一种具有抗银屑病作用的中药活性物质组合物及其乳膏剂的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药活性物质组合物及其乳膏剂的制备方法和用途，特别涉及一种具有抗银屑病作用的中药活性物质组合物及其乳膏剂的制备方法和应用。

背景技术

银屑病，俗称“牛皮癣”，其以表皮角质形成细胞过度增殖、真皮微血管增生和炎症细胞浸润为主要病理特征，是一种多因素参与、多阶段发展的慢性炎症性皮肤病，临床上主要表现出以皮肤呈现红斑、鳞屑和炎性浸润增厚为特征的皮损现象。根据临床表型的不同，银屑病又分为寻常型、脓疱型、关节病型和红皮病型，其中以寻常型银屑病最为普遍。

目前针对银屑病皮损的外用药治疗以维A酸类、维生素D3类似物、糖皮质激素类药物为主，其中维A酸类、维生素D3类似物药物能抑制表皮角质形成细胞过度增殖，糖皮质激素类药物能抑制过度炎症反应。但这些外用药均存在不同程度的副作用，如皮肤刺激性、不能长期用药等，尤其是长期应用糖皮质激素类药物会引起皮肤萎缩、毛细血管扩张等问题。因此，开发出一种皮肤适应性好、副作用小、疗效明显、可作用于多环节过程并能长期使用的非激素类外用药物显得尤为重要。

中药及其活性物质具有毒性相对较低、副作用较小的特点，适合长期用药，尤其在慢性炎症性疾病治疗中展现出广阔的应用前景。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供一种具有抗银屑病作用的中药活性物质组合物。

本发明另一目的是提供所述具有抗银屑病作用的中药活性物质组合物的乳膏剂制备方法。

本发明另一目的是提供所述具有抗银屑病作用的中药活性物质组合物的用途。

本发明针对银屑病表现出的外在皮损症状，为了开发出一种皮肤适应性好、副作用小、疗效明显、可作用于多环节过程并能长期使用的外用药物。该组合物由黄芩主要活性成分黄芩苷和肉苁蓉主要活性成分松果菊苷配伍得到，药理研究表明这2个活性成分可分别调控银屑病皮损发展的不同病理过程(抑制炎症浸润、抑制血管增生)，从而发挥协同改善银屑病皮损的作用。

黄芩苷是中药黄芩的主要活性成分，具有显著的抗炎、抗过敏、抗氧化作用。松果菊苷是中药肉苁蓉的主要活性成分，也是天然药用植物紫锥花(又名紫锥菊、松果菊)的主要活性成分，具有显著的抗氧化、抗血管新生、抗炎作用。

中药活性成分之间的配伍组合可以发挥协同增效的作用。通过黄芩主要活性成分黄芩苷和肉苁蓉主要活性成分松果菊苷的配伍组合来协同调控银屑病皮损发展的多个病理环节，目前尚未见相关研究报道。

具体地，

(1)本发明所应用的黄芩苷和松果菊苷是药用植物来源的天然活性成分，现有研究证实其药理作用明显且对细胞基本无毒性。相较于糖皮质激素类药物成分、维A酸类药物成分、维生素D3类似物药物成分，这2种天然植物活性成分安全性更高，对皮肤几乎无刺激性；

(2)本发明根据黄芩苷和松果菊苷的理化性质，采用乳膏剂型的基质辅料，利用多因素正交试验法对乳膏剂的乳化剂用量、乳化温度、乳化时间等因素进行考察，优选了乳膏剂的最佳制备方法。黄芩苷和松果菊苷在该乳膏剂中稳定不析出，所制备的乳膏均匀细腻、稠度适宜、易涂抹；

(3)本发明利用制备的可稳定使用的组合物乳膏剂，首先在咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病模型上进行了药效观察，发现组合物能明显改善皮损表型；然后通过网络药理学、生物信息学预测黄芩苷可能通过TNF信号通路抗银屑病，松果菊苷可能通过VEGF信号通路抗银屑病；进一步地，开展了药理实验的探究与验证，发现黄芩苷可显著抑制TNF-α等炎症因子释放并抑制炎症细胞浸润，松果菊苷可显著抑制VEGF-A表达、抑制血管新生并降低氧化损伤。最终通过各实验指标的检测，得到了最佳配比的组合物，该配比的组合物显示出比单一成分更明显的药理作用，能较好地协同调控银屑病皮损发展的多个病理环节。

