACGACGCATGACGACCCGACGTATGTCA AACATGGCGTCGTCCATTATGCGGTCGCGAACATGCCGGGCGCGGTCCCGCGCACGAGCACGTT TGCGCTGACGAACGTCACGATCCCGTATGCGCTGCAGATCGCGAACAAAGGCTATCGCGCGGCG TGCCTGGACAACCCGGCGCTGCTGAAAGGCATCAACACGCTGGACGGCCATATCGTCTATGAAG CGGTCGCGGCGGCGCATAACATGCCGTATACGGACGTCCATAGCCTGCTGCATGGCTAA
SEQ ID NO.2(Alr1):ATGATGAGCTTAAAACCATTCTATAGAAAGACATGGGCCGAAATCGATTTAACGGCTTTAAAAGAAAACGTCCGCAATATGAAGCGGCACATCGGCGAGCATGTCCGCCTGATGGC CGTCGTTAAAGCGAATGCCTACGGACACGGGGATGCACAGGTAGCGAAGGCGGCTCTTGCAGAAGG GGCGTCCATTCTTGCTGTGGCTTTATTGGATGAAGCGCTTTCGCTGAGGGCGCAGGGGATTGAAGAAC CGATTCTTGTCCTCGGTGCAGTGCCGACCGAATATGCAAGCATTGCCGCGGAAAAGCGCATTATCGTG ACTGGCTACTCCGTCGGCTGGCTGAAAGACGTGCTCGGTTTTCTGAATGAGGCCGAAGCTCCTCTTG AATATCATTTGAAGATCGACACGGGCATGGGCCGCCTTGGCTGCAAAACGGAAGAAGAGATCAAAGA AATGATGGAGATGACCGAATCGAACGATAAGCTCAATTGTACGGGCGTGTTCACTCATTTCGCCACGG CGGACGAAAAGGACACCGATTATTTCAACATGCAGCTTGACCGCTTTAAAGAGCTGATCAGCCCCCTC CCGCTTGACCGTTTGATGGTGCATTCGTCAAACAGCGCCGCGGGTCTGCGCTTCAGGGAACAGCTATT TAATGCCGTCCGCTTCGGCATCGGCATGTACGGTTTGGCGCCGTCAACCGAAATAAAAGACGAGCTGCCGTTTCGTCTGCGGGAAGTGTTTTCGCTTCATACCGAACTCACCCATGTGAAAAAAATTAAAAAAGGC GAGAGCGTCAGCTACGGGGCGACATATACAGCTCAGCGCGACGAATGGATCGGGACAGTCCCCGTCG GGTATGCCGACGGATGGCTGAGGCGCCTGGCCGGAACGGAAGTGCTGATCGACGGAAAACGCCAAA AAATAGCAGGGAGAATCTGCATGGACCAGTTCATGATTTCCCTTGCCGAAGAATACCCTGTCGGCACA AAGGTTACCTTGATCGGAAAGCAAAAAGACGAATGGATCTCAGTCGACGAAATCGCCCAAAATTTGC AGACGATCAATTATGAAATTACCTGTATGATAAGTTCAAGGGTGCCCCGTATGTTTTTGGAAAATGGGA GTATAATGGAAATAAGGAATCCGATCTTGCCTGATCAATCCTGA
SEQ ID NO.3(Alr2):ATGAAAAAGCTTTGCCGTGAAGTTTGGGTAGAGGTAAATCTTGATGCG ATCAAAAAAAATTTGCGCGCGTTTCGGCGGCATATTCCGAAAAAGAGCAAAATTATGGCTGTCGTAAA AGCGAATGCTTATGGTCACGGATCGGTGGAAGTTGCACGCCATGCACTTGAACATGGTGCGAGTGAG CTCGCCGTTGCCTCGGTGGAGGAAGCGGTCGTTTTACGAAAAGCGGGGATTAAAGCGCCGATCCTTG TGCTTGGTTTCACCCCGCTGAGCTGTGTGAAAGAAGCGGCAGCTTGGAATATATCGTTATCAGCTTTTC AAGTTGACTGGATTAAAGAAGCGAACGAGATATTGGAAAATGAAGCAGATCCTAACCGGCTGGCTGT TCATATCAATGTGGATACCGGCATGGGGCGTTTAGGTGTACGAACAAAGGAAAAGCTTTTAGCAATCG TGGAAGCGCTGACGGCAAGTGAAAACCTCGAATGGGAAGGAATTTTTACGCATTTTTCCACAGCTGA CGAACCGGATACTGAGCTAACCATGATTCAACACGAAAAGTTTATCAGCTTTCTTCGCTTTCTGAAAG AACAAGGCTTTAAGCTGCCTACGGTGCATATGAACAATACGGCCGCGGCGATCGCTTTTCCGGAATTC AGCGCTGATATGATTCGCTTAGGCATCGGAATGTATGGATTATATCCTTCCGATTATATCAGGCAGCTTA ATCTCGTTAAGCTTGTGCCTGCACTAAGCTTGAAGGCGCGAATCGCTTATGTGAAAACCATGTTGACT GAACCGCGGACGGTTAGTTATGGTGCTACATATGTTGCAGAGCGCGGGGAAGTCATTGCCACAATTCC GGTCGGCTATGCTGACGGCTATTCCCGTGAACTTTCCAACCGCGGTTTTATTCTTCATCGAGGAAGAC GAGTGCCGGTGGCGGGAAGAGTAACAATGGATATGATAATGGTCAGTCTGGGAGAGGGTGAAGGTAA ACAAGGAGAGGAAGTCGTGATTTACGGCCGGCAAAAGGGAGCAGAGATATCTGTTGATGAAATTGCG GAAATGCTTGATACGATCAACTATGAAGTGGTATCTACCATAAGCTGGCGCGTCCCTCGTTTTTATATAA GAGACGGCGAGATTTTTAAAAAGTCGACCCCGCTGTTATACGTGTAG
SEQ ID NO.4(P
SEQ ID NO.5:CCTCGCGTCGGGCGATATCGGATCCGAAGGGGAAAGTCTTCGATTTCT
SEQ ID NO.6:AGAGGGCTTTTTCATGCTGAAGAGGTCAAAAAGAGCC
SEQ ID NO.7:TTTGACCTCTTCAGCATGAAAAAGCCCTCTTTGAAAAG
SEQ ID NO.8:CCATGGTACCCGGGAGCTCGAATTCCATAAGACCGCTGATGACAAGC
SEQ ID NO.9:TCCAGCCTCGCGTCGGGCGATATCGTCCCCATAACAACGGAATCATC
SEQ ID NO.10:AATAGGCGTCACCTTGACTCATCATTCCTTTGCCGTT
SEQ ID NO.11:AAGGAATGATGAGTCAAGGTGACGCCTATTTCACTTTC
SEQ ID NO.12:TCCAATTCGCTTCATAGCCCTCACTCCTCCATTTTC
SEQ ID NO.13:GGAGGAGTGAGGGCTATGAAGCGAATTGGAGTATTGACA
SEQ ID NO.14:CTTCATGGTGTTCAGTTACAATACAGTCGCATGGCC
SEQ ID NO.15:GCGACTGTATTGTAACTGAACACCATGAAGATACTAACATCA
SEQ ID NO.16:ACTAGACAGATCTATCGATGCATGCTTTCCCTTATTCCTTTAAACCCG
SEQ ID NO.17:AATAGGCGTCACCTTGCTGAAGAGGTCAAAAAGAGCC
SEQ ID NO.18:TTTGACCTCTTCAGCAAGGTGACGCCTATTTCACTTTCT
SEQ ID NO.19:AGAGGGCTTTTTCATTTAGCCATGCAGCAGGCTATG
SEQ ID NO.20:CTGCTGCATGGCTAAATGAAAAAGCCCTCTTTGAAAAG
SEQ ID NO.21:CCTCGCGTCGGGCGATATCGGATCCAAAATATGACGCTGTCTCAAATTGA
SEQ ID NO.22:CTAATTCATCAATTTGACACTTCCTGTTCCTTGTTTCACT
SEQ ID NO.23:GGAACAGGAAGTGTCAAATTGATGAATTAGCGGAAAAAC
SEQ ID NO.24:CCATGGTACCCGGGAGCTCGAATTCCGGAGTCTCTTTCAAAACCGTAG
SEQ ID NO.25:CCTCGCGTCGGGCGATATCGGATCCAAAATCATGTAAGCCCATTCCG
SEQ ID NO.26:GTGAGTATGGGAAAACAACGCTCCCTTCTTTCTTGTC
SEQ ID NO.27:AAGAAGGGAGCGTTGTTTTCCCATACTCACAGGCCG
SEQ ID NO.28:CCATGGTACCCGGGAGCTCGAATTCTAAAATGAAGGTGGTCCGGGAT
SEQ ID NO.29:CCTCGCGTCGGGCGATATCGGATCCAAGTGAAAGGCGAAGAGCAAAC
SEQ ID NO.30:AATAGGCGTCACCTTTTATTTTACAACGTGGATCGGC
SEQ ID NO.31:CACGTTGTAAAATAAAAGGTGACGCCTATTTCACTTTCT
SEQ ID NO.32:TTTTAAGCTCATCATAGCCCTCACTCCTCCATTTTC
SEQ ID NO.33:GGAGGAGTGAGGGCTATGATGAGCTTAAAACCATTCTATAGAA
SEQ ID NO.34:GAGGGGGTTTTTGATTCAGGATTGATCAGGCAAGATC
SEQ ID NO.35:CCTGATCAATCCTGAATCAAAAACCCCCTCTGCAG
SEQ ID NO.36:CCATGGTACCCGGGAGCTCGAATTCATATTATTGTGCCGAAC
SEQ ID NO.37:GCAAAGCTTTTTCATAGCCCTCACTCCTCCATTTTC
SEQ ID NO.38:GGAGGAGTGAGGGCTATGAAAAAGCTTTGCCGTGAA
SEQ ID NO.39:GAGGGGGTTTTTGATCTACACGTATAACAGCGGGGTC
SEQ ID NO.40:CTGTTATACGTGTAGATCAAAAACCCCCTCTGCAG
