一种内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针及其制备方法，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

铁死亡(Ferroptosis)这一概念最早在2012年由Brent Stockwell提出，是一种区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型细胞程序性死亡方式。铁死亡具有铁依赖性，表现为铁超载、脂质过氧化物蓄积和线粒体膜密度增加等特点。铁死亡的发生使细胞形态产生独特的变化：细胞变成圆形并相互分离，线粒体体积缩小、内膜凝聚、嵴皱缩或消失和外膜破裂，但细胞核结构完整，无凝聚或染色质着边现象。铁死亡的主要机制是，在二价铁或酯氧合酶的作用下，细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，进而诱导细胞死亡。此外，还表现为谷胱甘肽系统等抗氧化体系的调控核心酶GPX4的失活或活性降低。近期研究表明，铁死亡对肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病等多种疾病的发生发展具有重要意义，抑制铁死亡可为这些疾病的治疗提供新思路。因而，开发一种快速筛选铁死亡抑制剂的方法，对于治疗铁死亡相关的疾病具有重要指导意义。

传统的铁死亡抑制剂筛选方法包括MTT法、电子显微镜法等，但是这些方法通常会引起待测样品的损失和生物样品的破坏，且样品制备耗时，不适用于实时监测抑制剂对铁死亡的抑制效果。相比之下，荧光成像由于具有高灵敏度、高选择性和实时监测，已广泛用于检测生物体系内的活性小分子。通过荧光成像，对铁死亡密切相关生物分子的含量进行实时监测可为高效、快速筛选铁死亡抑制剂提供一种有效可行的办法。目前，已有文献报道铁死亡的特征是谷胱甘肽依赖型抗氧化体系的损伤，以及毒性脂质氧化物的大量堆积。在铁死亡过程中，生物膜上的多不饱和脂肪酸在Fenton反应介导下转化为脂质过氧化物，随后在谷胱甘肽的还原作用下转化为脂质醇类物质。因而，在铁死亡过程中谷胱甘肽被一直消耗，直至耗尽。另一方面，内质网是重要的细胞器，通常拥有细胞中二分之一以上的生物膜系统，在铁死亡过程中极易遭受氧化损伤，导致内质网的谷胱甘肽含量骤变。因而，通过荧光成像实时监测内质网中谷胱甘肽的含量，可用于快速评估铁死亡抑制剂的效果。但检索发现，用于筛选铁死亡抑制剂的内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针及其应用还未见报道。

发明内容

针对现有的技术问题，本发明提供一种可用于筛选铁死亡抑制剂的新型内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针及其制备方法；本发明还提供了上述荧光探针的制备方法和在筛选铁死亡抑制剂方面的用途。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针，其结构式如式(I)所示：

制备所述内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针的方法，合成路线如下：

制备所述内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针的方法，具体步骤如下：

(a)4-二乙氨基苯磺酰胺溶于二氯甲烷中，并且置于冰浴中冷却至0℃，再将溶有二碳酸二叔丁酯的二氯甲烷溶液滴加进去，滴加完毕，撤掉冰浴，于室温下搅拌6h，反应完毕后，除去溶剂，得到粗品，对粗品进一步纯化，得到化合物1；所述的步骤(a)中对粗品进一步纯化，具体步骤为：粗品分散到水中，随后用二氯甲烷和水萃取，有机相旋蒸得白色固体，即为化合物1；

所述的4-二乙氨基苯磺酰胺与二碳酸二叔丁酯的质量比为800:872；

(b)将步骤(a)得到的化合物1、氯化亚铜、环己基异氰酸酯溶于DMF中，在氮气保护下室温搅拌24小时，反应完毕后，过滤除去沉淀，向滤液中加入冰水，加浓盐酸酸化后得白色沉淀，抽滤得白色固体，将所得白色固体溶于二氯甲烷中，加入三氟乙酸，室温搅拌5小时，反应完毕后将溶剂旋转蒸发得到透明油状物，并通过柱层析纯化得到化合物2；

所述的步骤(b)中化合物1、氯化亚铜、环己基异氰酸酯的质量比为600:19.8:375；

(c)将4-溴-1，8-奈二甲酸酐、β-丙氨酸乙酯盐酸盐溶于乙醇中，90度加热回流，反应5小时，反应完毕后得棕色沉淀，抽滤得1.37g棕色固体为化合物3；所述的步骤(c)中4-溴-1，8-奈二甲酸酐、β-丙氨酸乙酯盐酸盐的质量比为1.38:1.23；

(d)将化合物3、4-吡啶硫醇和碳酸钾溶于DMF中，保温在80℃，反应15小时，反应完毕后加入水，并用二氯甲烷萃取，再经无水硫酸钠干燥，然后通过柱层析法分离得到化合物4；

