一种MMP-1表达抑制剂、皮肤外用组合物及其应用

技术领域

本发明属于皮肤外用品技术领域，具体地，涉及一种MMP-1表达抑制剂、皮肤外用组合物及其应用。

背景技术

皮肤光损伤是指由紫外线直接或间接引起的皮肤病的总称，主要包括皮肤光老化、光敏性皮肤病皮肤黄褐斑、、紫外线诱导的皮肤痤疮、紫外线诱导的皮肤癌变等。其中，皮肤光老化临床特征表现为：皮肤干燥、粗糙、松弛、下垂、弹性降低，出现皱纹和色素沉着甚至癌变。导致皮肤光老化的原因有很多种，其中，皮肤接受紫外线辐射损害后，激活体内的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)，导致皮肤真皮中支撑皮肤结构的胶原蛋白和弹性蛋白被过度降解，从而使皮肤出现皱缩、弹性降低至无弹性等衰老症状。

MMPs是一种内肽酶，能特异性降解几乎所有的细胞外基质成分，在皮肤光老化形成中发挥了重要作用。MMPs分为5类：胶原酶、明胶酶、间质溶解素、膜型基质金属蛋白酶和未分类型酶。基质金属蛋白酶-1(MMP-1)属于胶原酶，主要降解Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原。

紫外线诱导产生过量的MMP-1，MMP-1引起的光老化机制通路主要有：紫外线诱导激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路调节基质金属蛋白酶的表达，影响皮肤光老化。紫外线激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路中异二聚体激活蛋白1(AP-1)，AP-1上调MMP-1，过量表达的MMP-1进一步降解真皮层的胶原纤维和弹性纤维，导致胶原纤维和弹性纤维断裂成片段堆积，真皮层的正常结构受损。因此亟待一种能够抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物，并且用于日常护肤之中。

发明内容

本发明提供的MMP-1表达抑制剂为野黄芩素和刺五加苷B的组合，对MMP-1具有良好的抑制作用，能减少胶原蛋白降解并一定程度上刺激I型胶原蛋白的产生，能维持并保护皮肤弹性纤维和胶原纤维的正常形态和有序紧密排列，从而达到预防或者修复紫外线辐射引起的皮肤光老化或皮肤癌变等皮肤问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种MMP-1表达抑制剂，所述抑制剂包含野黄芩素和刺五加苷B，野黄芩素和刺五加苷B的重量比为1:0.25-4。

进一步地，所述MMP-1表达抑制剂中野黄芩素和刺五加苷B的重量比为1:0.25-1。

作为本发明的一种优选方案，野黄芩素和刺五加苷B的重量比为1:1。

一种用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物，所述组合物的制备原料包括MMP-1表达抑制剂，MMP-1表达抑制剂的总浓度不低于1.25μM。

应当理解，上述总浓度为野黄芩素和刺五加苷B两者在皮肤外用组合物中的浓度之和。所述MMP-1表达抑制剂的总浓度不低于1.25μM，即MMP-1表达抑制剂的总浓度大于等于1.25μM。

作为本发明的一种优选方案，所述用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物，所述MMP-1表达抑制剂的总浓度为1.25-10μM。

优选地，所述野黄芩素的质量百分数为0.000002-5％，所述刺五加苷B的质量百分数为0.000003-5％，基于所述皮肤外用组合物的总重量。

例如，野黄芩素的质量百分数包括但不限于：0.000002％、0.000005％、0.00002％、0.00006％、0.001％、0.002％、0.004％、0.005％、0.008％、0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、2％、3％、4％、5％。

例如，刺五加苷B的质量百分数包括但不限于：0.000003％、0.000005％、0.000026％、0.001％、0.002％、0.004％、0.005％、0.008％、0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、2％、3％、4％、5％。

作为本发明的一种优选方案，野黄芩素和刺五加苷B的总浓度为5μM。

本发明中所采用的野黄芩素(Scutellarein)为黄酮类化合物，是野黄芩苷的苷元，也是野黄芩苷的活性代谢物，但比野黄芩苷具有更好的活性。野黄芩素的结构式为：

本发明中所采用的刺五加苷B(Syringin)为苯丙素类化合物，具有抗氧化、降血糖、抗疲劳、调节免疫、神经保护等多种生理作用。刺五加苷B的结构式为：

本发明通过反复实验得出，野黄芩素和刺五加苷B的组合对MMP-1具有良好的抑制作用，能减少胶原蛋白降解并一定程度上刺激I型胶原蛋白的产生，能维持并保护皮肤紫外光老化模型中小鼠皮肤弹性纤维和胶原纤维的正常形态和有序紧密排列，从而达到预防或者修复紫外线辐射引起的皮肤光老化或皮肤癌变等皮肤问题。

同时，本发明的组合物经细胞和动物实验，表现出较好的安全性、低毒性且副作用少。

上述用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物在制备护肤品中的应用。

作为本发明的一种优选方案，所述护肤品包含以下质量百分数的原料：

本发明中，所述媒介物是本领域已知的，所述媒介物为乙醇、丁二醇、双丙甘醇和水中的至少一种。本领域技术人员可根据实际需要选择其类型和用量。

所述表面活性剂是常用于化妆品的任何类型的表面活性剂，其用于降低界面的表面张力，表面活性剂可达到清洁、乳化、稳定体系之目的。所述表面活性剂为脂肪酸皂(如月桂酸钠、棕榈酸钠等)、高级烷基硫酸盐(如月桂基硫酸钠等)、月桂基二甲氨基乙酸甜菜碱、烷基甜菜碱、酰氨基甜菜碱、脱水山梨糖醇脂肪酸酯类(如脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单异硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇倍半油酸酯)、PEG-烷基醚类(如PEG-2-辛基十二烷基醚等)、蔗糖脂肪酸酯中的至少一种。对于具体的表面活性剂，本领域技术人员可以根据所需选择其类型及用量。