SEQ ID NO.41(Pfk):ATGAAGCGAATTGGAGTATTGACAAGCGGCGGCGATGCACCGGGGATG AATGCGGCGGTCCGCGCGATTGCCCGTAAAGGGATTTATCACGGCCTGGAAGTTTACGGCATTCGCCA AGGTTATAACGGATTGATTCAAGGAAACATCCAAAAGCTCGAAGCAGGATCTGTTGGCGATATTCTCC AGCGGGGCGGCACGGTTTTGCAGTCGGCAAGAAGCGAAGAATTCAAAACGCCGGAAGGGCAGCAA AAAGCGATCAGGCAGCTGAAAGACCATGGCATTGAAGCGCTCGTTGTGATCGGCGGCGACGGTTCCT ACCAAGGGGCCAAAAAGTTGACGGAACAGGGCTTTAACTGCATTGGTGTGCCAGGGACAATCGATAA CGACATCCCGGGGACGGATTTTACAATCGGTTTTGATACGGCATTGAACACAGTGCTTGATGCGATTGA TAAAATTCGCGACACCGCTTCTTCCCACGAACGCACCTTTATTATTGAAGTCATGGGCAGAAATGCCG GGGATATCGCGCTCTGGTCCGGCCTGGCCGGCGGAGCCGAATCGATTATTATTCCGGAAGAAAAATAT GACTTAAAAGATGTCGTGGAGCGTCTTGAACAGGGGAGAAAACGCGGCAAACGCCACAGCATCATC ATTGTCGCGGAAGGCGTGATGAGCGGCAACGAGTTTGCTGAACAATTGAAAAAAACCGGTGTGATCG GCGATACCCGCGTTTCTGTTCTCGGCCATATCCAGCGCGGCGGTTCTCCGACGGCATTTGACCGCGTG CTTGCAAGCCGCCTCGGCGCAAGGGCTGTTGAACTGCTGCTTGAAGGAAAAGGGGGCCGCGCTGTC GGCATTCAAAATAACCAGCTGGTTGACCACGATATCCTTGAGATTCTCGGAAAACCGCACGCCGTTAA TAAAAACATGTACAAGCTGTCGAAAGAATTGTCGATCTAA
SEQ ID NO.42(Pyk):ATGAAAAAAACCAAAATTGTATGTACAATCGGACCTGCCAGTGAAAGT GTGGAAATGCTTGAAAGATTAATGGCAAACGGGATGGATGTTTGCCGCCTGAACTTCTCGCACGGCA GCCATGAGGAACATCTTGCCCGGATTAAAAATATCCGTGAAGCTGCAAAAAACCAAAACAAAACGAT CGGGCTTCTGCTCGATACAAAGGGCCCGGAAATCCGCACCCATGATATGAAAGACGGCGGATTCGAG CTCGTTGAAGGCATGACACCGGTCATTTCAATGACAGAAGTGCTCGGGACACCGGAAAAATTTTCGG TCACATATGAAGGGCTGATTGATGATGTGCACGTTGGCTCTAAAATTTTACTTGATGACGGTTTGATTG AACTGGAAGTGACGGCCATCGATAAAAACGCCGGTGAAATCCATACAAAAGTGCTGAACCGCGGCGT TTTGAAAAACAAAAAAGGTGTTAACGTCCCGGGTGTTTCCGTGAACCTTCCGGGCATCACCGAAAAA GACGTGAGCGATATCCTGTTCGGGCTTGAACAAGGCATTGACTTCATTGCGGCTTCGTTTGTACGCCG GCCGTCCGACGTTTTGGAAATCCGCCAGCTCCTTGAAGAACACGATGCTTTGCATGTGAAAATTTTCC CTAAAATTGAAAACCAGGAAGGCGTCGACAATATCGATGAAATCCTTGCGGTATCAGACGGCTTAATGGTTGCCCGCGGCGACCTCGGCGTTGAAATTCCGACCGAAGCGGTGCCGCTCGTACAAAAAGAAATGA TCAGAAAATGTAATACGCTCGGCAAACCGGTGATTACCGCAACGCAAATGCTTGATTCGATGCAACGC AACCCGCGCCCGACCCGCGCGGAAGCAAGCGACGTGGCCAACGCCATTTTTGACGGCACGGATGCG ATCATGCTTTCCGGCGAAACGGCAGCCGGGAAATATCCTGCTGAAGCGGTTAAGACGATGTACAATAT TGCGGTTCATGTGGAAAAAGCAATTAACCATCGCGATATTCTGAACAAGCGCAGCAAGAGCACGGAC CATAATATGACAGACGCTATCTGCCAGTCCGTTGCCCATACGGCTTTAAATCTTGATGTGAATGCCATTA TTGCGCCGACTGAAAGCGGCTATACGGCACGCATGATCTCCAAATACCGCCCGGCGGCCCCAATCATT GCTGTCACGAGCGATCCGAAAGTACAACGCGGCTTAACTGTTGTGTCCGGCGTATACCCACAATTGGG CACAAAGGCAAACAATACGGATGAAATGCTTGAAATTGCAGTGGAGGAAGCGTTGAAATCCGAAATC GTCCATCACGGCGACCTTGTGATCATTACAGCAGGCGTCCCGGTTGGTGGGAAAGGCACCACCAACCTGATGAAAGTGCACCTGATCGGTGATATATTGGCAAAAGGCCAGGGAATCGGCAGAAAATCGGCATTC GGCCCGGTCATCGTTGCTGAAAGCCCTGAAGAAGCAAACGCAAAGGCAACAGAAGGTTGTGTGCTC GTCACGAGAACGACCGACAAAGAAATCATGCCGGCCATTGAAAAATGCGCCGCGCTGATTACGGAAG AAGGCGGCTTGACAAGCCATGCTGCAGTTGTTGGCATCAATGTCGGCATTCCGGTCATTGTTGGCGTT GAAAAAGCCGTTTCCATTTTTGAAGACGGGCAGGAAGTTACGGTAGATGCGGCAACCGGCTCGGTTT ACAACGGCCATGCGACTGTATTGTAA
SEQ ID NO.43(Ldhti):ATGAAAGTAATTTTTTTTTCTATGCACCCGTATGAAGAGGAATTTCTGGGTCCGATTCTGCCGTCTGACTGGGACGTAGAAATGACCCCGGACTTTCTGGACGAAACCACCGTGGA AAAGGCTAAAGGTGCCCAGGTAGTAAGCCTGTTTGTTTCTGACAAAGCTGATGGTCCGGTACTGGAA GCGCTGCATTCTTACGGTGTGGGCCTGCTGGCCCTGCGTTCTGCTGGCTATGATCACATCGATATTGAG ACCGCAAAACGCCTGGGTATCAAAGTAGTTAACGTGCCAGCCTATTCTCCGCACGCTATCGCTGACCA TACTCTGGCTATCATGCTGGCTCTGATTCGTCGTCTGCACCGTGCCCATGATAAAGTGCGCCTGGGTGA TTTTGATCTGGATGGTCTGATGGGCTTTGATCTGAACGGCAAAGTTGCTGGTGTAATTGGTCTGGGTAA AATCGGTCGCCTGGTAGCTACCCGCCTGAAAGCGTTTGGTTGCAAAGTTCTGGGCTATGATCCATACA TTCAGCCGGAAATCGTAGAAAACGTTGATCTGGATACCCTGATCACTCAGGCTGATATCATTTCTATTC ATTGTCCGCTGACCCGTGAAAACTTTCATATGTTTAACGAAGAGACTTTTAAGCGTATGAAACCGGGT GCTATTCTGGTTAACACCGCGCGTGGTGGTCTGATCGATACCAAGGCCCTGCTGGAGGCCCTGAAGTC TGGTAAACTGGGCGGCGCAGCCCTGGATGTGTATGAATATGAACGTGGCCTGTTTTTTAAAAACCACCAAAAAGAAGGTATCAAAGACCCGTATCTGGCCCAGCTGCTGGGTCTGGCCAACGTAGTGCTGACCGG TCATCAGGCCTTTCTGACCCGTGAGGCTGTAAAAAACATCGAAGAAACTACCGTAGAAAACATTCTG GAATGGCAAAAGAACCCGCAGGCAAAGCTGAAAAACGAAATCTAA
SEQ ID NO.44(GSald):
MKIGIPKEIKNNENRVAITPAGVMTLVKAGHDVYVETEAGAGSGFSDSEYEKAGAVIVPNAEDAWTAEMVLKVKEPLAEEFRYFRPGLILFTYLHLAAAEALTKALVEQKVVGIAYETVQLANGSLPLLTPMSEVAG RMSVQVGAQFLEKPHGGKGILLGGVPGVRRGKVTIIGGGTAGTNAAKIAVGLGSDVTILDINAERLRELD DLFGDHVTTLMSNSYHIAECVRESDLVVGAVLIPGAKAPKLVTEEMVRSMTPGSVLVDIAIDQGGIFETTD RVTTHDDPTYVKHGVVHYAVANMPGAVPRTSTFALTNVTIPYALQIANKGYRAACLDNPALLKGINTLDGHIVYEAVAAAHNMPYTDVHSLLHG
本发明的第一方面提供了一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法,包括如下步骤:
提供具有丙酮酸合成途径的起始菌;
进行步骤S200和S300对所述起始菌的基因组进行改造,构建两步法用基因工程菌株;或者,进行步骤S200、S300和S400,构建过表达丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌株;
S200:引入过表达的6-磷酸果糖激酶基因和丙酮酸激酶基因;
S300:引入过表达的热稳定的丙氨酸脱氢酶基因;
S400:所述起始菌的基因组中含有丙氨酸消旋酶基因,该步骤包括失活或缺失丙氨酸消旋酶基因(优选全部失活或全部缺失)丙氨酸消旋酶基因,再引入过表达的丙氨酸消旋酶基因。
应当理解的是,起始菌的基因组中含有丙氨酸消旋酶基因,并可表达该丙氨酸消旋酶基因,也即起始菌具有D-丙氨酸的合成途径。
在本发明的一些实施方案中,所述起始菌的基因组中含有丙氨酸消旋酶基因,所述的构建方法包括以下步骤:
S200:插入6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝;
S300:插入热稳定的丙氨酸脱氢酶基因,优选插入具有42℃~55℃热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因GSald;
S400:失活或缺失丙氨酸消旋酶基因(优选全部失活或全部缺失),再引入过表达的丙氨酸消旋酶基因。
本发明的第一方面构建得到的生产DL-丙氨酸的基因工程菌株可以在42℃以上(如42℃~55℃)的高温条件下发酵生产DL-丙氨酸。其中,步骤S200可实现过表达糖酵解途径的6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶,从而增强糖酵解途径,提升丙酮酸的供给,对提高DL-丙氨酸产量具有促进作用。步骤S300可引入热稳定性的丙氨酸脱氢酶基因,可增强从丙酮酸到DL-丙氨酸的合成途径,有效提供DL-丙氨酸产量。步骤S400可通过基因组改造实现光学纯DL-丙氨酸的高产,简化工艺、节约成本。上述手段的组合可实现高温条件下高产消旋型DL-丙氨酸的协同增效。
在本发明的一些实施方式中,所述起始菌还具有乳酸合成途径,且所述起始菌的基因组中含有乳酸脱氢酶基因;所述的构建方法还包括如下步骤:
S100:失活或缺失所述起始菌的基因组中的乳酸脱氢酶基因。