技术方案：本发明提供的具有抗银屑病作用的中药活性物质组合物，包括如下重量份数的原料：黄芩苷1～10重量份，松果菊苷1～10重量份。

优选地，包括如下重量份数的原料：黄芩苷1～2重量份，松果菊苷1～2重量份。

一种药物制剂，包括所述的具有抗银屑病作用的中药活性物质组合物，所述的制剂为外用制剂。

以上所述的药物制剂，该外用制剂为乳膏剂。

以上所述的乳膏剂，由以下重量百分比的基质辅料和中药活性物质组合物制备得到：

油相：

硬脂酸 8～12％

单硬脂酸甘油酯 4～8％

白凡士林 3～4％

水相：

超纯水余量

所述乳膏剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将8～12％硬脂酸、4～8％单硬脂酸甘油酯、3～4％白凡士林水浴加热至78～82℃使融化为液体，构成油相；

(2)将4～6％三乙醇胺、4～8％丙三醇、1～3％氮酮、4～8％组合物、0.05～0.2％尼泊金乙酯及部分超纯水水浴加热至78～82℃使完全溶解为溶液，构成水相；

(3)趁热将油相加入到水相中，再加入剩余超纯水，不断搅拌均匀，待冷却至40℃后，继续搅拌至完全乳化，待冷却至常温后，即得所用乳膏剂。

有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

本发明配方中的黄芩苷可通过TNF信号通路抑制皮肤炎症浸润，松果菊苷可通过VEGF信号通路抑制皮肤血管增生，从而达到抑制银屑病皮损发展的作用。本发明通过药理实验筛选得到最佳配比的黄芩苷和松果菊苷的配伍组合物，该组合物可以通过协同调控多通路、多靶点、多环节过程，显著抑制银屑病皮损的病理进展，具有较好的临床应用价值。

附图说明

图1为实施例3中各组小鼠背部皮损的变化(n＝8)；A显示实验最后一天各组小鼠背部皮损的外观结果，B显示实验期间各组小鼠背部皮损指标红斑(Erythema Score)、鳞屑(Scales Score)、浸润(Thickness Score)以及累积(Cumulative Score)评分的变化；Con组：正常对照组，IMQ组：咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病模型组，KB组：IMQ诱导+空白乳膏基质组，HMS组：IMQ诱导+卤米松乳膏阳性对照组，BAI组：IMQ诱导+5％黄芩苷乳膏给药组，ECH组：IMQ诱导+5％松果菊苷乳膏给药组，B1-E1组：IMQ诱导+5％组合物1(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶1)乳膏给药组，B2-E1组：IMQ诱导+5％组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)乳膏给药组，B1-E2组：IMQ诱导+5％组合物3(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶2)乳膏给药组；

图2为实施例3中各组小鼠背部皮损组织HE染色结果(n＝6)；双向箭头表示表皮厚度；红色圆圈表示炎症细胞浸润；

图3为实施例3中黄芩苷抗银屑病的潜在作用机制的网络药理学预测结果；A显示网络药理学预测的黄芩苷抗银屑病的潜在作用通路；B显示黄芩苷与TNF信号通路关键靶点TNF的虚拟对接分析；

图4为实施例3中松果菊苷抗银屑病的潜在作用机制的网络药理学预测结果；A显示网络药理学预测的松果菊苷抗银屑病的潜在作用通路；B显示松果菊苷与VEGF信号通路关键靶点VEGFA的虚拟对接分析；

图5为实施例3中各组小鼠背部皮损组织的巨噬细胞炎症浸润标记物CD68免疫组化染色结果(n＝6)；

图6为实施例4中各试验组药物对斑马鱼幼鱼血管生成的影响(n＝6)；CON组：正常对照组，VRI组：血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂II(VRI)诱导斑马鱼幼鱼血管丢失阳性对照组，BAI组：50μg/mL黄芩苷给药组，ECH组：50μg/mL松果菊苷给药组，B1-E1组：50μg/mL组合物1(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶1)给药组，B2-E1组：50μg/mL组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)给药组，B1-E2组：50μg/mL组合物3(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶2)给药组。