所述护肤活性成分包括但不限于保湿剂、皮肤调理剂、润肤剂以及用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物。所述保湿剂为甘油、海藻糖、蔗糖、丙二醇、1,2-己二醇、甘露醇、甘油聚醚-26、鼠李糖、棉子糖、赤藓醇、聚乙二醇-8、聚乙二醇-32、甲基葡糖醇聚醚-10、聚谷氨酸钠、木糖醇、尿素、水解小核菌胶、聚谷氨酸钠、甘油葡糖苷、PPG-10甲基葡糖醚、出芽短梗酶多糖、银耳多糖中的至少一种。

所述皮肤调理剂可用于抗皱、祛斑、祛痘、控油等功效。所述皮肤调理剂为植物甾醇、辛基十二醇月桂酰谷氨酸酯、姜黄根提取物、神经酰胺2、神经酰胺3、透明质酸钠、乙酰植物鞘氨醇、胆甾醇、尿囊素、白桦树皮提取物、氢化卵磷脂、乙酰植物鞘氨醇、花榈木树皮提取物、毛喉鞘蕊花根提取物、红没药醇、胡椒籽提取物、泛醌、吡哆素二棕榈酸酯、吡哆素二辛酸酯、燕麦仁提取物中的至少一种。

所述润肤剂为甘油三(乙基己酸)酯、月桂酰肌氨酸异丙酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯、葡萄籽油、白池花籽油、牛油果树果脂、鲸蜡醇、聚二甲基硅氧烷、氢化聚癸烯、毛瑞榈果油、向日葵籽油、异十六烷、霍霍巴油、羊毛脂、石蜡、微晶蜡、精氨酸、蜂蜡中的至少一种。

所述化妆品辅料为乳化剂、增稠剂、防腐剂、香料中的至少一种。

所述乳化剂为山梨坦橄榄油酸酯、硬脂醇聚醚-21、PEG-60氢化蓖麻油、甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯、PPG-13-癸基十四醇聚醚-24、鲸蜡硬脂基葡糖苷、聚甘油-10肉豆蔻酸酯、鲸蜡硬脂基葡糖苷、聚甘油-10硬脂酸酯、聚甘油-10二油酸酯中的至少一种。本领域技术人员可根据需要具体选择其类型和用量。

所述增稠剂为羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆、黄原胶、阿拉伯胶中的至少一种。

所述防腐剂为羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯氧乙醇、苯甲醇、苯乙醇、山梨酸钾、苯甲酸钠、对羟基苯乙酮、氯苯甘醚等中的至少一种。

本发明的有益效果：

1.本发明采用野黄芩素和刺五加苷B的组合制成的一种MMP-1表达抑制剂对MMP-1具有良好的抑制作用，能减少胶原蛋白降解并一定程度上刺激I型胶原蛋白的产生，能维持并保护皮肤紫外光老化模型中小鼠皮肤弹性纤维和胶原纤维的正常形态和有序紧密排列，从而达到预防或者修复紫外线辐射引起的皮肤光老化或皮肤癌变等皮肤问题。

2.本发明提供一种用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物，及其在制备护肤品中的应用，该护肤品制备简便，易于工业化生产，更有益于日常护肤中对于MMP-1的抑制作用。

附图说明

图1为参照例1中不同浓度的药物对HaCaT细胞活力的影响结果；

图2为参照例2中的不同比例的野黄芩素和刺五加苷B组合物对光老化HaCaT细胞分泌MMP-1的影响结果；

图3为参照例3中不同浓度组合物C对HaCaT细胞活力的影响结果；

图4为试验例1中组合物C对光老化HaCaT细胞活力的影响结果；

图5为试验例2中组合物C对光老化HaCaT细胞分泌MMP-1的影响结果；

图6为试验例3中组合物C对光老化HaCaT细胞分泌I型胶原的影响结果；

图7为试验例4中组合物C对皮肤光老化小鼠皮肤结构的皮肤病理切片的HE染色结果图；

图8为试验例4中组合物C对皮肤光老化小鼠皮肤结构的皮肤病理切片的Masson染色结果图；

图9为试验例4中组合物C对皮肤光老化小鼠皮肤结构的皮肤病理切片的维多利亚蓝染色结果图；

图10为试验例5中组合物C对小鼠皮肤中MMP-1含量的影响结果；

图11为试验例6中组合物C对小鼠皮肤中Ⅰ型胶原蛋白含量的影响结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

参照例1

测试野黄芩素、刺五加苷B对HaCaT细胞活力的影响

实验方法

储备液制备：采用DMSO作为溶剂制备野黄芩素、刺五加苷B的药物储备液；用PBS制备阳性对照维生素C的储备液；采用水：甘油＝1:1质量比的溶液制备乙酰基六肽-8储备液。