此时,对于存在乳酸合成途径的起始菌,通过步骤S100可阻断乳酸合成途径,从而增加丙酮酸合成途径的比例,实现DL-丙氨酸的增产。
在本发明的一些实施方式中,使起始菌中的乳酸脱氢酶基因失活或缺失,过表达起始菌中的6-磷酸果糖激酶基因和丙酮酸激酶基因,引入过表达的丙氨酸脱氢酶基因,使起始菌中的内源丙氨酸消旋酶基因失活或缺失,再另引入过表达的丙氨酸消旋酶基因。
在本发明的一些实施方式中,一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌中丙氨酸的合成和代谢途径示意图如图1所示。其中,碳源通过糖酵解途径转化为丙酮酸,随后丙酮酸消耗NADH和铵离子被丙氨酸脱氢酶催化生成L-丙氨酸。生成的L-丙氨酸一部分直接分泌到胞外,另一部分则被丙氨酸消旋酶催化形成D-丙氨酸,随后分泌到胞外。在起始菌中乳酸合成途径占据丙酮酸下游主要的碳通量情况下,阻断乳酸合成途径可使碳通量尽量流向丙氨酸合成途径。进一步地,过表达糖酵解途径的6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶可以增加糖酵解途径,使丙酮酸的供给提升,从而提升了丙氨酸产量。全部敲除内源丙氨酸消旋酶可阻断D-丙氨酸的原始合成途径,该途径表达强度低并且受到菌株内的表达调控系统控制,导致D-丙氨酸的产量低于L-丙氨酸,经重新过表达丙氨酸消旋酶,可进一步加强D-丙氨酸的合成及其可控性,从而可控制D-丙氨酸的产量与L-丙氨酸一致,得到消旋型的DL-丙氨酸。
在本发明的一些实施方式中,所述起始菌还具有D-乳酸合成途径,且所述起始菌的基因组中含有D-乳酸脱氢酶基因ldh
在本发明的一些实施方式中,步骤500中,所述D-乳酸脱氢酶基因ldh
在本发明的一些实施方式中,步骤200中,所述6-磷酸果糖激酶基因pfk的序列如SEQ ID NO.41所示,所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如SEQ ID NO.42所示。
在本发明的一些实施方式中,步骤S300中,所述丙氨酸脱氢酶基因的序列如SEQID NO.1所示。
在本发明的一些实施方式中,在步骤200和步骤300中,插入相关基因的方式为在染色体上增加该基因的拷贝(增加的拷贝数可以为1个或更多个),并在该基因前面串联启动子。在本发明的一些实施例中,所述启动子为P
应当理解,所述步骤S400中,失活或缺失的丙氨酸消旋酶基因是内源性基因。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S400中,失活或缺失丙氨酸消旋酶基因优选全部失活或全部缺少,比如全部敲除。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S400中,失活或缺失丙氨酸消旋酶基因的种类为一种、两种或更多种。优选地,全部失活或全部缺失至少一种内源丙氨酸消旋酶基因。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S400中,全部失活或全部缺失内源丙氨酸消旋酶基因alr1和alr2;优选地,所述内源丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.2所示,所述内源丙氨酸消旋酶基因alr2的序列SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S400中,过表达丙氨酸消旋酶基因的方式没有特别限定,包括但不限于插入强启动子、增加基因拷贝数、基因的序列优化等。
在本发明的一些实施方式中,所述步骤S400中,过表达丙氨酸消旋酶基因通过插入强启动子和丙氨酸消旋酶基因实现。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述强启动子的序列SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一些优选的实施方式中,插入的丙氨酸消旋酶基因为alr1或/和alr2;进一步地,所述丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.2所示,所述丙氨酸消旋酶基因alr2的序列SEQ ID NO.3所示
在本发明的一些实施方式中,对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100和步骤S200。此时,可以通过乳酸脱氢酶基因的失活或缺实现乳酸合成途径被阻断失,糖酵解途径通过6-磷酸果糖激酶基因pfk和丙酮酸激酶基因pyk的过表达被增强。优选地,对所述起始菌的基因组进行改造还包括步骤S300,此时,插入热稳定的丙氨酸脱氢酶基因,可实现L-丙氨酸的进一步增产。
在本发明的一些实施方式中,对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100、步骤S200、步骤S300和步骤S400。此时,使起始菌中的乳酸脱氢酶基因可实现阻断乳酸合成途径;过表达起始菌的6-磷酸果糖激酶基因和丙酮酸激酶基因可实现增强糖酵解途径,从而提升丙酮酸的供给;引入过表达的丙氨酸脱氢酶基因可增强从丙酮酸到L-丙氨酸的合成途径;进一步地,将起始菌中的内源丙氨酸消旋酶基因失活或缺失,并另引入过表达的丙氨酸消旋酶基因,,协同增效,得到的基因工程菌株可在高温条件下直接发酵生产消旋型DL-丙氨酸并实现高产量。
在本发明的一些实施方式中,对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤S100、步骤S200、步骤S300和步骤S400。将起始菌中的内源丙氨酸消旋酶基因全部失活或全部缺失,再控制另外引入的丙氨酸消旋酶基因的拷贝数,控制丙氨酸消旋酶基因的过表达,可实现消旋型DL-丙氨酸的可控高产。
在本发明的一些实施方式中,对所述起始菌的基因组进行改造包括步骤500和步骤200,此时,乳酸合成途径通过D-乳酸脱氢酶基因ldh
在本发明的一个较佳的实施例中,所述的构建方法包括如下步骤:
S500:全部失活或全部缺失所述起始菌的基因组中含有的乳酸脱氢酶基因,优选地,所述乳酸脱氢酶基因为D-乳酸脱氢酶基因ldh
S200:过表达6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk(从而增强糖酵解途径,提高丙酮酸的供给);
S300:过表达另外引入的丙氨酸脱氢酶基因GSald(实现增加从丙酮酸到L-丙氨酸的合成途径);和
S400:全部失活或全部缺失内源的丙氨酸消旋酶基因alr1和内源的丙氨酸消旋酶基因alr2,再过表达丙氨酸消旋酶基因alr1或/和丙氨酸消旋酶基因alr2。(可控制L-丙氨酸向D-丙氨酸的转变,有利于实现消旋型DL-丙氨酸的生产)。
在本发明的一些实施方式中,缺失相关基因的方式是敲除该基因。
在本发明的一些实施方式中,在步骤200和步骤300中,过表达相关基因的方式为在染色体上增加该基因的拷贝(增加的拷贝数可以为1个或更多个),并在该基因前面串联启动子。
在本发明的一个较佳的实施例中,所述的构建方法包括如下步骤:
S500:敲除所述起始菌的基因组中含有的乳酸脱氢酶基因,优选地,所述乳酸脱氢酶基因为D-乳酸脱氢酶基因ldh
S200:插入6-磷酸果糖激酶基因pfk的拷贝和丙酮酸激酶基因pyk的拷贝(可过表达起始菌中的6-磷酸果糖激酶pfk和丙酮酸激酶pyk,从而增强糖酵解途径,提高丙酮酸的供给);
S300:插入异源的丙氨酸脱氢酶基因GSald(可过表达异源的丙氨酸脱氢酶基因GSald,实现增加从丙酮酸到L-丙氨酸的合成途径);和
S400:敲除内源的丙氨酸消旋酶基因alr1和内源的丙氨酸消旋酶基因alr2,再插入丙氨酸消旋酶基因alr1或/和丙氨酸消旋酶基因alr2。(可控制L-丙氨酸向 D-丙氨酸的转变,有利于实现消旋型DL-丙氨酸的高产)。
在本发明的一些实施方式中,所述起始菌为嗜热菌。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为芽孢杆菌。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为地衣芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌是一种兼性厌氧、革兰氏阳性、内生孢子型的细菌,具有较快的生长速度和较广泛的底物谱,能够在50℃的条件下进行高温发酵。而且该菌株遗传操作方便稳定,还是美国食品和药物管理局公认的GRAS(generally regarded as safe)菌株,有潜力成为理想的平台菌株。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为地衣芽孢杆菌ATCC 14580 及其衍生菌株。所述衍生菌株的举例包括但不限于:地衣芽孢杆菌MW3、地衣芽孢杆菌BN11等。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11 Bacilluslicheniformis BN11,保藏号为CCTCC NO:M2016026,于2016年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址中国武汉武汉大学。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11,所述6- 磷酸果糖激酶基因pfk的序列如SEQ ID NO.41所示;所述丙酮酸激酶基因pyk的序列如SEQ IDNO.42所示。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11,所述丙氨酸脱氢酶基因GSald的序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11,其内源的丙氨酸消旋酶基因包括alr1和alr2,其中,丙氨酸消旋酶基因alr1的序列如SEQ ID NO.2所示,丙氨酸消旋酶基因alr2的序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一些优选的实施方式中,另外引入丙氨酸消旋酶基因包括alr1(SEQID NO.2)或alr2(SEQ ID NO.3)。
在本发明的一些实施方式中,在本发明的一些优选的实施方式中,所述起始菌为地衣芽孢杆菌BN11,所述D-乳酸脱氢酶基因ldh
应当理解,如无特别说明,本发明各方案中的多个特征的优选各自独立,可以采用合适的方式进行组合。
在本发明的第二方面,提供了本明的第一方面所述的构建方法制得的基因工程菌株,该基因工程菌株能够在42℃以上(如42℃~55℃)发酵生产DL-丙氨酸,可实现产量的显著提升,进一步地,还可以实现高产消旋型DL-丙氨酸。
在本发明的第三方面,提供了本发明的第二方面所述的基因工程菌株在生产DL-丙氨酸中的应用,可用于高温条件下发酵生产DL-丙氨酸,可显著提高产量,进一步地,可在高温条件下实现高产消旋型DL-丙氨酸。
在本发明的第四方面,提供了一种DL-丙氨酸的生产方法,对本发明的第二方面所述的基因工程菌株进行发酵培养,其中,发酵培养温度为42℃~55℃;所述发酵培养的方式可选自以下任一种:
两步法:采用所述两步法用基因工程菌株,所述的生产方法包括发酵培养步骤和丙氨酸消旋酶处理步骤;
直接发酵法:采用所述过表达丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌株,所述的生产方法包括发酵培养步骤,不包括额外的丙氨酸消旋酶处理步骤;
