靶向CD24和CD3的双特异性抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可同时靶向人白细胞分化抗原(CD24)及CD3的双特异性抗体，能有效激活T细胞活化相关信号，可杀伤CD24阳性肝癌细胞，是一种具有桥接T细胞和肝癌细胞功能的基因工程双特异性抗体。

背景技术

肝癌是一种高发病率和高死亡率的恶性肿瘤，由于肝癌起病隐匿，大多数患者确诊时处于肿瘤晚期，无法通过手术切除方式治疗。肝癌的一线用药为激酶抑制剂索拉非尼，但索拉非尼在延长患者生存和提高耐受性方面仍未满足临床需求，目前还需要开发针对肝癌更有效的疗法。免疫疗法由于具有依靠自身免疫系统、能够靶向杀伤肿瘤细胞而不杀伤正常细胞的优势，受到更多人的关注，是一种有效的肿瘤治疗手段。

肿瘤免疫疗法包括单克隆抗体、双特异性抗体、过继性细胞疗法和CAR-T等，其中，由于双特异性抗体与单抗相比具有双靶向的特点，能够发挥更好的疗效，因此成为了抗体研发的热门方向。从作用机制看，双特异性抗体分为细胞桥接、双靶点阻断、免疫细胞激活和促进蛋白复合物的形成等多种类型，细胞桥接双抗是指双特异性抗体的一个臂作用于肿瘤细胞表面抗原，起到靶向作用，另一个臂作用于免疫细胞，多为效应T细胞和NK细胞，起到招募作用，细胞桥接双抗能拉进效应细胞和肿瘤细胞的距离，达到杀伤肿瘤的目的。

由于肿瘤微环境中持续抗原刺激以及免疫抑制因子等的存在，肿瘤浸润T细胞表现出耗竭状态，其增殖能力和效应功能减弱或丧失。T细胞表面受体TCR识别MHC呈递的抗原刺激，识别的信号由CD3蛋白复合体传递到胞内。CD3是T细胞表面激活受体TCR的共刺激分子，胞内域包括ITAM信号基序，能将T细胞激活信号传递到胞内，从而活化T细胞。靶向CD3的单克隆抗体能结合并活化T细胞，活化的T细胞能有效抗击肿瘤细胞，此过程不依赖MHC分子。

CD24是一种在发育早期的B细胞、神经细胞和多种肿瘤细胞上表达的蛋白，被GPI锚定在细胞膜上，其蛋白核心骨架由33个氨基酸残基组成，包含丰富的N-糖和O-糖基化位点，具有高度糖基化特征，其表达与肿瘤的生长、转移和肿瘤细胞耐药性密切相关。CD24在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中高表达，并且，在晚期肝癌患者的血浆中也检测到CD24的高表达。Siglec-10分子是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglecs)家族成员，通过CD24分子的唾液酸表位与CD24相互作用，Siglec-10蛋白胞内包含ITIM信号基序，能够传递抑制信号。Siglec-10在多种免疫细胞表面表达，在肿瘤微环境中，巨噬细胞表面的Siglec-10蛋白与肿瘤细胞表面的CD24蛋白相互作用，激活下游ITIM信号基序，抑制巨噬细胞的吞噬功能，研究发现靶向CD24的抗体能有效恢复巨噬细胞的吞噬功能。由此可见，CD24有望成为肝癌肿瘤免疫治疗的一个有效靶点。

因此，本发明旨在开发一种同时靶向CD24和CD3的细胞桥接双抗，使其靶向肝癌细胞的同时招募并活化T细胞，发挥对肝癌细胞的杀伤作用。

发明内容

发明目的

本发明提供两种双特异性抗体(GT03和GT04)，该双特异性抗体同时靶向CD24和CD3，靶向肝癌细胞同时招募并活化T细胞，发挥对肝癌细胞的杀伤。

技术方案

一种双特异性抗体，其特征在于，由抗CD24的全长抗体与抗CD3抗体scFv通过linker连接形成，所述的双特异性抗体的重链由抗CD24抗体重链组成，其可变区氨基酸序列为SEQNO.1；轻链由抗CD24抗体轻链和抗CD3抗体scFv组成，CD24抗体可变区氨基酸序列为SEQNO.2，CD3抗体scFv氨基酸序列为SEQNO.3或SEQNO.4；其中的linker氨基酸序列为(GGGGS)n，n所取数值为3。