配制5mg/ml的MTT溶液：精密避光称取50.00mg的MTT粉末，放入10mL离心管中，加10ml PBS(0.01M，pH7.4)使其完全溶解，用0.22μm孔径硝酸纤维素膜过滤除菌，分装，标明试剂名称以及配制日期等，-20℃避光冻存备用。

细胞培养及给药：将HaCaT细胞(2.5万每孔)接种在96孔板中，放入培养箱中培养过夜，当HaCaT细胞达到约80％融合时，吸弃旧培养基，控制组每孔加入100μL不含药物新鲜培养基，给药组每孔加入100μL含药培养基继续培养。

MTT法检测药物的细胞毒性：培养24小时后，吸出含药培养基，PBS洗涤2次，5mg/mlMTT用空白DMEM培养基稀释成0.5mg/ml，每个孔加100μL浓度为0.5mg/ml的MTT溶液，培养箱中培养3小时，小心吸出液体，每孔加入100μL的DMSO，充分溶解10分钟后用酶标仪在490nm处检测OD值。

统计数据分析

本实施例中所得数据采用graphpad prism 8.0软件进行分析。用one-way ANOVA方法进行统计分析，各组数据均以

实验结果

表1：不同浓度药物对HaCaT细胞活力的影响(n＝6，

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，样品组与控制组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示具有显著性差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异，***p-value＜0.001表示有极显著差异。

维生素C、乙酰基六肽-8、野黄芩素、刺五加苷B浓度0.625～20μM时，HaCaT细胞的活力均＞90％，与控制组比较，无显著性变化，没有表现出对细胞的毒性作用，表现出较好的安全性。维生素C浓度0.625～20μM时，HaCaT细胞的活力均＞90％，与控制组比较，5μM和20μM的维生素C组显著提高HaCaT细胞的活力(p-value＜0.05)，20μM的维生素C组极显著提高HaCaT细胞的活力(p-value＜0.001)。

上述实验结果显示，野黄芩素、刺五加苷B等表现出对细胞的高度温和以及安全性。

参照例2

测定光老化HaCaT细胞分泌MMP-1并筛选野黄芩素和刺五加苷B组合物的比例。

实验方法

储备液制备：采用DMSO作为溶剂制备野黄芩素和刺五加苷B混合物的药物储备液。

分组：设置控制组、UVA组并根据重量比设置组合物组：组合物A组(野黄芩素：刺五加苷B＝4:1)、组合物B组(野黄芩素：刺五加苷B＝2:1)、组合物C组(野黄芩素：刺五加苷B＝1:1)、组合物D组(野黄芩素：刺五加苷B＝1:2)、组合物E组(野黄芩素：刺五加苷B＝1:4)，每组设置6个复孔。

细胞培养及给药：根据参照例1的实验结果，给药组的浓度均设置为5μM。将HaCaT细胞(2.5万每孔)接种在96孔板中，放入培养箱中培养过夜，当HaCaT细胞达到约60％融合时，用DMED培养基将各组药物储备液按照分组情况稀释至浓度为5μM。吸弃旧培养基，控制组和UVA组加不含药物的细胞培养基，给药组每孔加入100μL含药物浓度5μM的细胞培养基，继续培养6小时。

用UVA建立光老化HaCaT细胞模型：吸弃旧培养基，PBS洗1次，每孔加100uL PBS覆盖细胞，UVA照射(UVA紫外灯波长315-400nm，波峰为365nm)，照射剂量为12.5J/cm

检测药物对光老化HaCaT细胞分泌MMP-1的抑制作用：培养结束后，用离心管收集每组的细胞培养上清液，细胞上清液离心后保留上清作为待测样品。按照人基质金属蛋白酶1(MMP-1)ELISA试剂盒说明书操作，最后用酶标仪在450nm处检测OD值。

统计数据分析

本参照例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析，各组数据均以

实验结果

表2：不同比例组合物抑制光老化HaCaT细胞分泌MMP-1的结果(n＝6)

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，UVA组与控制组相比，显著性以#表示，#p-value＜0.05表示有显著差异，##p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与控制组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示具有显著性差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。

由实验结果可得，与控制组比较，UVA组的MMP-1含量差异具有极显著性差异(p＜0.0001)，表明建模成功；与UVA组相比，组合物A组、组合物B组、组合物C组、组合物D组、组合物E组均可有效抑制光老化HaCaT细胞分泌MMP-1，具有显著性差异(五组P值均＜0.0001)，其中，组合物C组对MMP-1下调最明显，下调率达到15.91％。

组合物C组对MMP-1下调率高于组合物A组、组合物B组、组合物D组和组合物E组，表明组合物C具有更大的潜力抑制MMP-1活性，减少MMP-1对胶原蛋白等皮肤细胞外基质的降解。

参照例3

测试不同浓度组合物C对HaCaT细胞活力的影响

实验方法

储备液制备：采用DMSO作为溶剂制备组合物C的储备液；用PBS制备阳性对照维生素C的储备液；采用水：甘油＝1:1的溶液制备乙酰基六肽-8储备液。

分组：设置控制组、维生素C组(阳性药物组，根据参照例1的实验结果，维生素C浓度设置为5μM)、乙酰基六肽-8组(阳性药物组，根据参照例1的实验结果，乙酰基六肽-8浓度设置为5μM)、不同药物浓度的组合物C组(设置0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μM)，每组设置6个复孔。