组合法:采用所述过表达丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌株,所述的生产方法包括发酵培养步骤,还包括丙氨酸消旋酶处理步骤,可更灵活地控制光学纯度。
可以理解地是,还可以基于两步法用基因工程菌株,再结合额外的丙氨酸消旋酶处理步骤控制丙氨酸的光学纯度,不过丙氨酸消旋酶的添加量明显大于采用过表达丙氨酸消旋酶基因的基因工程菌株,成本偏高。
在本发明的一些实施方式中,所述的生产方法在所述发酵培养步骤之前还进行种子培养得到活化的种子,然后将所述活化的种子接种到发酵培养基中进行所述发酵培养。
在本发明的一些实施方式中,所述种子培养步骤包括:将所述的基因工程菌株接种到种子培养基中,在种子培养温度为42℃~55℃的条件下培养,得到的种子培养液即活化的种子。
在本发明的一些实施方式中,所述种子培养基包含以下组分:蛋白胨、酵母粉和氯化钠。
在本发明的一些实施方式中,所述种子培养基由以下组分构成:蛋白胨、酵母粉和氯化钠。
发酵培养的温度举例包括但不限于42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、 49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃。
在本发明的一些实施方式中,所述发酵培养的步骤包括:将活化的种子接种到发酵培养基中,所述发酵培养基中包含碳源,在发酵培养温度为42℃~55℃的条件下进行分批补料发酵,培养至设定的发酵密度。进一步地,接种所述活化的种子的接种量,以体积百分比计,可以为3%~5%,举例如3%、4%、5%。
在本发明的一些实施方式中,在所述发酵培养步骤中,所述碳源为葡萄糖、甘油、木糖或阿拉伯糖。
在本发明的一些实施方式中,在所述发酵培养步骤中,所述发酵培养基包含以下成分:葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。在本发明的一些实施方式中,所述发酵培养基由以下成分组成:葡萄糖、酵母粉、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。
在本发明的一些实施方式中,所述设定的发酵密度可以通过OD
在本发明的一些实施方式中,在所述发酵培养步骤中,所述发酵培养步骤包括:使氨水调节pH为7.0左右,通气条件下,搅拌条件下进行发酵培养(第一段发酵培养) 至OD600值达到6.5~8.0,停止通气,降低搅拌速度继续发酵培养(第二段发酵培养) 至设定的发酵密度,结束发酵;在发酵过程中,所述碳源的浓度降到一定值时可补充所述碳源。
用于调节pH的氨水的浓度可以为20%~30%(v/v),具体举例如20%、25%、30%,以体积百分比计算。
所述通气条件,优选为通入空气。
通气的通气量可以为0.8vvm~1.2vvm,举例如0.9vvm、1.0vvm、1.1vvm、1.2vvm等。
发酵培养分段进行。可以分两段进行,包括通气条件下的第一段发酵培养,停止通气后的第二段发酵培养。通过第一段发酵培养,可使菌体快速生长,通过第二段发酵培养,可以实现高效生产L-丙氨酸。其中,第一段发酵培养时的搅拌速度优选280rpm~320rpm,举例如280rpm、290rpm、300rpm、310rpm、320rpm等。第一段发酵培养的时间根据OD600值确定,例如可以为6小时至8小时,具体举例如6h、6.5h、 7h、7.5h、8h。第二段发酵培养时的搅拌速度优选60rpm~100rpm,举例如60rpm、70rpm、 80rpm、90rpm、100rpm等。第二段发酵培养的时间也根据OD600值(比如1.2)确定,例如可以为50小时至70小时,具体举例如50h、55h、60h、65h、70h。
发酵过程中补充碳源的次数可以为一次、两次等。
关于发酵过程中补充碳源时的时点,比如碳源浓度下降到30g/L~50g/L时补充一次碳源,又比如,碳源浓度降到20g/L~40g/L时,还可以再补充一次碳源。优选地,所述碳源为葡萄糖。
在本发明的一些实施方式中,仅补充一次碳源时,以在所述碳源的浓度降到 30g/L~50g/L(举例如30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L)时,可以将碳源的浓度补充至80g/L~120g/L(举例如80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L)。优选地,所述碳源为葡萄糖。
在本发明的一些实施方式中,补充2次碳源。第一次补充碳源时,可以在所述碳源的浓度降到30g/L~50g/L(举例如30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L)时,可以将碳源的浓度补充至80g/L~120g/L(举例如80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120 g/L)。第二次补充碳源时,可以在所述碳源的浓度降到20g/L~40g/L(举例如20g/L、 25g/L、30g/L、35g/L、40g/L)时,可以将碳源的浓度补充至60g/L~80g/L(举例如 60g/L、65g/L、70g/L、75g/L、80g/L)。优选地,所述碳源为葡萄糖。
在本发明的一些实施方式中,在所述发酵培养步骤中,所述发酵培养步骤包括:使用20%~30%(v/v)的氨水调节pH为7.0±0.2,通气量为0.8vvm~1.2vvm,初始搅拌转速为280rpm~320rpm,进行发酵培养6~8小时至OD600值达到6.5~8.0,停止通气,调节搅拌转速为60rpm~100rpm,继续发酵培养到50小时~70小时(例如继续发酵培养到60小时),结束发酵;进一步地,发酵过程中在碳源浓度降低至一定值时补充该碳源,可以补充一次、两次等。在一些实施方式中,在发酵过程中仅补充一次碳源,所述碳源的浓度降到30g/L~50g/L时进行第一次补充所述碳源,至所述碳源的浓度为 80g/L~120g/L。在另一些实施方式中,在发酵过程中补充两次碳源,所述碳源的浓度降到30g/L~50g/L时进行第一次补充所述碳源,至所述碳源的浓度为80g/L~120g/L,然后,当所述碳源的浓度降到20g/L~40g/L时,第二次补充所述碳源,至所述碳源的浓度为60g/L~80g/L。优选地,所述碳源为葡萄糖。
在本发明的一些实施方式中,在所述发酵培养步骤中,所述碳源为葡萄糖;所述发酵培养步骤包括:使用25%的氨水调节pH使其维持7.0,通气量为1vvm,初始搅拌转速为300rpm。发酵培养6小时~8小时后地衣芽孢杆菌的OD
在本发明的一些实施方式中,所述丙氨酸消旋酶处理步骤中,所述丙氨酸消旋酶由纯化的丙氨酸消旋酶或/和过表达了所述丙氨酸消旋酶的编码序列的菌体提供。其中,过表达了所述丙氨酸消旋酶的编码序列的菌体可以提供相应的丙氨酸消旋酶。相应的宿主菌的种类没有特别限定,以不干扰DL-丙氨酸的合成路径为宜,包括但不限于大肠杆菌等。
消旋酶处理的温度优选高温(举例如:42℃~55℃)。_从工艺上和发酵条件一致可以简化操作。消旋酶处理的温度的举例包括但不限于:42℃、43℃、44℃、45℃、46 ℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃等。
消旋酶处理的时间以处理至光学纯度不再提升为宜,优选地,以处理至L-丙氨酸的光学纯度达到50%为宜。例如,处理时间可以为12h~24h,举例如12h、16h、18h、 24h等。
在本发明的一些实施方式中,所述丙氨酸消旋酶处理步骤包括:发酵培养结束后向发酵液直接添加适量丙氨酸消旋酶,50℃处理12h。进一步地,添加的丙氨酸消旋酶由过表达所述消旋酶基因的大肠杆菌提供。
以下结合本发明的实施例对本发明作进一步详细说明。下述实施例是说明性的,不是限定性的,不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明的实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中未注明具体条件的实验方法(比如 PCR扩增、转化、基因敲除、基因插入等),优选地按照上文的方法和条件进行;然后通常按照常规方法和条件,例如Sambrook等分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的方法和条件,或者按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
丙氨酸浓度测定方法:使用高效液相色谱法,称取0.54g的辛烷磺酸钠,加入到800mL超纯水中,用磷酸调节pH为2.1,加入100mL甲醇,用超纯水定容到1L体积,作为流动相。色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm,5μm),柱温30 ℃,流速0.8mL/min,进样量10μL,检测器为DAD检测器,波长210nm。待检样品为发酵样品,首先需要煮沸10min,随后8000rpm离心5min,吸取上清稀释到合适的倍数,至丙氨酸终浓度为0.2g/L~1g/L。
丙氨酸光学纯度测定方法:使用高效液相色谱法,流动相为2mM的硫酸铜水溶液。色谱柱为SUMICHIRAL OA-5000(150mm×4.6mm,5μm),柱温30℃,流速 0.5mL/min,进样量10μL,检测器为DAD检测器,波长254nm。待检样品为发酵样品,首先需要煮沸10min,随后8000rpm离心5min,吸取上清稀释到合适的倍数,至丙氨酸终浓度为0.2g/L~1g/L。
葡萄糖浓度测定方法:使用SBA-40D型生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)测定葡萄糖浓度。
以下实施例以地衣芽孢杆菌作为起始菌构建可以在高温条件下生产DL-丙氨酸的基因工程菌株。应当理解,以下实施例中生产DL-丙氨酸的基因工程菌株的构建方法也可以用于其它菌株(示例包括但不限于凝结芽孢杆菌、甲基营养芽孢杆菌、嗜热菊糖芽孢杆菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌等)作为起始菌,用来得到本发明中可以在高温条件下生产DL-丙氨酸的基因工程菌株。
PKVM载体:其结构如图4所示,其包含ampR(氨苄青霉素抗性基因)和ermC (红霉素抗性基因)两个抗生素抗性基因,以及编码半乳糖苷酶的bgaB基因,均可作为筛选标记;该质粒具有一个热敏型复制起始位点oriT pE194ts,还有在大肠杆菌和地衣芽孢杆菌的复制起始位点ori和oriT。
地衣芽孢杆菌BN11,是ATCC 14580为基础构建的乳酸生产菌株,保藏号为 CCTCCNO:M2016026,于2016年1月8日保藏于中国典型培养物保藏中心。
接种量:以体积百分比计。
如无特别说明,新插入的基因拷贝数为1个。
实施例1:敲除D-乳酸合成途径的地衣芽孢杆菌的构建
1.1.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物,分别以PKVM-XPDdldh-UpF(SEQ ID NO.5)和 XPDdldh-UpR(SEQ ID NO.6)、XPDdldh-DownF(SEQ ID NO.7)和 PKVM-XPDdldh-DownR(SEQ ID NO.8)为上下游引物,分别进行PCR扩增,分别得到ldh