具体实施方式

实施例1

一种具有抗银屑病作用的外用乳膏剂，由以下组分组成(重量百分比)：

油相：

硬脂酸 9.5％

单硬脂酸甘油酯 5％

白凡士林 4％

水相：

超纯水余量

上述具有抗银屑病作用的外用乳膏剂的制备方法如下：

(1)将9.5％硬脂酸、5％单硬脂酸甘油酯、4％白凡士林水浴加热至80℃使融化为液体，构成油相；

(2)将5％三乙醇胺、5.5％丙三醇、2％氮酮、5％中药活性物质组合物、0.09％尼泊金乙酯及部分超纯水水浴加热至80℃使完全溶解为溶液，构成水相；

(3)趁热将油相加入到水相中，再加入剩余超纯水，不断搅拌15分钟，待冷却至40℃后，继续搅拌15分钟至完全乳化，冷却至常温后，即得乳膏剂；

(4)将乳膏进行分装，每盒30g。

实施例2

多因素正交试验法优选所述乳膏剂的最佳制备工艺

1.仪器与材料

1.1仪器

METTLER TOLEDO AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore)；JOANLAB水浴锅(宁波群安实验仪器有限公司)；Eppendorf5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2材料

黄芩苷(HPLC纯度≥98％，宝鸡辰光生物科技有限公司)；松果菊苷(HPLC纯度≥94％，宝鸡辰光生物科技有限公司)；硬脂酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；白凡士林(医用级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；单硬脂酸甘油酯(乳化型，纯度99％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；尼泊金乙酯(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；三乙醇胺(分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；丙三醇(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；氮酮(药用级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2.方法与结果

2.1处方及制备

所述乳膏剂处方组成及制备方法见实施例1。

2.2乳膏评分标准

设定总分100分，其中外观质量、pH、离心稳定性及耐热、耐寒稳定性各20分。具体评分标准见表1。

表1乳膏评分标准

2.3制备工艺优选

以三乙醇胺(因素A)和单硬脂酸甘油酯(因素B)的含量、乳化温度(因素C)、乳化时间(因素D)为考察因素，设计正交试验因素水平表(见表2)。以综合评分为评价指标，采用L

由表3可知，各因素对试验结果影响大小的顺序为D＞C＞A＞B，且最佳制备工艺为A

表2正交试验因素水平表

表3 L

表4 L

实施例3

实施例2制备的不同药物配比的乳膏抗银屑病的药效作用及机制研究

1.仪器与材料

1.1仪器

METTLER TOLEDO AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore)；JOANLAB水浴锅(宁波群安实验仪器有限公司)；OLYMPUS BX53正置荧光显微镜(日本OLYMPUS)；高通量冷冻研磨机(南京中科)；Sigma 2-16K高速冷冻离心机(德国Sigma)；TECAN Sunrise酶标仪(瑞士TECAN)。

1.2材料

实验动物为8周龄雌性BALB/c小鼠，SPF级，体重16～19g，72只，购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号20220602Abzz0619000465，生产许可证号SCXK(浙)2019-0001，饲养于中国医学科学院皮肤病医院实验动物中心。

自制5％黄芩苷乳膏、5％松果菊苷乳膏、5％组合物1(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶1)乳膏、5％组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)乳膏、5％组合物3(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶2)乳膏及空白乳膏(空白乳膏中不加入药物，其他基质辅料的用量占比不变)；咪喹莫特乳膏(艾达乐品牌，inova制药)；卤米松乳膏(澳能品牌，澳美制药)；组织固定液(江苏世泰实验器材有限公司)；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17A(IL-17A)、白介素-23(IL-23)、白介素-10(IL-10)ELISA试剂盒和血管内皮生长因子A(VEGF-A)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、丙二醛(MDA)ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司)；Anti-CD68 Rabbit pAb(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