细胞培养及给药：将HaCaT细胞(2.5万每孔)接种在96孔板中，放入培养箱中培养过夜，当HaCaT细胞达到约80％融合时，吸弃旧培养基，控制组每孔加入100μL不含药物新鲜培养基，给药组每孔加入100μL含药培养基继续培养。

MTT法检测药物的细胞毒性：培养24小时后，吸出含药培养基，PBS洗涤2次，5mg/mlMTT用空白DMEM培养基稀释成0.5mg/ml，每个孔加100μL浓度为0.5mg/ml的MTT溶液，培养箱中培养3小时，小心吸出液体，每孔加入100μL的DMSO，充分溶解10分钟后用酶标仪在490nm处检测OD值。

统计数据分析

本试验例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析，各组数据均以

实验结果

表3：不同浓度组合物C对HaCaT细胞活力的影响(n＝6，

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，样品组与控制组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示具有显著性差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。

组合物C在浓度0.625～40μM时，HaCaT细胞的活力均＞90％，与控制组比较，无显著性变化，没有表现出对细胞的毒性作用，表现出较好的安全性。

上述实验结果显示，不同浓度的组合物C均表现出对细胞的高度温和以及安全性。

根据组合物C野黄芩素：刺五加苷B＝1:1的组合物设置实施例1-3。

实施例1

一种用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物，包括一种MMP-1表达抑制剂，即重量比为1:1的野黄芩素和刺五加苷B，控制野黄芩素和刺五加苷B的总浓度为1.25μM(低剂量组)。

实施例2

一种用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物，包括一种MMP-1表达抑制剂，即重量比为1:1的野黄芩素和刺五加苷B，控制野黄芩素和刺五加苷B的总浓度为5μM(中剂量组)。

实施例3

一种用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物，包括一种MMP-1表达抑制剂，即重量比为1:1的野黄芩素和刺五加苷B，控制野黄芩素和刺五加苷B的总浓度为20μM(高剂量组)。

试验例1

本试验例测试实施例1-3中组合物C对光老化HaCaT细胞活力的影响。

实验方法

采用MTT实验检测组合物C对光老化HaCaT细胞活力的影响，具体实验步骤如下：

分组：设置控制组、UVA组、维生素C组(阳性药物组，根据参照例1的实验结果，维生素C浓度设置为5μM)、乙酰基六肽-8组(阳性药物组，根据参照例1的实验结果，乙酰基六肽-8浓度设置为5μM)、组合物C组(低、中和高剂量分别为实施例1、实施例2和实施例3)，每组设置6个复孔。

细胞培养与给药：将HaCaT细胞(2.5万每孔)接种在96孔板中，培养24小时，当HaCaT细胞60％-70％融合度时给药，控制组和UVA组每孔加100μL不含药物的DMEM培养基，用DMEM培养基稀释各组的药物，给药组每孔加100μL含药物的DMEM培养基，给药后继续培养6小时。

用UVA建立光老化HaCaT细胞模型：培养结束，吸弃旧的培养基，PBS洗涤2次，每孔加100uLPBS覆盖细胞，控制组用铝箔纸覆盖，进行UVA照射，灯管与细胞培养板的距离为9cm，照射剂量为12.5J/cm

MTT实验具体步骤：培养结束，吸弃旧的DMEM培养基，PBS洗涤2次，用无血清DMEM培养基将5mg/mL的MTT稀释至0.5mg/ml，每孔加100μL浓度为0.5mg/mL的MTT溶液，放入培养箱培养3-4小时，小心吸出液体，每孔加入100μL的DMSO，充分溶解10分钟，用酶标仪在490nm处检测OD值。

统计数据分析

本试验例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析，各组数据均以

实验结果

采用MTT实验检测组合物C对光老化细胞活力的影响，实验结果表4和图4所示。

表4：组合物C对光老化HaCaT细胞活力的影响(n＝6)

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，UVA组与控制组相比，显著性以#表示，#p-value＜0.05表示有显著差异，##p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与UVA组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示有显著差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。

与控制组比较，UVA组细胞活力下降具有极显著性差异(p＜0.0001)，表明建模成功。与UVA组相比，实施例1组(1.25μM)、实施例2组(5μM)、实施例3组(20μM)均可显著提高光老化HaCaT细胞的活力(三组P值均＜0.0001)。与UVA组相比，实施例1-3组对光老化HaCaT细胞活力的上调率分别为37.58％、101.16％、46.95％，表现出对光老化HaCaT细胞保护与修复作用。

上述实验结果表明，组合物C能够很好的保护与修复光老化HaCaT细胞。

试验例2

本试验例测试实施例1-3中组合物C对光老化HaCaT细胞分泌MMP-1的影响

实验方法

分组：设置控制组、UVA组、维生素C组(阳性药物组，根据参照例1的实验结果，维生素C浓度设置为5μM)、乙酰基六肽-8组(阳性药物组，根据参照例1的实验结果，乙酰基六肽-8浓度设置为5μM)、组合物C组(低、中和高剂量分别为实施例1、实施例2和实施例3)，每组设置6个复孔。