1.2.将上述步骤1.1.得到的PCR产物进行纯化,然后以PKVM-XPDdldh-UpF 和PKVM-XPDdldh-DownR为引物进行重组PCR扩增,对PCR产物进行纯化后通过无缝克隆连接到PKVM载体,转化到大肠杆菌S17中得到S17-PKVMΔldh
1.3.将步骤1.2.得到的S17-PKVMΔldh
实施例2:过表达6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的地衣芽孢杆菌的构建
2.1.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物,分别以4580的基因组信息(GenBank No.NC_006270.3) 设计引物,分别以PKVM-XPDldh-UpF(SEQ ID NO.9)和P
2.2.将上述步骤2.1.得到的PCR产物进行纯化,然后以PKVM-XPDldh-UpF和 PKVM-XPDldh-DownR为引物进行重组PCR扩增,对PCR产物进行纯化后通过无缝克隆连接到PKVM载体,转化到大肠杆菌S17中得到S17-PKVM-PFYAK。
2.3.将上述步骤2.2得到的大肠杆菌S17-PKVM-PFYAK和地衣芽孢杆菌 BN11Δldh
实施例3:过表达异源的丙氨酸脱氢酶的菌株的构建
3.1.根据丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列通过BLAST方法在嗜热脂肪地芽孢杆菌基因组中挖掘潜在的热稳定性丙氨酸脱氢酶(其氨基酸序列如SEQ ID NO.44所示,蛋白序列编号对应WP_033014465.1),嗜热脂肪地芽孢杆菌来源的丙氨酸脱氢酶基因被命名为GSald,根据地衣芽孢杆菌基因组进行了密码子优化(优化后的序列如SEQ ID NO.1所示),并和P
3.2.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物,分别以PKVM-XPDdldh-UpF(SEQ ID NO.5)和 P
3.3.将上述步骤3.2.得到的PCR产物进行纯化,然后以PKVM-XPDdldh-UpF 和PKVM-XPDdldh-DownR为引物进行重组PCR扩增,对PCR产物进行纯化后分别通过无缝克隆连接到PKVM载体,转化到大肠杆菌S17中,得到S17-PKVM-GSald。然后,将大肠杆菌S17-PKVM-GSald和地衣芽孢杆菌 BN11Δldh
实施例4:敲除地衣芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因
4.1.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物,分别以PKVM-XPDalr1-UpF(SEQ ID NO.21)和 XPDalr1-UpR(SEQ ID NO.22)、XPDalr1-DownF(SEQ ID NO.23)和 PKVM-XPDalr1-DownR(SEQ ID NO.24)为上下游引物进行PCR扩增,得到alr1 基因上游同源臂片段和alr1基因下游同源臂片段。
4.2.将上述步骤4.1.得到的PCR产物进行纯化,然后以PKVM-XPDalr1-UpF 和PKVM-XPDalr1-DownR为引物进行重组PCR扩增,对PCR产物进行纯化,然后通过无缝克隆连接到PKVM载体,转化到大肠杆菌S17中,得到 S17-PKVMΔalr1。
4.3.将大肠杆菌S17-PKVMΔalr1和地衣芽孢杆菌BA-1按照实施例1中的方法进行接合转移和同源重组实验,得到敲除alr1基因的菌株,记为BA-1Δalr1。
4.4.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物,分别以PKVM-XPDalr2-UpF(SEQ ID NO.25)和 XPDalr2-UpR(SEQ ID NO.26)、XPDalr2-DownF(SEQ ID NO.27)和 PKVM-XPDalr2-DownR(SEQ ID NO.28)为上下游引物,进行PCR扩增,得到alr2 基因上游同源臂片段和alr2基因下游同源臂片段。
4.5.将上述步骤4.4.中得到的PCR产物进行纯化,然后以PKVM-XPDalr2-UpF 和PKVM-XPDalr2-DownR为引物进行重组PCR扩增,对PCR产物进行纯化,然后通过无缝克隆连接到PKVM载体,转化到大肠杆菌S17中得到S17-PKVMΔalr2。
4.6.将大肠杆菌S17-PKVMΔalr2和地衣芽孢杆菌BA-1Δalr1按照实施例1中的方法进行接合转移和同源重组实验,得到同时敲除alr1和alr2基因的菌株,记为BLA-1。
实施例5.过表达丙氨酸消旋酶的菌株的构建
5.1.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3),识别出地衣芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶基因,分别被命名为alr1(SEQ ID NO.2)和alr2(SEQID NO.3)。根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No.NC_006270.3)设计引物,分别以PKVM-XPDPdh-UpF(SEQ ID NO.29)和Pals-XPDPdh-UpR(SEQ ID NO.30)、XPDPdhUp-Pals-F(SEQ ID NO.31) 和Alr1-Pals-R(SEQ ID NO.32)、Pals-alr1-F(SEQ IDNO.33)和 XPDPdhDown-alr1-R(SEQ ID NO.34)、Alr1-XPDPdh-DownF(SEQ ID NO.35) 和PKVM-XPDPdh-DownR(SEQ ID NO.36)为上下游引物PCR扩增得到pdh基因上游同源臂片段、P
5.2.将上述步骤5.1.中得到的PCR产物进行纯化,然后以PKVM-XPDPdh-UpF 和PKVM-XPDPdh-DownR为引物进行重组PCR扩增,对PCR产物进行纯化,然后后分别通过无缝克隆连接到PKVM载体,转化到大肠杆菌S17中得到 S17-PKVM-Palr1。将大肠杆菌S17-PKVM-Palr1和地衣芽孢杆菌BLA-1按照实施例1中的方法进行接合转移和同源重组实验,得到过表达alr1的菌株,记为 BDLA-1。
5.3.根据地衣芽孢杆菌ATCC 14580的基因组信息(GenBank No. NC_006270.3)设计引物,分别以PKVM-XPDPdh-UpF(SEQ ID NO.29)和 Pals-XPDPdh-UpR(SEQ ID NO.30)、XPDPdhUp-Pals-F(SEQ ID NO.31)和 Alr2-Pals-R(SEQ ID NO.37)、Pals-alr2-F(SEQ IDNO.38)和XPDPdhDown-alr2-R (SEQ ID NO.39)、Alr2-XPDPdh-DownF(SEQ ID NO.40)和PKVM-XPDPdh-DownR(SEQ ID NO.36)为上下游引物进行PCR扩增,得到pdh 基因上游同源臂片段、P
5.4.将上述步骤5.3.得到的PCR产物进行纯化,然后以PKVM-XPDPdh-UpF 和PKVM-XPDPdh-DownR为引物进行重组PCR扩增,对PCR产物进行纯化,然后分别通过无缝克隆连接到PKVM载体,转化到大肠杆菌S17中得到S17-PKVM-Palr2。对大肠杆菌S17-PKVM-Palr2和地衣芽孢杆菌BLA-1按照实施例1中的方法进行接合转移和同源重组实验,得到过表达alr2的菌株,记为 BDLA-2。
实施例6:重组地衣芽孢杆菌BDLA-1在42℃进行分批补料发酵(5L发酵罐)
6.1.种子培养基和发酵培养基
种子培养基配方:LB培养基,酵母粉5g/L,胰蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L。
发酵培养基配方:葡萄糖100g/L,酵母粉5g/L,硫酸铵5g/L,三水合磷酸氢二钾1.3g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,七水合硫酸镁0.5g/L,七水合硫酸亚铁20mg/L,四水合硫酸锰20mg/L。其中,对葡萄糖单独灭菌,115℃灭菌20min。
6.2.种子培养
从甘油管转接BDLA-1到装有5mL的LB培养基的摇管中,50℃200rpm振荡培养12h。随后按照3%~5%的接种量转接到装有150mL的LB培养基的500mL三角瓶中,50℃200rpm振荡培养12h,得到种子液(也即活化的种子)。该步骤实现了种子的活化。
6.3.发酵培养
将步骤6.2.得到的种子液按照体积比5%的接种量转接到装有发酵培养基的5L发酵罐中,使得装液量达到3L。用25%(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0,通气(通入空气),通气量为1.0vvm,温度42℃,搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6~8 小时后地衣芽孢杆菌的OD
实施例7:重组地衣芽孢杆菌BDLA-1在50℃进行分批补料发酵(5L发酵罐)
7.1.种子培养基和发酵培养基
同实施例6.1.。
7.2.种子培养
同实施例6.2.。
7.3.发酵培养
将步骤7.2.得到的种子液按照体积比5%的接种量转接到装有发酵培养基的5L发酵罐中,使得装液量达到3L。用25%(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0,通气量为 1.0vvm,温度50℃,搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6~8小时后地衣芽孢杆菌的OD
实施例8:重组地衣芽孢杆菌BDLA-1在55℃进行分批补料发酵(5L发酵罐)
8.1.种子培养基和发酵培养基
同实施例6.1.。
8.2.种子培养
同实施例6.2.。
8.3.发酵培养
将步骤8.2.得到的种子液按照体积比5%的接种量转接到装有发酵培养基的5L发酵罐中,使得装液量达到3L。用25%(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0,通气量为 1.0vvm,温度55℃,搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6~8小时后地衣芽孢杆菌的OD
实施例9:重组地衣芽孢杆菌BDLA-1在42℃进行分批补料发酵(50L发酵罐)
9.1.种子培养基和发酵培养基
同实施例6.1.。
9.2.种子培养
从甘油管转接BDLA-1到装有5mL的LB培养基的摇管中,50℃、200rpm振荡培养12h。随后按照体积比3%~5%的接种量转接到装有150mL的LB培养基的 500mL三角瓶中,50℃、200rpm振荡培养12h。最后按照体积3%~5%的接种量转接到装有1.5L的LB培养基的5L三角瓶中,50℃、200rpm振荡培养12h。
9.3.发酵培养
将步骤9.2.得到的种子液按照体积比5%的接种量转接到装有发酵培养基的 50L发酵罐中,使得装液量达到30L。用25%(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0,通气量为1.0vvm,温度42℃,搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6~8小时后地衣芽孢杆菌的OD
实施例10:重组地衣芽孢杆菌BDLA-1在50℃进行分批补料发酵(50L发酵罐