所述的步骤(d)中化合物3、4-吡啶硫醇和碳酸钾的质量比为1200:388:483；

(e)将化合物4用二氯甲烷溶解，置于冰浴中冷却至零度，然后分批加入间氯过氧苯甲酸，撤除冰浴，恢复至室温，反应4小时，用柱层析法分离得到化合物5；

所述的步骤(e)中化合物4与间氯过氧苯甲酸的质量比为1200:388；

(f)将化合物5溶于四氢呋喃和水配成的溶液中，然后取L氢氧化钠水溶液加入上述溶液中，反应1小时后，使用浓盐酸调至为中性，使用二氯甲烷萃取，所得油相经无水硫酸钠干燥后用柱层析法纯化得到化合物6；

所述的步骤(f)中四氢呋喃和水配成的溶液中，四氢呋喃和水的体积比为2:1，氢氧化钠水溶液中氢氧化钠与水的质量体积比为0.4:5g/ml；

(g)将化合物2、化合物6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺溶于DMF中，在氮气保护下，室温搅拌4小时，反应完毕后，反应液中加入水，并用二氯甲烷萃取，使用无水硫酸钠干燥后用柱层析法纯化得到用于筛选铁死亡抑制剂的内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针。所述的步骤(g)中化合物2、化合物6、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑的质量比为97.5:123:191:13.5；

所述的N,N-二异丙基乙胺与化合物2的体积质量比为100:97.5μL/mg。

所述的内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针在检测溶液或活细胞内质网中谷胱甘肽的应用。

所述的内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针在筛选铁死亡抑制剂方面的应用。内质网靶向型谷胱甘肽荧光探针的应用在评估评估芸香叶苷作为铁死亡抑制效果方面的应用。

本荧光探针检测内质网谷胱甘肽含量的机理如下：

谷胱甘肽能特异性地和本发明的荧光探针发生取代反应，进而生成具有荧光的萘胺衍生物。通过定量检测溶液所发射荧光的强度，可以确定溶液或细胞中谷胱甘肽的含量。本发明地荧光探针含有环己烷基苯磺胺结构，可与内质网上ATP敏感性钾通道地磺酰脲受体结合，因而具有内质网靶向性，可选择性地检测内质网的谷胱甘肽含量。

本荧光探针筛选铁死亡抑制剂的机理如下：

在铁死亡过程中，生物膜上的多不饱和脂肪酸在Fenton反应介导下转化为脂质过氧化物，进而与谷胱甘肽发生氧化还原反应，导致细胞中的谷胱甘肽一直被消耗，直至耗尽。另一方面，内质网通常拥有细胞中二分之一以上的生物膜系统，其巨大的膜体系在铁死亡过程中更易遭受氧化损伤，导致内质网的谷胱甘肽含量更易发生变化。因而，通过荧光成像实时监测内质网中谷胱甘肽的含量，可直观地检测铁死亡发展过程，实现对铁死亡抑制剂效果的快速评估。

芸香叶苷是一种具有较强还原性的抗炎和抗病毒药物分子，能够还原铁死亡过程中的脂质过氧化物，进而抑制谷胱甘肽的消耗。同时，芸香叶苷能够络合铁离子，阻止生物膜上的多不饱和脂肪酸在Fenton反应介导下转化为脂质过氧化物。因而推测芸香叶苷可作为一种新型铁死亡抑制剂。本发明中，构建铁死亡细胞模型，使用芸香叶苷给药，并随后用荧光探针染色，通过荧光成像检测内质网谷胱甘肽的含量变化，评估芸香叶苷对铁死亡的抑制效果。

本发明具有以下优点：

本发明的荧光探针能够与谷胱甘肽进行特异性反应，通过荧光信号的产生对谷胱甘肽进行定性检测，能够对活细胞内质网中的谷胱甘肽进行实时快速检测。此外该荧光探针，能够快速检测活细胞内质网中的谷胱甘肽。同时，本发明以芸香叶苷为例，提出了基于荧光成像内质网中谷胱甘肽含量，快速筛选铁死亡抑制剂的方法。

附图说明

图1为化合物1的

图2为化合物1的

图3为化合物2的

图4为化合物2的

图5为化合物3的

图6为化合物3的

图7为化合物4的

图8为化合物4的

图9为化合物5的

图10为化合物5的

图11为化合物6的

图12为化合物6的

图13为荧光探针的

图14为荧光探针的

图15为荧光探针的LC-MS数据；

图16为荧光探针对不同浓度谷胱甘肽的荧光光谱；

图17为荧光探针对不同浓度谷胱甘肽的荧光线性关系；

图18为荧光探针对干扰物质与谷胱甘肽的荧光强度；

图19为荧光探针对干扰物质与谷胱甘肽的荧光强度；

图20为荧光探针在活细胞中的细胞器定位成像；

图21为荧光探针在活细胞中对谷胱甘肽的荧光成像；

图22为荧光探针对铁死亡过程中谷胱甘肽含量的荧光成像；

图23为荧光探针对铁死亡抑制剂存在情况下铁死亡过程中谷胱甘肽含量的荧光成像。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1荧光探针的合成