细胞培养及给药：将HaCaT细胞(2.5万每孔)接种在96孔板中，放入培养箱中培养过夜，当HaCaT细胞达到约60％融合时，用DMED培养基将组合物C储备液稀释至浓度为1.25μM、5μM、20μM。吸弃旧培养基，控制组和UVA组加入不含药物的细胞培养基，给药组每孔加入100μL含不同浓度药物的细胞培养基，继续培养6小时。

用UVA建立光老化HaCaT细胞模型：吸弃旧培养基，PBS洗1次，每孔加100uL PBS覆盖细胞，UVA照射，照射剂量为12.5J/cm

检测药物对光老化HaCaT细胞分泌MMP-1的抑制作用：培养结束后，用离心管收集每组的细胞培养上清液，细胞上清液离心后保留上清作为待测样品。按照人基质金属蛋白酶1(MMP-1)ELISA试剂盒说明书操作，最后用酶标仪在450nm处检测OD值。

统计数据分析

本试验例例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-way ANOVA方法进行统计分析，各组数据均以

实验结果

表5：组合物C对光老化HaCaT细胞分泌MMP-1的影响(n＝6)

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，UVA组与控制组相比，显著性以#表示，#p-value＜0.05表示有显著差异，##p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与UVA组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示有显著差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。

研究组合物C对光老化HaCaT细胞MMP-1分泌量的抑制作用。由实验结果可得，与控制组比较，UVA组的MMP-1含量差异具有极显著性差异(P＜0.001)，表明建模成功。与UVA组相比，实施例1-3组可有效抑制光老化HaCaT细胞分泌MMP-1，具有极显著性差异(三组P值均＜0.01)，且实施例1-3组的MMP-1下调率分别达到20.44％、14.68％、15.01％。

与UVA组相比，实施例1组的MMP-1下调率高于阳性对照维生素C和乙酰基六肽-8。此外，与维生素C组相比，组合物C低剂量的MMP-1下调率达到4.30％。与乙酰基六肽-8组相比，组合物C低剂量的MMP-1下调率达到6.51％。这表明实施例1更能抑制MMP-1分泌，减少过量MMP-1对胶原蛋白等皮肤细胞外基质的降解。

试验例3

本试验例测试实施例1-3中组合物C对光老化HaCaT细胞分泌I型胶原的影响。

实验方法

分组：设置控制组、UVA组、维生素C组(阳性药物组，根据参照例1的实验结果，浓度设置为5μM)、乙酰基六肽-8组(阳性药物组，根据参照例1的实验结果，浓度设置为5μM)、组合物C组(低、中和高剂量分别为实施例1、实施例2和实施例3)，每组设置6个复孔。

细胞培养及给药：将HaCaT细胞(2.5万每孔)接种在96孔板中，放入培养箱中培养过夜，当HaCaT细胞达到约60％融合度时，吸弃旧培养基，控制组和UVA组加入不含药物的细胞培养基，给药组每孔加入100μL含不同浓度药物的细胞培养基，继续培养6小时。

用UVA建立光老化HaCaT细胞模型：吸弃旧培养基，PBS洗1次，每孔加100uL PBS覆盖细胞，UVA照射，照射剂量为12.5J/cm

检测药物对光老化HaCaT细胞Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响：培养结束后，用离心管收集每组的细胞培养上清液，细胞上清液离心后保留上清作为待测样品。按照Ⅰ型胶原蛋白(ColI)ELISA试剂盒说明书操作，最后用酶标仪在450nm处检测OD值。

统计数据分析

本试验例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析，各组数据均以

实验结果

表6：组合物C对光老化HaCaT细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白的影响(n＝6)

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，UVA组与控制组相比，显著性以#表示，#p-value＜0.05表示有显著差异，##p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与UVA组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示有显著差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与维生素C组相比，显著性以+表示，+p-value＜0.05表示有显著差异，++p-value＜0.01表示有极显著差异。

研究组合物C对光老化HaCaT细胞Ⅰ型胶原蛋白(ColI)分泌量的影响。由实验结果可得，与控制组比较，UVA组的Ⅰ型胶原蛋白显著性减少，显著性差异(P＜0.01)，表明造模成功。与控制组比较，实施例1-3组对细胞Ⅰ型胶原蛋白分泌的影响无显著性差异，表明组合物C低、中、高剂量均能减少紫外对HaCaT细胞Ⅰ型胶原蛋白分泌的抑制作用，即对紫外损伤的HaCaT细胞，组合物C可有效维持细胞Ⅰ型胶原蛋白的分泌，避免紫外线影响I型胶原蛋白的正常分泌。此外，组合物C实施例1组好实施例2组Ⅰ型胶原蛋白分泌量在数值上略高于控制组，这表明一定剂量的组合物C不仅避免紫外线抑制I型胶原蛋白的分泌，还可促进HaCaT细胞生成一定量的I型胶原蛋白。

与UVA组相比，组合物C低、中剂量组能促进光老化HaCaT细胞Ⅰ型胶原蛋白(ColI)分泌，差异具有极显著性差异(P＜0.01)，实施例3组能抑制光老化HaCaT细胞Ⅰ型胶原蛋白(ColI)的降解，差异具有显著性差异(P＜0.05)。与UVA组相比，实施例1组对Ⅰ型胶原蛋白上调率达到18.34％。

与维生素C相比，组合物C低、中剂量组能更好地促进光老化HaCaT细胞Ⅰ型胶原蛋白(ColI)分泌，差异具有极显著性差异(P＜0.01)。与维生素C组对比，实施例1组对Ⅰ型胶原蛋白上调率达到12.07％。