所述的双特异性抗体分子，其特征在于，所述双特异性抗体具有对称结构，重链由CD24抗体重链组成，其恒定区为人IgG1型；轻链从N端到C端依次包含CD24抗体的VL、κ链CL、linker和CD3抗体scFv，其中，连接的linker氨基酸序列为(GGGGS)n，n所取数值为3。

所述的双特异性抗体，其特征在于，所述重链恒定区包括具有SEQNO.5所示氨基酸序列，且重链按照EU编号234位氨基酸和235位氨基酸为丙氨酸、329位氨基酸为甘氨酸。这里强调的是这一段恒定区具有突变，这两种突变会降低抗体的ADCC和CDC效应，即防止双抗和T细胞因抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC效应)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC效应)被清除。

所述的双特异性抗体，其特征在于，双特异性抗体为GT03或GT04，其中GT03的氨基酸序列为SEQNO.8，GT04的氨基酸序列为SEQNO.9。

一种核酸分子，其特征在于其编码所述的双特异性抗体。

编码所述的核酸分子，其核苷酸序列为SEQNO.6或SEQNO.7

一种表达载体，含有所述的核酸分子。

所述的双特异性抗体在制备治疗癌症药物中的应用。

所述的应用，其特征在于，所述的癌症为肝癌。

有益效果

本发明所述的CD24抗体可变区序列如SEQNO.1和SEQNO.2所示，与CD24有高亲和力和特异性，所述的CD3抗体scFv序列如SEQNO.3和SEQNO.4所示，两种序列所编码的两种抗体分别为huSP34和huOKT3，分别为CD3低亲和力和高亲和力抗体。所制备的双特异性抗体与CD3阳性细胞的亲和力具有较大差异；对于CD3而言，亲和力低并不是件坏事，因为CD3抗体激活T细胞有着特定的识别表位和空间取向，GT03虽然亲和力较低，但识别表位能有利于其激活T细胞。并且高亲和力的CD3抗体可能会引起更高的细胞因子释放，导致更严重的副作用。同时本发明所述的双特异性抗体，具有所述的双特异性抗体恒定区且具有突变，这两个突变会降低抗体的ADCC和CDC效应，即防止双抗和T细胞因抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(ADCC效应)和补体依赖的细胞毒性作用(CDC效应)被清除。

故如实施例6的结果所示，GT03效果优于GT04，但两者所述双特异性抗体可与CD24阳性肝癌细胞和CD3阳性细胞结合，对于肝癌细胞均有较强的杀伤效果且杀伤效果优于两种单抗联用。

附图说明

图1为双特异性抗体分子构型图。图示αCD3scFv可为huSP34或huOKT3，所对应的双特异性抗体分别为GT03和GT04。

图2为双特异性抗体分子WesternBlot结果；泳道M为marker；lane1为双特异性抗体GT03非还原条带，lane2为双特异性抗体GT03还原条带，抗体轻链和重链分子量接近，约50kDa，显示为单一条带；lane3为双特异性抗体GT04非还原条带；lane4为双特异性抗体GT04还原条带，抗体轻链和重链分子量接近，约50kDa，显示为单一条带。

图3为流式检测双特异性抗体与肝癌细胞和Jurkat细胞结合图。A：双特异性抗体与BEL-7402细胞结合图；B：双特异性抗体与Jurkat细胞结合图。

图4为流式检测两种双特异性抗体与Jurkat细胞结合强弱对比图。

图5为生物膜干涉法检测双特异性抗体与重组人CD24抗原及重组人CD3e抗原的结合。A.GT03与重组人CD24蛋白结合；B.GT03与重组人CD3e蛋白结合；C.GT04与重组人CD24蛋白结合。