10.1中的种子培养基和发酵培养基
同实施例6.1.。
10.2.种子培养
同实施例9.2.。
10.3.发酵培养
将步骤10.2.得到的种子液按照体积比5%的接种量转接到装有发酵培养基的50L发酵罐中,使得装液量达到30L。用25%(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0,通气量为1.0vvm,温度50℃,搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6~8小时后,地衣芽孢杆菌的OD
实施例11:重组地衣芽孢杆菌BDLA-1在55℃进行的分批补料发酵(50L发酵罐)
11.1.种子培养基和发酵培养基
同实施例6.1.。
11.2.种子培养
同实施例9.2.。
11.3.发酵培养
将步骤11.2得到的种子液按照体积比5%的接种量转接到装有发酵培养基的 50L发酵罐中,使得装液量达到30L。用25%(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0,通气量为1.0vvm,温度55℃,搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6-8小时后,地衣芽孢杆菌的OD
实施例12:重组地衣芽孢杆菌BDLA-2在50℃进行分批补料发酵(5L发酵罐)
12.1.种子和发酵培养基
同实施例6.1。
12.2.种子培养
从甘油管转接BDLA-2到装有5mL的LB培养基的摇管中,50℃200rpm振荡培养12h。随后按照体积比3%~5%的接种量转接到装有150mL的LB培养基的 500mL三角瓶中,50℃200rpm振荡培养12h,得到种子液。
12.3.发酵培养
将步骤12.2.中得到的种子液按照体积比5%的接种量转接到装有发酵培养基的5L发酵罐中,使得装液量达到3L。用25%(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0,通气量为1.0vvm,温度50℃,搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6-8小时后,地衣芽孢杆菌的OD
实施例13:重组地衣芽孢杆菌BA-1在50℃两步法生产DL-丙氨酸(5L发酵罐)
13.1.种子和发酵培养基
同实施例6.1。
13.2.种子培养
从甘油管转接BA-1到装有5mL的LB培养基的摇管中,50℃、200rpm振荡培养12h。随后按照体积比3%~5%的接种量转接到装有150mL的LB培养基的 500mL三角瓶中,50℃、200rpm振荡培养12h,得到种子液。
13.3.发酵培养
将步骤13.2.中得到的种子液按照体积比5%的接种量转接到装有发酵培养基的5L发酵罐中,使得装液量达到3L。用25%(v/v)的氨水控制发酵pH为7.0,通气量为1.0vvm,温度50℃,搅拌转速为300rpm。进行发酵培养6~8小时,然后地衣芽孢杆菌的OD
实施例14.实施例2构建的BN11Δldh
参考实施例7的方法和实验参数对实施例2得到的BN11Δldh
结果发现:1、丙氨酸产量64g/L;2、得到的产物是L型和D型的混合产品, L-丙氨酸的光学纯度仅67.7%,无法达到消旋型要求。
实施例15.实施例3构建的BA-1菌株的发酵培养结果
采用实施例7的方法和实验参数对实施例3得到的BA-1菌株进行直接发酵培养。
结果发现:1、丙氨酸产量129g/L;2、得到的产物是L型和D型的混合产品, L型丙氨酸的光学纯度为70.8%,无法达到消旋型要求。
综合实施例14和实施例15的结果表明,敲除地衣芽孢杆菌的丙氨酸消旋酶是本发明中实现直接发酵法生产消旋型DL-丙氨酸所必需。
实施例16.仅敲除一个丙氨酸消旋酶
参考实施例4的方法仅敲除丙氨酸消旋酶alr1(SEQ ID NO.29)、敲除丙氨酸消旋酶alr2(SEQ ID NO.30)中的一个,参考实施例7的方法对构建得到的菌株进行直接发酵培养。
结果发现,无法达到消旋型要求。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110>安徽丰原生物技术股份有限公司
<120>一种生产DL-丙氨酸的基因工程菌株及其构建方法和应用
<130>2021
<160>44
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>1119
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
atgaaaatcg gcatcccgaa agaaatcaaa aacaacgaaa accgcgtcgc gatcacgccg60
gcgggcgtca tgacgctggt caaagcgggc catgacgtct atgtcgaaac ggaagcgggc 120
gcgggcagcg gctttagcga cagcgaatat gaaaaagcgg gcgcggtcat cgtcccgaac 180
gcggaagacg cgtggacggc ggaaatggtc ctgaaagtca aagaaccgct ggcggaagaa 240
tttcgctatt ttcgcccggg cctgatcctg tttacgtatc tgcatctggc ggcggcggaa 300
gcgctgacga aagcgctggt cgaacagaaa gtcgtcggca tcgcgtatga aacggtccag 360
ctggcgaacg gcagcctgcc gctgctgacg ccgatgagcg aagtcgcggg ccgcatgagc 420
gtccaggtcg gcgcgcagtt tctggaaaaa ccgcatggcg gcaaaggcat cctgctgggc 480
ggcgtcccgg gcgtccgccg cggcaaagtc acgatcatcg gcggcggcac ggcgggcacg 540
aacgcggcga aaatcgcggt cggcctgggc agcgacgtca cgatcctgga catcaacgcg 600
gaacgcctgc gcgaactgga cgacctgttt ggcgaccatg tcacgacgct gatgagcaac 660
agctatcata tcgcggaatg cgtccgcgaa agcgacctgg tcgtcggcgc ggtcctgatc 720
ccgggcgcga aagcgccgaa actggtcacg gaagaaatgg tccgcagcat gacgccgggc 780
agcgtcctgg tcgacatcgc gatcgaccag ggcggcatct ttgaaacgac ggaccgcgtc 840
acgacgcatg acgacccgac gtatgtcaaa catggcgtcg tccattatgc ggtcgcgaac 900
atgccgggcg cggtcccgcg cacgagcacg tttgcgctga cgaacgtcac gatcccgtat 960
gcgctgcaga tcgcgaacaa aggctatcgc gcggcgtgcc tggacaaccc ggcgctgctg1020
aaaggcatca acacgctgga cggccatatc gtctatgaag cggtcgcggc ggcgcataac1080
atgccgtata cggacgtcca tagcctgctg catggctaa 1119
<210>2
<211>1173
<212>DNA
<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400>2
atgatgagct taaaaccatt ctatagaaag acatgggccg aaatcgattt aacggcttta60
aaagaaaacg tccgcaatat gaagcggcac atcggcgagc atgtccgcct gatggccgtc 120
gttaaagcga atgcctacgg acacggggat gcacaggtag cgaaggcggc tcttgcagaa 180
ggggcgtcca ttcttgctgt ggctttattg gatgaagcgc tttcgctgag ggcgcagggg 240
attgaagaac cgattcttgt cctcggtgca gtgccgaccg aatatgcaag cattgccgcg 300
gaaaagcgca ttatcgtgac tggctactcc gtcggctggc tgaaagacgt gctcggtttt 360
ctgaatgagg ccgaagctcc tcttgaatat catttgaaga tcgacacggg catgggccgc 420
cttggctgca aaacggaaga agagatcaaa gaaatgatgg agatgaccga atcgaacgat 480
aagctcaatt gtacgggcgt gttcactcat ttcgccacgg cggacgaaaa ggacaccgat 540
tatttcaaca tgcagcttga ccgctttaaa gagctgatca gccccctccc gcttgaccgt 600
ttgatggtgc attcgtcaaa cagcgccgcg ggtctgcgct tcagggaaca gctatttaat 660
gccgtccgct tcggcatcgg catgtacggt ttggcgccgt caaccgaaat aaaagacgag 720
ctgccgtttc gtctgcggga agtgttttcg cttcataccg aactcaccca tgtgaaaaaa 780
attaaaaaag gcgagagcgt cagctacggg gcgacatata cagctcagcg cgacgaatgg 840
atcgggacag tccccgtcgg gtatgccgac ggatggctga ggcgcctggc cggaacggaa 900
gtgctgatcg acggaaaacg ccaaaaaata gcagggagaa tctgcatgga ccagttcatg 960
atttcccttg ccgaagaata ccctgtcggc acaaaggtta ccttgatcgg aaagcaaaaa1020
gacgaatgga tctcagtcga cgaaatcgcc caaaatttgc agacgatcaa ttatgaaatt1080
acctgtatga taagttcaag ggtgccccgt atgtttttgg aaaatgggag tataatggaa1140
ataaggaatc cgatcttgcc tgatcaatcc tga 1173
<210>3
<211>1182
<212>DNA
<213>地衣芽孢杆菌(acillus licheniformis)
<400>3
atgaaaaagc tttgccgtga agtttgggta gaggtaaatc ttgatgcgat caaaaaaaat60
ttgcgcgcgt ttcggcggca tattccgaaa aagagcaaaa ttatggctgt cgtaaaagcg 120
aatgcttatg gtcacggatc ggtggaagtt gcacgccatg cacttgaaca tggtgcgagt 180