2.方法

2.1小鼠银屑病模型制备与药物干预

咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病模型再现了人类银屑病的典型临床症状及病理特征，如皮肤红斑、鳞屑、表皮增厚、炎性浸润等。因此，本发明采用目前广泛应用的IMQ诱导小鼠银屑病模型开展不同药物配比的乳膏抗银屑病的药效作用及机制研究。

将72只小鼠随机平均分成9组：(1)Con组：正常对照组；(2)IMQ组：咪喹莫特(IMQ)诱导银屑病模型组；(3)KB组：IMQ诱导+空白乳膏基质组；(4)HMS组：IMQ诱导+卤米松乳膏阳性对照组；(5)BAI组：IMQ诱导+5％黄芩苷乳膏给药组；(6)ECH组：IMQ诱导+5％松果菊苷乳膏给药组；(7)B1-E1组：IMQ诱导+5％组合物1(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶1)乳膏给药组；(8)B2-E1组：IMQ诱导+5％组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)乳膏给药组；(9)B1-E2组：IMQ诱导+5％组合物3(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶2)乳膏给药组。除Con组外，其余各组小鼠均在脱毛(正式造模前3天完成)的背部皮肤上(2cm×3cm)每天涂抹5％咪喹莫特乳膏62.5mg，一共连续涂抹6天，以此建立小鼠银屑病模型。除IMQ组外，各乳膏组在IMQ涂抹4h后再涂抹乳膏，涂抹剂量与咪喹莫特乳膏保持一致。

从第0天开始造模和给药，直至第5天，期间每天进行皮损评分。在第6天，先对各组小鼠进行拍照、评分，再处理小鼠取背部皮肤组织，一部分保存在组织固定液中待HE染色、免疫组化染色等，另一部分保存在-80℃待生化指标检测等。

2.2皮损评分

根据银屑病面积和严重程度指数(PASI)评分系统评估背部皮肤病变的严重程度，该评分系统包括皮肤红斑、鳞屑和浸润厚度的严重程度。每个参数均以0到4的等级独立评分，其中0＝无症状、1＝轻微症状、2＝中度症状、3＝明显的症状、4＝非常明显的症状。累积分数表示炎症的严重程度。

2.3HE染色

对各组小鼠的皮肤组织样本进行HE染色，观察表皮增厚与炎症浸润情况。

2.4网络药理学预测

从PubChem数据库分别下载黄芩苷、松果菊苷的sdf格式文件，并用OpenBabel2.4.1转换为smiles、mol2格式。通过PharmMapper数据库上传mol2格式文件，选择HumanProtein Targets Only，反向预测得到匹配度前300的作用靶点；再利用黄芩苷、松果菊苷的smiles格式文件，选择Homo sapiens，在SEA数据库、SIB数据库中分别预测得到黄芩苷、松果菊苷的作用靶点；最后分别将上述预测得到的黄芩苷、松果菊苷的作用靶点信息进行汇总。在GeneCards数据库、DrugBank数据库、DisGeNET数据库中查找银屑病的疾病靶点。分别将预测的黄芩苷、松果菊苷的作用靶点与银屑病的疾病靶点进行映射，分别筛选出黄芩苷、松果菊苷抗银屑病的潜在作用靶点。利用STRING数据库进一步分析靶点之间的相互作用关系，进一步利用KOBAS数据库对关键作用靶点进行KEGG通路富集分析，并对关键靶点进行虚拟对接分析。

2.5生化指标检测

取皮肤组织样本，去除皮下脂肪，称重后剪碎，按比例(组织重量∶PBS体积＝1∶9)加入预冷的PBS，匀浆。将匀浆物在4℃、3000r/min下离心15min，收集上清液。采用BCA法测定各组样本的蛋白浓度。根据ELISA试剂盒说明书，测定皮损组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-17A(IL-17A)、白介素-23(IL-23)、白介素-10(IL-10)的含量和血管内皮生长因子A(VEGF-A)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、丙二醛(MDA)的含量。