结合试验例2和试验例3的实验结果可知，一方面，组合物C能够通过抑制或减少MMP-1的产生，从而减少MMP-1降解I型胶原蛋白，另一方面，组合物C低、中剂量组减少紫外线抑制细胞分泌I型胶原蛋白，并在一定程度上刺激细胞分泌I型胶原蛋白，共同作用下达到预防或者修复紫外线辐射引起的光老化、光损伤或皮肤癌变或皮肤衰老等皮肤问题。

试验例4

本试验例测试实施例1-3中组合物C对皮肤光老化小鼠皮肤结构的影响

实验动物

SPF级雌性昆明小鼠70只，体重20±2g，5-6周龄，购自广东省医学实验动物中心，实验单位使用许可证编号：SYXK(粤)2017-0125，生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002。实验动物饲养于广东药科大学动物实验中心，温度维持在20-25℃，相对湿度为40％-70％，自由摄食，适应性饲养一周后进行实验。

动物实验乳膏，其成分如下表7所示：

表7：乳膏成分

乳膏的制备方法，包括以下步骤：

1、定量称取油相，油相：6g白凡士林，8g液体石蜡，5g十八醇，7g单硬脂酸甘油酯，4g平平加O-9，0.3g对羟基苯甲酸甲酯，0.2g对羟基苯甲酸丙酯，0.5g2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)，备用；

2、将油相混合并加热至80℃充分溶解，搅匀，降温至65℃，保温备用；

3、分别加入维生素C、乙酰基六肽-8、实施例1-3的组合物C，再加入2g异山梨醇二甲基醚和，搅拌，超声使油相溶解完全；

4、再称取水相，水相：称取12g甘油，0.02g乙二胺四乙酸二钠，纯化水适量，用纯水补充至乳膏总量100g，水相加热至65℃溶解；

5、将65℃的油相缓缓倒入65℃的水相中，边倒边搅拌至室温即可；

6、得到乙酰基六肽-8乳膏(质量百分数为0.005％)、维生素C乳膏(质量百分数为1.6％)、组合物C实施例1乳膏(质量百分数为0.4％)、组合物C实施例2乳膏(质量百分数为0.8％)以及组合物C实施例3乳膏(质量百分数为1.6％)。

统计数据分析

本试验例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析，各组数据均以

实验方法

动物分组与脱毛处理：设置正常组、模型组、维生素C组、乙酰基六肽-8组、实施例1、实施例2、实施例3，共7组。70只SPF级昆明小鼠随机分成7组，每组10只。

小鼠适应性饲养一周后，进行脱毛处理。先用宠物防水电推剪剔除小鼠背部较长毛发，再按照脱毛膏说明书脱除小鼠背部的短毛和绒毛，脱毛的背部皮肤面积为3cm×2cm，脱毛后休息一天，第二天开始造模。造模期间剃毛和脱毛频率根据小鼠背部毛发生长情况而定，每天剃毛一次，每周脱毛一次。

测定最小红斑剂量

照射条件：用自制紫外线辐射箱(规格为105cm×67cm×53cm)进行造模，箱内放置UVA紫外灯(320nm-400nm，波峰为365nm)和UVB紫外灯(275nm-320nm，波峰为311nm)，模拟日光中UVA与UVB比例以及日光中紫外线强度(UVA灯的照射距离为25cm，照射强度为630μw/cm

测试最小红斑剂量：设置正常组、UVB50mJ/cm

构建皮肤光老化小鼠模型与皮肤给药

按照表8所示的实验操作进行建模和给药。UVA灯的照射距离为25cm，照射强度为630μw/cm

需要注意的是，照射前2h给乳膏，将制备好的乳膏均匀涂抹小鼠背部皮肤，等待皮肤充分吸收乳膏再进行紫外照射。造模期间，造模箱内需要放置适量的冰袋调节温度，另外，造模期间每天观察小鼠背部皮肤有无水疱和糜烂等症状，若出现上述症状，全部小鼠需要休息2-3天至上述症状消失，再继续造模。

除了紫外照射以及给背部涂抹乳膏的时间，每天更换小鼠饮用水，每天给适量饲料，各组小鼠自由饮水摄食。每周称量小鼠体重，每周更换两次垫料，每周拍照记录小鼠背部皮肤变化。

表8：造模与给药实验操作

注：+表示有相应的实验操作，-表示无相应的实验操作。

取材

第9周实验结束后，将各组小鼠脱颈处死，迅速取小鼠背部紫外线照射过的皮肤，用生理盐水清洗皮肤，去除皮下脂肪层以及皮肤结缔组织，滤纸拭干，将皮肤分成三份，一份放入4％多聚甲醛通用型组织固定液中固定，剩下的称重并分装在离心管中，写上标签，投入液氮中，取材结束后-80℃冰箱保存组织，用于后续各项指标检测。

分别采用HE、Masson和维多利亚蓝染色方法测定组合物C对小鼠皮肤结构的影响。

制作皮肤组织石蜡切片。皮肤组织用4％多聚甲醛固定液固定48h，将组织和对应的标签放入脱水盒，在脱水机内用梯度酒精进行脱水浸蜡，石蜡包埋，修整蜡块并切片，摊片，烤片，准备染色。