gagctcgccg ttgcctcggt ggaggaagcg gtcgttttac gaaaagcggg gattaaagcg 240
ccgatccttg tgcttggttt caccccgctg agctgtgtga aagaagcggc agcttggaat 300
atatcgttat cagcttttca agttgactgg attaaagaag cgaacgagat attggaaaat 360
gaagcagatc ctaaccggct ggctgttcat atcaatgtgg ataccggcat ggggcgttta 420
ggtgtacgaa caaaggaaaa gcttttagca atcgtggaag cgctgacggc aagtgaaaac 480
ctcgaatggg aaggaatttt tacgcatttt tccacagctg acgaaccgga tactgagcta 540
accatgattc aacacgaaaa gtttatcagc tttcttcgct ttctgaaaga acaaggcttt 600
aagctgccta cggtgcatat gaacaatacg gccgcggcga tcgcttttcc ggaattcagc 660
gctgatatga ttcgcttagg catcggaatg tatggattat atccttccga ttatatcagg 720
cagcttaatc tcgttaagct tgtgcctgca ctaagcttga aggcgcgaat cgcttatgtg 780
aaaaccatgt tgactgaacc gcggacggtt agttatggtg ctacatatgt tgcagagcgc 840
ggggaagtca ttgccacaat tccggtcggc tatgctgacg gctattcccg tgaactttcc 900
aaccgcggtt ttattcttca tcgaggaaga cgagtgccgg tggcgggaag agtaacaatg 960
gatatgataa tggtcagtct gggagagggt gaaggtaaac aaggagagga agtcgtgatt1020
tacggccggc aaaagggagc agagatatct gttgatgaaa ttgcggaaat gcttgatacg1080
atcaactatg aagtggtatc taccataagc tggcgcgtcc ctcgttttta tataagagac1140
ggcgagattt ttaaaaagtc gaccccgctg ttatacgtgt ag 1182
<210>4
<211>300
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
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atgttcagcc gaagagctgc ttttccgaaa tgcagttctt cggcaacaac cataaaataa 120
cgaagatggc gcagctccat taatcactca ttcctttctg aatgcgattt cagtcgtttt 180
acatattaat tgtaagacaa agaagtattg gaaaacaatt tccacaagat gtatatttaa 240
taatacaata attttattaa aaattcattg taaatgaatg aaaatggagg agtgagggct 300
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<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
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<212>DNA
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tccagcctcg cgtcgggcga tatcgtcccc ataacaacgg aatcatc47
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<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>28
ccatggtacc cgggagctcg aattctaaaa tgaaggtggt ccgggat47
<210>29
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>29
cctcgcgtcg ggcgatatcg gatccaagtg aaaggcgaag agcaaac47
<210>30
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>30
aataggcgtc accttttatt ttacaacgtg gatcggc 37
<210>31
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>31
cacgttgtaa aataaaaggt gacgcctatt tcactttct 39
<210>32
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>32
ttttaagctc atcatagccc tcactcctcc attttc36
<210>33
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>33
ggaggagtga gggctatgat gagcttaaaa ccattctata gaa43
<210>34
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>34
gagggggttt ttgattcagg attgatcagg caagatc 37
<210>35
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>35
cctgatcaat cctgaatcaa aaaccccctc tgcag 35
<210>36
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>36
ccatggtacc cgggagctcg aattcatatt attgtgccga ac 42
<210>37
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>37
gcaaagcttt ttcatagccc tcactcctcc attttc36
<210>38
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>38
ggaggagtga gggctatgaa aaagctttgc cgtgaa36
<210>39
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>39
gagggggttt ttgatctaca cgtataacag cggggtc 37
<210>40
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>40
ctgttatacg tgtagatcaa aaaccccctc tgcag 35
<210>41
<211>963
<212>DNA
<213>凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
<400>41
atgaagcgaa ttggagtatt gacaagcggc ggcgatgcac cggggatgaa tgcggcggtc60
cgcgcgattg cccgtaaagg gatttatcac ggcctggaag tttacggcat tcgccaaggt 120
tataacggat tgattcaagg aaacatccaa aagctcgaag caggatctgt tggcgatatt 180
ctccagcggg gcggcacggt tttgcagtcg gcaagaagcg aagaattcaa aacgccggaa 240
gggcagcaaa aagcgatcag gcagctgaaa gaccatggca ttgaagcgct cgttgtgatc 300
ggcggcgacg gttcctacca aggggccaaa aagttgacgg aacagggctt taactgcatt 360
ggtgtgccag ggacaatcga taacgacatc ccggggacgg attttacaat cggttttgat 420
acggcattga acacagtgct tgatgcgatt gataaaattc gcgacaccgc ttcttcccac 480
gaacgcacct ttattattga agtcatgggc agaaatgccg gggatatcgc gctctggtcc 540
ggcctggccg gcggagccga atcgattatt attccggaag aaaaatatga cttaaaagat 600
gtcgtggagc gtcttgaaca ggggagaaaa cgcggcaaac gccacagcat catcattgtc 660
gcggaaggcg tgatgagcgg caacgagttt gctgaacaat tgaaaaaaac cggtgtgatc 720
ggcgataccc gcgtttctgt tctcggccat atccagcgcg gcggttctcc gacggcattt 780
gaccgcgtgc ttgcaagccg cctcggcgca agggctgttg aactgctgct tgaaggaaaa 840
gggggccgcg ctgtcggcat tcaaaataac cagctggttg accacgatat ccttgagatt 900
ctcggaaaac cgcacgccgt taataaaaac atgtacaagc tgtcgaaaga attgtcgatc 960
taa 963
<210>42
<211>1761
<212>DNA
<213>凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)
<400>42
atgaaaaaaa ccaaaattgt atgtacaatc ggacctgcca gtgaaagtgt ggaaatgctt60
gaaagattaa tggcaaacgg gatggatgtt tgccgcctga acttctcgca cggcagccat 120
gaggaacatc ttgcccggat taaaaatatc cgtgaagctg caaaaaacca aaacaaaacg 180
atcgggcttc tgctcgatac aaagggcccg gaaatccgca cccatgatat gaaagacggc 240