2.6免疫组化染色

对各组小鼠的皮肤组织样本进行免疫组化染色，观察巨噬细胞炎症浸润标记物CD68的阳性表达情况。

2.7统计分析

实验数据以均数±标准差表示，多组之间比较采用One-way ANOVA检验进行分析，两两比较采用Sidak′s多重比较，数据采用GraphPad Prism 8软件进行分析，设定P<0.05为差异具有显著性。

3.结果

3.1不同药物配比的乳膏对IMQ诱导的小鼠银屑病皮损的影响

根据银屑病皮损严重程度指数评估小鼠背部皮肤病变的严重程度，结果如图1所示，与Con组相比，IMQ组和KB组的小鼠背部出现严重的皮损状况；与IMQ组、KB组相比，不同配比的黄芩苷和松果菊苷制备的乳膏涂抹后能明显减轻皮肤红斑、鳞屑和浸润增厚情况，降低皮肤炎症的严重程度。皮损组织HE染色和形态计量学分析(图2、表5)表明，不同配比的黄芩苷和松果菊苷制备的乳膏涂抹后可显著改善IMQ诱导的表皮增厚(P<0.001)，减少炎症细胞浸润。其中，以5％组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)乳膏作用更显著，在一定程度上优于单一组分的黄芩苷、松果菊苷。

表5各组小鼠背部皮肤组织的表皮厚度

注：数据用均数±标准差表示(n＝6)。与Con组比，

3.2黄芩苷、松果菊苷抗银屑病的潜在作用机制预测

如图3所示，黄芩苷抗银屑病的潜在关键作用靶点显著富集到TNF信号通路，并且分子对接显示黄芩苷与TNF信号通路中关键靶点TNF有较好的亲和力，表明黄芩苷可能通过调控TNF信号通路发挥抗银屑病作用。

如图4所示，松果菊苷抗银屑病的潜在关键作用靶点显著富集到VEGF信号通路，并且分子对接显示松果菊苷与VEGF信号通路中关键靶点VEGFA有较强的亲和力，表明松果菊苷可能通过调控VEGF信号通路发挥抗银屑病作用。

3.3不同药物配比的乳膏对小鼠银屑病皮损炎症因子释放、炎症细胞浸润的影响

图3所示网络药理学预测的TNF信号通路中关键靶点TNF，即肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。TNF-α可介导炎症反应，涉及炎症因子释放、炎症细胞浸润等。如表6所示，与Con组相比，IMQ组、KB组小鼠皮损组织中炎症因子TNF-α、IL-17A、IL-23的含量显著升高(P<0.001)，抗炎因子IL-10明显减少(P<0.001)；与IMQ组、KB组相比，不同配比的黄芩苷和松果菊苷制备的乳膏给药组能不同程度地降低炎症因子水平并增加抗炎因子含量(P<0.05，P<0.01，P<0.001)，以5％组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)乳膏作用更显著，在一定程度上优于单一组分的黄芩苷、松果菊苷。

TNF-α介导的炎症反应也涉及巨噬细胞等炎症细胞的浸润。皮损组织中巨噬细胞标记物CD68的免疫组化染色结果(图5)显示，与Con组相比，IMQ组、KB组小鼠皮损组织中巨噬细胞标记物CD68的阳性表达明显增加(棕褐色为CD68的阳性染色区域)；与IMQ组、KB组相比，不同配比的黄芩苷和松果菊苷制备的乳膏给药组能不同程度地降低CD68的阳性表达，表明巨噬细胞的炎症浸润得到抑制，并且5％组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)乳膏也表现出更显著的作用。

表6各组小鼠皮损组织中炎症因子和抗炎因子的含量

注：数据用均数±标准差表示(n＝6)。与Con组比，

3.4不同药物配比的乳膏对小鼠银屑病皮损血管内皮生长因子表达、氧化应激反应的影响

图4所示网络药理学预测的VEGF信号通路中关键靶点VEGFA，即血管内皮生长因子A(VEGF-A)。VEGF-A与血管新生的调控密切相关，并且血管新生还与另一关键因子基质金属蛋白酶-9(MMP-9)密切相关，MMP-9可通过释放VEGF参与血管新生。如表7所示，与Con组相比，IMQ组、KB组小鼠皮损组织中血管新生相关因子VEGF-A、MMP-9的含量明显升高(P<0.001)，表明出现血管增生；与IMQ组、KB组相比，不同配比的黄芩苷和松果菊苷制备的乳膏给药组能不同程度地降低VEGF-A、MMP-9的水平(P<0.01，P<0.001)，以5％组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)乳膏作用更显著，在一定程度上优于单一组分的黄芩苷、松果菊苷。