皮肤组织石蜡切片染色。将石蜡切片脱蜡至水，按照HE染液试剂盒、Masson染液试剂盒和维多利亚篮染液试剂盒的说明书分别进行染色，染色后用中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。分析HE染色切片中皮肤表皮厚度的变化，分析Masson染色切片中皮肤胶原纤维的变化，以及分析维多利亚篮染色切片中皮肤弹性纤维的变化。

实验结果

(1)皮肤病理切片的HE染色结果如图7所示。

图7中，正常组小鼠皮肤表皮层和真皮层厚度正常，真皮层中胶原纤维较多并且排列有序。与正常组相比，模型组小鼠皮肤呈现出皮肤角质层明显增厚，皮肤可能已经过度角化，皮肤的真皮层和表皮层均增厚，皮肤表皮正品连接处(DEJ)弯曲且不清晰，真皮层以及皮下脂肪层的血管增多并且血管扩张，真皮层的胶原纤维排列不规则，皮肤附属器官皮脂腺异常增大，这些说明紫外线明显影响小鼠皮肤的正常结构。

图7中，与模型组相比，实施例1-3组小鼠的皮肤表皮和真皮表厚度降低，表皮和真皮的连接处(DEJ)清晰，表皮乳突明显，真皮胶原纤维排列规则呈波浪状，胶原纤维的粗细均匀，并且胶原纤维均匀分布在真皮层，皮脂腺大小正常。

图7中，与维生素C组或乙酰基六肽-8组相比，实施例1-3组小鼠的皮肤表皮层明显趋于正常健康，角质层修复更平滑完整，真皮和表皮连接处清晰，真皮胶原纤维大小均匀，形态呈波浪状。

HE染色结果表明，组合物C不仅能够很好的修复光老化皮肤延缓皮肤衰老，并且可以减少或保护真皮胶原纤维降解，维持胶原纤维的正常状态。

(2)皮肤病理切片的Masson染色结果如图8所示。

图8中，染成蓝色的部分(图中因调色为灰度未显出)是皮肤真皮层胶原纤维。正常组小鼠皮肤蓝色的胶原纤维排列紧密有序，胶原纤维的粗细和大小均匀，胶原纤维均匀地分布在皮肤真皮层。与正常组比较，模型组小鼠皮肤，皮肤角质层增厚并且过多角化，角质层有炎症现象，表皮层明显增厚，皮肤的附属器官皮脂腺异常增大，模型组的毛囊深度变浅，并且毛囊内有炎症现象，表明紫外线明显影响皮肤真皮的胶原纤维。

图8中，与模型组相比，实施例1-3组小鼠的皮肤表皮和真皮表厚度趋于正常，表皮真皮连接处界线明显，蓝色的胶原纤维有序地波浪状排列。

图8中，与维生素C组或乙酰基六肽-8组相比，实施例1-3组小鼠的皮肤表皮和真皮表厚度趋于正常，真皮和表皮连接处清晰，蓝色胶原纤维大小均匀，形态呈波浪状。

图8中，与实施例1相比，实施例2和实施例3的真皮胶原纤维增多，并且胶原纤维均匀排列，皮肤的皮脂腺大小正常。

根据Masson染色结果表明，一定剂量的组合物C可以有效保护皮肤光老化模型小鼠皮肤的胶原纤维，维持胶原纤维的正常形态，维持胶原纤维有序紧密排列，并刺激胶原蛋白的生成。从而预防和治疗紫外线辐射引起的皮肤光老化、光损伤或者皮肤癌变等情况发生。

(3)皮肤病理切片的维多利亚蓝染色结果如图9所示。

图9中染成蓝绿色的部分(图中因调色为灰度未显出)是皮肤真皮层弹性纤维。正常组小鼠皮肤蓝绿色的弹性纤维排列有序，弹性纤维的粗细和大小均匀，并且弹性纤维均匀地分布在皮肤真皮层。与正常组比较，模型组小鼠皮肤弹性纤维排列紊乱，弹性纤维断裂并成小团堆积在皮肤真皮层中，表明紫外线影响真皮层弹性纤维。

与模型组相比，实施例1-3组小鼠的皮肤蓝绿色的弹性蛋白排序均匀有序，弹性纤维与胶原纤维有序排列，共同均匀分布在皮肤真皮层，且实施例3的真皮弹性蛋白增多，并且纤维均匀排列，皮肤的皮脂腺大小正常。

根据维多利亚蓝染色结果表明，组合物C不仅对光老化皮肤弹性纤维有较好保护作用，一定量的组合物C能够刺激光老化皮肤弹性纤维维持正常的形态并刺激弹性蛋白的生成增多且有序紧密排列，从而预防和治疗修紫外线辐射引起的皮肤光老化、光损伤或者皮肤癌变等情况发生。

试验例5

本试验例测试实施例1-3中组合物C对小鼠皮肤中MMP-1含量的影响

实验方法

制备皮肤组织匀浆：制备皮肤组织匀桨。皮肤组织称重后剪碎，按照重量(g)：体积(mL)＝1:9的比例，往皮肤组织中加入4℃预冷的生理盐水，用组织匀浆机在低温条件下匀桨，制成10％的皮肤组织匀浆。低温冷冻离心(3500rpm，10-15min)，收集上清液并分装，-80℃冰箱保存备用。