图6为LDH释放方法检测双抗促进PBMC对肝癌细胞杀伤结果。A.双抗GT03诱导PBMC杀伤BEL-7402结果及与两种单抗联用对比；B.双抗GT04诱导PBMC杀伤BEL-7402结果及与两种单抗联用对比。

具体实施方式

实施例1双特异性抗体的制备：

双特异性抗体轻、重链表达载体构建及双抗真核表达

1)设计上、下游引物，PCR分别获得CD24抗体可变区、IgG1重链恒定区以及CD3抗体scFv，通过overlap-PCR将CD24抗体重链可变区和IgG1重链恒定区进行拼接，获得双抗重链全长片段，CD24抗体轻链和CD3抗体scFv进行拼接，获得双抗轻链全长片段，利用BamHI和KpnI双酶切表达载体，通过一步克隆法分别连接双抗轻、重链全长片段和酶切载体，得到双特异性抗体的重、轻链表达载体。

2)将编码双特异性抗体的轻、重链的重组质粒按2.5:1的比例转染HEK293细胞，培养5天后4℃离心收集上清，经proteinA柱纯化后得到双特异性抗体。所制备的双特异性抗体构型如图1所示，其中：huSP34为CD3低亲和力，huOKT3为CD3高亲和力抗体。当CD3抗体scFv来自huSP34，双抗编号为GT03；当CD3抗体scFv来自huOKT3，双抗编号为GT04。

实施例2双特异性抗体WesternBlot检测：

1)分别制备双特异性抗体还原和非还原样品，经10％SDS-PAGE电泳分离。

2)将分离的样品转移至PVDF膜上，用5％的脱脂奶粉37℃孵育2h进行封闭。

3)用TBST漂洗10min，加入入HRP标记的羊抗人IgG抗体(生工生物，1:50000稀释)作为二抗，37℃孵育1h。

4)用PBST漂洗PVDF膜10min，漂洗三次。

5)将ECL化学发光显色液(翌圣生物，A、B液按1:1混合)均匀滴加在PVDF膜表面，置于曝光仪中曝光。结果如图2所示，泳道M为marker；lane1为双特异性抗体GT03非还原条带，lane2为双特异性抗体GT03还原条带，抗体轻链和重链分子量接近，约50kDa，显示为单一条带；lane3为双特异性抗体GT04非还原条带；lane4为双特异性抗体GT04还原条带，抗体轻链和重链分子量接近，约50kDa，显示为单一条带。

实施例3流式检测双特异性抗体与肝癌细胞(CD24高表达)和Jurkat细胞(高表达CD3)结合：

1)双特异性抗体与CD24+肝癌细胞和CD3+Jurkat细胞的结合可通过流式来检测，BEL-7402细胞有较高的CD24表达水平，Jurkat细胞有高CD3表达水平，细胞用含10％FBS的1640培养基，37℃，5％CO

2)对于肝癌细胞，将生长状态良好的细胞用胰酶消化，加入新鲜培养基重悬后计数，每管取2*10

3)4℃、1500rpm离心3min，弃上清。加入100μL浓度为100nM的双特异性抗体或单克隆抗体作为一抗，重悬细胞，加入100nM无关抗体作为同型对照，4℃孵育1h，使抗体和细胞结合；4℃、1500rpm离心3min，弃上清。加入500μl预冷PBS洗涤一次。

4)加入100μLAlexaFluor488标记的羊抗人IgG抗体(翌圣生物，1:200稀释)作为二抗，重悬细胞，4℃孵育30min。

5)4℃、1500rpm离心3min，弃上清。加入500μL预冷PBS洗涤两次。加入250μLPBS重悬，使用流式细胞仪进行检测。结果如图3所示，本发明的双特异性抗体能够有效的和CD24高表达的BEL-7402细胞及高表达CD3的Jurkat细胞结合，具有良好的肿瘤细胞靶向能力和T细胞结合能力。