研究表明，血管新生的调控也与抗氧化作用密切相关。如表7所示，与Con组相比，IMQ组、KB组小鼠皮损组织中氧化应激相关指标TrxR活性明显降低、MDA含量显著增加(P<0.001)，表明出现氧化损伤；与IMQ组、KB组相比，不同配比的黄芩苷和松果菊苷制备的乳膏给药组能不同程度地升高TrxR活性并降低MDA含量(P<0.01，P<0.001)，表明抗氧化作用的增强，以5％组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)乳膏作用更显著。

表7各组小鼠皮损组织中血管新生相关因子水平和抗氧化能力

注：数据用均数±标准差表示(n＝6)。与Con组比，

实施例4

不同配比的黄芩苷、松果菊苷抗血管生成的药效作用及机制研究

1.仪器与材料

1.1仪器

METTLER TOLEDO AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore)；KH-500B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；SHP-250型生化培养箱(上海森信实验仪器有限公司)；OLYMPUS BX53正置荧光显微镜(日本OLYMPUS)；Lightcycler 480全自动荧光定量PCR仪(美国Roche)。

1.2材料

黄芩苷(HPLC纯度≥98％，宝鸡辰光生物科技有限公司)；松果菊苷(HPLC纯度≥94％，宝鸡辰光生物科技有限公司)；DMSO(分析纯，上海泰坦科技股份有限公司)；链霉蛋白酶(生物试剂，7000u/g，上海源叶生物科技有限公司)；血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂II(VRI)(HPLC纯度＞99.0％，德国Merck)；RNA提取试剂、反转录试剂盒、qPCR试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Tg(fli-1：EGFP)y1转基因斑马鱼胚胎(血管内皮细胞特异性绿色荧光)和胚胎培养液购自南京一树梨花生物科技有限公司。

2.方法

2.1药物溶液配制

称取实验所用药物适量，加入适量DMSO溶解后，用斑马鱼胚胎培养液稀释并定容至适宜容积，得药物储备溶液。临用前取适量的储备溶液，用培养液稀释至所需浓度。

2.2 Tg(fli-1：EGFP)y1转基因斑马鱼幼鱼血管生成抑制实验

选择状态良好，发育至24h的斑马鱼胚胎，用1mg/mL链霉蛋白酶溶液除去卵壳，将其放入24孔板中，以每孔不少于10条为一组。CON组加入含0.1％DMSO的斑马鱼胚胎培养液，VRI组加入500ng/mL VRI，BAI组加入50μg/mL黄芩苷，ECH组加入50μg/mL松果菊苷，B1-E1组加入50μg/mL组合物1(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶1)，B2-E1组加入50μg/mL组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)，B1-E2组加入50μg/mL组合物3(黄芩苷∶松果菊苷＝1∶2)。于28℃恒温培养箱中孵育24h后，将斑马鱼幼鱼置于双凹载玻片上，使幼鱼保持侧卧体位，用正置荧光显微镜拍照观察各组斑马鱼幼鱼节间血管(ISVs)生长情况，统计各组斑马鱼幼鱼的完整节间血管数和缺损节间血管数，计算其节间血管指数。节间血管指数(ISVs index)＝完整节间血管数×1+缺损节间血管数×0.5。

2.3 qPCR检测斑马鱼幼鱼VEGF信号通路血管新生相关基因表达

前期的斑马鱼胚胎处理和药物处理过程与上述2.2相同。于28℃恒温培养箱孵育24h后，用RNA提取试剂提取各组斑马鱼幼鱼总RNA，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后进行qPCR实验。以β-actin为内参基因，检测斑马鱼幼鱼血管新生相关基因VEGF-A、kdrl、flt-1和vWF的表达。