测定小鼠皮肤中MMP-1含量：按照小鼠基质金属蛋白酶1(MMP-1)试剂盒说明书检测皮肤组织待测样品，并用酶标仪在450nm处检测皮肤中MMP-1的含量。

统计数据分析

本试验例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析，各组数据均以

实验结果

表9：组合物C对光老化小鼠皮肤MMP-1含量的影响(n＝10)

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，UVA组与控制组相比，显著性以#表示，#p-value＜0.05表示有显著差异，##p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与UVA组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示有显著差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与维生素C组相比，显著性以+表示，+p-value＜0.05表示有显著差异，++p-value＜0.01表示有极显著差异。

采用酶联免疫吸附实验测定皮肤光老化小鼠皮肤组织中MMP-1含量。与控制组相比，模型组小鼠皮肤MMP-1含量极显著升高(P＜0.01)，说明紫外线可增加小鼠皮肤中MMP-1含量。

与模型组相比，实施例1-3组均能极显著降低皮肤MMP-1含量(三组P值均＜0.01)，并且对小鼠皮肤MMP-1含量的下调率分别为16.94％、21.09％、23.45％。

与维生素C组比较，实施例1-3组均能极显著降低皮肤MMP-1含量(三组P值均＜0.01)，并且实施例1-3组对小鼠皮肤MMP-1含量的下调率分别为8.75％、13.31％、15.90％。

综上，表明组合物C能够有效降低皮肤光老化小鼠皮肤中MMP-1含量，并且实施例2、3组的组合物抑制MMP-1的效果均优于维生素C。因此，组合物C可作为潜在MMP-1抑制剂，应用于预防和治疗修复皮肤光老化、紫外线引起的皮肤光损伤或者紫外光辐射引起的皮肤癌变产品中。

试验例6

本试验例测试实施例1-3中组合物C对小鼠皮肤中I型胶原蛋白含量的影响

实验方法

制备皮肤组织匀浆：同试验例5中制备皮肤组织匀浆方法。

测定小鼠皮肤中I型胶原蛋白的含量：按照小鼠Ⅰ型胶原蛋白(COLⅠ)试剂盒说明书检测皮肤组织待测样品，并用酶标仪在450nm处检测OD值，样品的OD值代入标准曲线计算获得皮肤中Ⅰ型胶原蛋白的含量。实验结果见表10及图11所示。

实验结果

表10：组合物C对光老化小鼠皮肤Ⅰ型胶原蛋白含量的影响(n＝10)

注：用one-wayANOVA方法进行统计分析时，UVA组与控制组相比，显著性以#表示，#p-value＜0.05表示有显著差异，##p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与UVA组相比，显著性以*表示，*p-value＜0.05表示有显著差异，**p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与维生素C组相比，显著性以+表示，+p-value＜0.05表示有显著差异，++p-value＜0.01表示有极显著差异。样品组与乙酰基六肽-8组相比，显著性以^表示，^p-value＜0.05表示有显著差异，^^p-value＜0.01表示有极显著差异。

采用酶联免疫吸附实验测定皮肤紫外光老化小鼠皮肤中Ⅰ型胶原蛋白的含量，与模型组相比，实施例1-3组均能极显著提高皮肤中I型胶原蛋白含量(三组P值均＜0.01)，且实施例1-3组对皮肤光老化小鼠皮肤中Ⅰ型胶原蛋白的上调率分别为30.44％、44.46％、48.95％。

与维生素C组相比，实施例2、3组均能极显著提高小鼠皮肤中Ⅰ型胶原蛋白的含量(二组P值均＜0.01)，且实施例1-3组对皮肤光老化小鼠皮肤中Ⅰ型胶原蛋白的上调率分别为2.44％、13.45％、16.98％。

与乙酰基六肽-8组相比，实施例2、3组能显著提高小鼠皮肤中Ⅰ型胶原蛋白的含量(P＜0.01)，且实施例1-3组对皮肤光老化小鼠皮肤中Ⅰ型胶原蛋白的上调率分别为1.58％、12.50％、16.00％。

综合分析试验例5和试验例6的实验结果可知，一方面，组合物C作为MMP-1抑制剂，能有效降低MMP-1含量，从而减少MMP-1降解I型胶原蛋白，另一方面，组合物C能够上调皮肤光老化小鼠皮肤中Ⅰ型胶原蛋白含量，且效果优于模型组、阳性药维生素C组和乙酰基六肽-8组。上述分析表明，组合物C具有预防或治疗修复紫外光老化、紫外线引起的皮肤光损伤或紫外光辐射引起的皮肤癌变等皮肤问题。

本发明进一步提供了一种用于抑制MMP-1表达的皮肤外用组合物的护肤品组合物，实施例4-8提供了具体组分及质量百分数。

表11：实施例4-8的组分及质量百分数(％)

上述实施例4-8提供的护肤品组合物，通过以下制备方法制得：

1)将霍霍巴油、1,2-己二醇、植物甾醇、甘油、透明质酸钠、羟苯甲酯和部分水加热到75-80℃，使其完全溶解；降温后，边搅拌边加入卡波姆，至卡波姆溶胀；将野黄芩素和刺五加苷B按实际比例加入，搅拌溶解；

2)溶解完全后加水补足，控制野黄芩素和刺五加苷B的总浓度为1.25-20μM，优选为5μM，搅拌均匀出样，得到实施例4-8提供的护肤品组合物。

在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。