实施例4流式检测两种双特异性抗体与Jurkat细胞(高表达CD3)结合强弱：

1)本发明采用两种亲和力具有较大差异的CD3抗体huSP34和huOKT3，构建的双特异性抗体分别为GT03和GT04，可以通过设置浓度梯度，流式检测平均荧光强度来判断两种双特异性抗体与CD3+Jurkat细胞的结合强弱。将生长状况良好的Jurkat细胞轻轻吹匀，1000rpm离心4min，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞，每管取2*10

2)加入100μL浓度为0.07-500nM的双特异性抗体作为一抗，重悬细胞，加入100nM无关抗体作为同型对照，4℃孵育1h，使抗体和细胞结合；后续步骤同实施例2。结果如图4所示，因为GT03的部分抗体来自于CD3低亲和力的huSP34，GT04来自于CD3高亲和力抗体的huOKT3，故与预期结果一致，GT03与Jurkat细胞(CD3高表达)的结合显著低于GT04(显著性分析方法为Wilcoxon符号秩检验，P<0.05)。

实施例5生物膜干涉法检测双特异性抗体与重组人CD24抗原及重组人CD3e抗原的结合：1)抗原抗体结合的动力学检测可通过生物膜干涉法完成，并计算抗原抗体结合的K

结果如图5所示。A:GT03与重组人CD24蛋白结合；B.GT03与重组人CD3e蛋白结合；C.GT04与重组人CD24蛋白结合。

结果：

表1双特异性抗体与抗原结合平衡解离常数

实施例6LDH释放方法检测双抗促进PBMC对肝癌细胞杀伤：

1.PBMC的提取

1)取健康人的血液10mL，加入等体积PBS稀释。取3mL淋巴细胞分离液(Ficoll)加入10mL EP管底部，缓慢加入6mL稀释后的血液，形成分层。

2)离心机升速调为1，降速调为0,800g离心20min，离心结束后吸取EP管中的白色条带。3)往吸取的液体中加入两倍体积的PBS缓冲液，混匀后2000rpm离心8min，弃上清。在沉淀中加入合适量的红细胞裂解液裂解3min，加入3倍体积的PBS缓冲液终止反应，2000rpm离心8min。

4)弃上清，加入5mLPBS缓冲液清洗沉淀2次。

5)弃上清，底部的细胞用2mL新鲜1640培养基重悬并计数。

2.双抗促进PBMC杀伤肿瘤细胞检测

1)生长状况良好的BEL-7402细胞，胰酶消化后用新鲜的1640培养基重悬并计数，取10000个BEL-7402细胞、50000个提取的PBMC细胞及浓度范围为7-500nM的双特异性抗体共孵育，同时设置BEL-7402和PBMC共孵育组、BEL-7402最大杀伤或最小杀伤组、1640培养基组。

2)共孵育36h后离心，孵育结束前1h在BEL-7402最大杀伤组中加入10％体积LDH释放试剂(碧云天，乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒)，取上清作为待测样品，检测样品中LDH释放。

3)配置LDH检测工作液，在新的96孔板中加入120μL待测样品和60μLLDH检测工作液，避光常温反应30min，在490nm波长检测吸光值。

4)杀伤率的计算为(双抗组OD490-最小杀伤组OD490)/(最大杀伤组OD490-最小杀伤组OD490)*100％；

结果如图6所示。A：GT03组和αCD24与huSP34联用组杀伤效果对比，双特异性抗体能够发挥较强的肿瘤杀伤作用，且效果优于两种单抗联用；B：GT04组和αCD24与huOKT3联用组杀伤效果对比，双特异性抗体能够发挥较强的肿瘤杀伤作用，效果同样优于两种单抗联用(显著性分析方法为Wilcoxon符号秩检验，P<0.05)。GT03相比GT04能够发挥更好的肿瘤细胞杀伤效果，其原因可能是CD3抗体激活T细胞有着特定的识别表位和空间取向，GT03虽然亲和力较低，但识别表位能有利于其激活T细胞。并且高亲和力的CD3抗体可能会引起更高的细胞因子释放，导致更严重的副作用。