2.4统计分析

实验数据以均数±标准差表示，多组之间比较采用One-way ANOVA检验进行分析，两两比较采用Dunnett′s多重比较，数据采用GraphPad Prism 8软件进行分析，设定P<0.05为差异具有显著性。

3.结果

3.1不同配比的黄芩苷、松果菊苷对斑马鱼幼鱼节间血管生成的影响

如图6所示，正常对照组(CON组)斑马鱼幼鱼节间血管完整，血管生成未受到影响。VRI组幼鱼的节间血管生成受到明显抑制，同时BAI组、ECH组、B1-E1组、B2-E1组、B1-E2组幼鱼的节间血管生成也受到不同程度的抑制。通过对各组斑马鱼幼鱼的完整节间血管数和缺损节间血管数进行统计，计算出各组斑马鱼幼鱼的节间血管指数(见表8)。结果表明，与CON组相比，BAI组、ECH组、B1-E1组、B2-E1组、B1-E2组均能显著抑制斑马鱼幼鱼的节间血管生成(P<0.001)。在组合物中以B2-E1组(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)作用更显著，明显优于单一组分的黄芩苷和松果菊苷。

表8各组斑马鱼幼鱼的节间血管指数

注：数据用均数±标准差表示(n＝6)。与CON组比，

3.2不同配比的黄芩苷、松果菊苷对斑马鱼幼鱼VEGF信号通路血管生成相关基因表达的影响

如表9所示，qPCR结果表明，VRI阳性对照组斑马鱼幼鱼血管新生相关基因VEGF-A、kdrl、flt-1和vWF的表达明显下降，与CON组比较有显著性差异(P<0.001)。与CON组相比，BAI组、ECH组、B1-E1组、B2-E1组、B1-E2组斑马鱼幼鱼血管新生相关基因也受到不同程度的抑制(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。在组合物中以B2-E1组(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)作用更显著，明显优于单一组分的黄芩苷和松果菊苷。以上研究表明，黄芩苷和松果菊苷配伍组合物抑制血管生成的作用机制可能与抑制VEGF信号通路血管新生相关基因VEGF-A、kdrl、flt-1和vWF的表达有关。

表9各组斑马鱼幼鱼血管新生相关基因的表达情况

注：数据用均数±标准差表示(n＝3)。与CON组比，

目前临床上治疗银屑病的皮肤外用药以维A酸类、维生素D3类似物、糖皮质激素类药物为主，主要针对银屑病皮损发展过程的表皮角质形成细胞过度增殖、炎症细胞浸润的病理环节，如维A酸类、维生素D3类似物药物能抑制表皮角质形成细胞过度增殖，糖皮质激素类药物能抑制过度炎症反应。但这类药物均存在不同程度的副作用，如皮肤刺激性、不能长期用药等，尤其是长期应用糖皮质激素类药物会引起皮肤萎缩、毛细血管扩张等问题。此外，针对银屑病皮损发展的另一病理环节皮肤血管增生，还缺少相关的外用药物研究。

本发明提供了一种药用植物来源的天然活性成分黄芩苷和松果菊苷的组合物，研究已证实这2种天然植物活性成分对细胞基本无毒性，相比于糖皮质激素类药物成分、维A酸类药物成分，其安全性更高，适合长期用药。通过实施例3、实施例4的研究发现：黄芩苷可通过TNF信号通路抑制TNF-α等炎症因子释放，并抑制巨噬细胞炎症浸润，该作用在一定程度上优于松果菊苷；而松果菊苷可通过VEGF信号通路抑制VEGF-A等血管新生关键因子表达，并通过抑制另一血管新生关键因子MMP-9表达来抑制血管生成，同时也降低氧化损伤，该作用在一定程度上优于黄芩苷；进一步通过黄芩苷和松果菊苷的配伍组合来发挥协同增效作用，以组合物2(黄芩苷∶松果菊苷＝2∶1)的作用效果更显著，在一定程度上明显优于单一组分的黄芩苷和松果菊苷。