ggattcgagc tcgttgaagg catgacaccg gtcatttcaa tgacagaagt gctcgggaca 300
ccggaaaaat tttcggtcac atatgaaggg ctgattgatg atgtgcacgt tggctctaaa 360
attttacttg atgacggttt gattgaactg gaagtgacgg ccatcgataa aaacgccggt 420
gaaatccata caaaagtgct gaaccgcggc gttttgaaaa acaaaaaagg tgttaacgtc 480
ccgggtgttt ccgtgaacct tccgggcatc accgaaaaag acgtgagcga tatcctgttc 540
gggcttgaac aaggcattga cttcattgcg gcttcgtttg tacgccggcc gtccgacgtt 600
ttggaaatcc gccagctcct tgaagaacac gatgctttgc atgtgaaaat tttccctaaa 660
attgaaaacc aggaaggcgt cgacaatatc gatgaaatcc ttgcggtatc agacggctta 720
atggttgccc gcggcgacct cggcgttgaa attccgaccg aagcggtgcc gctcgtacaa 780
aaagaaatga tcagaaaatg taatacgctc ggcaaaccgg tgattaccgc aacgcaaatg 840
cttgattcga tgcaacgcaa cccgcgcccg acccgcgcgg aagcaagcga cgtggccaac 900
gccatttttg acggcacgga tgcgatcatg ctttccggcg aaacggcagc cgggaaatat 960
cctgctgaag cggttaagac gatgtacaat attgcggttc atgtggaaaa agcaattaac1020
catcgcgata ttctgaacaa gcgcagcaag agcacggacc ataatatgac agacgctatc1080
tgccagtccg ttgcccatac ggctttaaat cttgatgtga atgccattat tgcgccgact1140
gaaagcggct atacggcacg catgatctcc aaataccgcc cggcggcccc aatcattgct1200
gtcacgagcg atccgaaagt acaacgcggc ttaactgttg tgtccggcgt atacccacaa1260
ttgggcacaa aggcaaacaa tacggatgaa atgcttgaaa ttgcagtgga ggaagcgttg1320
aaatccgaaa tcgtccatca cggcgacctt gtgatcatta cagcaggcgt cccggttggt1380
gggaaaggca ccaccaacct gatgaaagtg cacctgatcg gtgatatatt ggcaaaaggc1440
cagggaatcg gcagaaaatc ggcattcggc ccggtcatcg ttgctgaaag ccctgaagaa1500
gcaaacgcaa aggcaacaga aggttgtgtg ctcgtcacga gaacgaccga caaagaaatc1560
atgccggcca ttgaaaaatg cgccgcgctg attacggaag aaggcggctt gacaagccat1620
gctgcagttg ttggcatcaa tgtcggcatt ccggtcattg ttggcgttga aaaagccgtt1680
tccatttttg aagacgggca ggaagttacg gtagatgcgg caaccggctc ggtttacaac1740
ggccatgcga ctgtattgta a1761
<210>43
<211>978
<212>DNA
<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400>43
atgaaagtaa tttttttttc tatgcacccg tatgaagagg aatttctggg tccgattctg60
ccgtctgact gggacgtaga aatgaccccg gactttctgg acgaaaccac cgtggaaaag 120
gctaaaggtg cccaggtagt aagcctgttt gtttctgaca aagctgatgg tccggtactg 180
gaagcgctgc attcttacgg tgtgggcctg ctggccctgc gttctgctgg ctatgatcac 240
atcgatattg agaccgcaaa acgcctgggt atcaaagtag ttaacgtgcc agcctattct 300
ccgcacgcta tcgctgacca tactctggct atcatgctgg ctctgattcg tcgtctgcac 360
cgtgcccatg ataaagtgcg cctgggtgat tttgatctgg atggtctgat gggctttgat 420
ctgaacggca aagttgctgg tgtaattggt ctgggtaaaa tcggtcgcct ggtagctacc 480
cgcctgaaag cgtttggttg caaagttctg ggctatgatc catacattca gccggaaatc 540
gtagaaaacg ttgatctgga taccctgatc actcaggctg atatcatttc tattcattgt 600
ccgctgaccc gtgaaaactt tcatatgttt aacgaagaga cttttaagcg tatgaaaccg 660
ggtgctattc tggttaacac cgcgcgtggt ggtctgatcg ataccaaggc cctgctggag 720
gccctgaagt ctggtaaact gggcggcgca gccctggatg tgtatgaata tgaacgtggc 780
ctgtttttta aaaaccacca aaaagaaggt atcaaagacc cgtatctggc ccagctgctg 840
ggtctggcca acgtagtgct gaccggtcat caggcctttc tgacccgtga ggctgtaaaa 900
aacatcgaag aaactaccgt agaaaacatt ctggaatggc aaaagaaccc gcaggcaaag 960
ctgaaaaacg aaatctaa 978
<210>44
<211>372
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>44
Met Lys Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val
1 5 1015
Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Met Thr Leu Val Lys Ala Gly His Asp
202530
Val Tyr Val Glu Thr Glu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Phe Ser Asp Ser
354045
Glu Tyr Glu Lys Ala Gly Ala Val Ile Val Pro Asn Ala Glu Asp Ala
505560
Trp Thr Ala Glu Met Val Leu Lys Val Lys Glu Pro Leu Ala Glu Glu
65707580
Phe Arg Tyr Phe Arg Pro Gly Leu Ile Leu Phe Thr Tyr Leu His Leu
859095
Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Lys Ala Leu Val Glu Gln Lys Val Val
100 105 110
Gly Ile Ala Tyr Glu Thr Val Gln Leu Ala Asn Gly Ser Leu Pro Leu
115 120 125
Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ser Val Gln Val Gly
130 135 140
Ala Gln Phe Leu Glu Lys Pro His Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Gly
145 150 155 160
Gly Val Pro Gly Val Arg Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly
165 170 175
Thr Ala Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ser Asp
180 185 190
Val Thr Ile Leu Asp Ile Asn Ala Glu Arg Leu Arg Glu Leu Asp Asp
195 200 205
Leu Phe Gly Asp His Val Thr Thr Leu Met Ser Asn Ser Tyr His Ile
210 215 220
Ala Glu Cys Val Arg Glu Ser Asp Leu Val Val Gly Ala Val Leu Ile
225 230 235 240
Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Val Arg Ser
245 250 255
Met Thr Pro Gly Ser Val Leu Val Asp Ile Ala Ile Asp Gln Gly Gly
260 265 270
Ile Phe Glu Thr Thr Asp Arg Val Thr Thr His Asp Asp Pro Thr Tyr
275 280 285
Val Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala
290 295 300
Val Pro Arg Thr Ser Thr Phe Ala Leu Thr Asn Val Thr Ile Pro Tyr
305 310 315 320
Ala Leu Gln Ile Ala Asn Lys Gly Tyr Arg Ala Ala Cys Leu Asp Asn
325 330 335
Pro Ala Leu Leu Lys Gly Ile Asn Thr Leu Asp Gly His Ile Val Tyr
340 345 350
Glu Ala Val Ala Ala Ala His Asn Met Pro Tyr Thr Asp Val His Ser
355 360 365
Leu Leu His Gly
370
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