(1)化合物1的合成：将800mg 4-二乙氨基苯磺酰胺溶于10mL二氯甲烷中，置于冰浴中冷至零度。然后将872mg二碳酸二叔丁酯溶于1mL二氯甲烷中，并缓慢添加到上述溶液中，加入完毕后缓慢去除冰浴，室温搅拌6小时。反应完毕后，将反应液减压蒸馏除去二氯甲烷，并分散到20mL水中。随后用40mL二氯甲烷和水萃取，有机相旋蒸得972mg白色固体为化合物1。化合物1的

(2)化合物2的合成：将600mg化合物1、19.8mg氯化亚铜、375mg环己基异氰酸酯溶于10mLDMF中，在氮气保护下室温搅拌24小时。反应完毕后，过滤除去沉淀，向滤液中缓慢加入冰水，加浓盐酸酸化后得白色沉淀，抽滤得白色固体。随后将所得白色固体溶于16mL二氯甲烷中，然后加入4mL三氟乙酸，室温搅拌5小时，反应完毕后将溶剂旋转蒸发得到透明油状物，并通过柱层析(二氯甲烷：甲醇＝15：1)纯化得到344.5mg化合物2。化合物2的

(3)化合物3的合成：将1.38g 4-溴-1，8-奈二甲酸酐和1.23gβ-丙氨酸乙酯盐酸盐(307.22mg，2.5mmol)溶于20mL乙醇中，90度加热回流，反应5小时。反应完毕后得棕色沉淀，抽滤得1.37g棕色固体为化合物3。化合物3的

(4)化合物4的合成：将1.20g化合物3、388mg 4-吡啶硫醇和483mg碳酸钾溶于10mLDMF中，80度加热回流，反应15小时。反应完毕后加入50mL水，并用50mL二氯甲烷萃取，再经无水硫酸钠干燥，然后通过柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝10：1)分离得到831mg化合物4。化合物4的

(5)化合物5的合成：将812mg化合物4用20mL二氯甲烷溶解，置于冰浴中冷却至零度，然后分批加入862mg间氯过氧苯甲酸，撤除冰浴，逐渐恢复至室温，反应4小时，用柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝10：1)分离得到359mg化合物5。化合物5的

(6)化合物6的合成：将219mg化合物5溶于7mL四氢呋喃和3.5mL水配成的溶液中，然后取0.5mL氢氧化钠水溶液(0.4g氢氧化钠溶于5mL水中)缓慢加入上述溶液中。反应1小时后，使用浓盐酸调至为中性，随后使用10mL二氯甲烷萃取，所得油相经无水硫酸钠干燥后用柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝5：1)纯化得到144mg化合物6。化合物6的

(7)荧光探针的合成：将97.5mg化合物2、123mg化合物6、191mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、13.5mg 1-羟基苯并三唑和100μLN,N-二异丙基乙胺溶于2mLDMF中，在氮气保护下，室温搅拌4小时。反应完毕后，反应液中加入6mL水，并用10mL二氯甲烷萃取，使用无水硫酸钠干燥后用柱层析法(二氯甲烷：甲醇＝10：1)纯化得到98mg荧光探针。荧光探针的

实施例2荧光探针检测不同浓度谷胱甘肽

配制不同浓度的谷胱甘肽PBS溶液(pH为7.4，浓度为0～5mM)1mL，然后加入9mL浓度为50μM的实施例1获得的荧光探针的PBS溶液(pH为7.4，含5％甲醇)；进行荧光检测(λ

实施例3荧光探针的选择性

取10份5mL的5mM荧光探针的PBS溶液(pH为7.4，含5％甲醇)，然后分别加入50μL浓度为100μM的Hcys、Na

实施例4荧光探针对内质网的靶向性成像

将1份人子宫颈癌HeLa细胞株加入铺有盖玻片的培养皿中，并置于温度为37℃的5％二氧化碳培养箱中，在采用DMEM培养基(含10％小牛血清)以及100μg/ml的双抗进行培养，36小时后对铺有并长满细胞的盖玻片的培养皿采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次，加入5μM荧光探针在37℃下培养20分钟，然后再加入1μM市售内质网红色荧光染料后继续培养20分钟，然后进行荧光成像，结果如图20所示。由图20可知，来自于荧光探针的绿色荧光(A)和来自于内质网红的红色荧光(B)具有很好的重叠度(C)，共定位系数R为0.92(D)，表明该荧光探针具有优异的内质网靶向性。

实施例5荧光探针内质网上谷胱甘肽的荧光成像

将3份人子宫颈癌HeLa细胞株分别加入到三个铺有盖玻片的培养皿中，并置于温度为37℃的5％二氧化碳培养箱中，在采用DMEM培养基(含10％小牛血清)以及100μg/ml的双抗进行培养，36小时后对铺有并长满细胞的盖玻片的培养皿采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次。取一份铺有细胞的培养皿，加入200μM N-乙基马来酰亚胺(NEM)并培育2小时。另取一份铺有细胞的培养皿，加入200μM N-乙基马来酰亚胺(NEM)并培育4小时。将三份细胞中分别加入5μM荧光探针在37℃下培养20分钟，然后进行荧光成像，结果如图21所示。由图21可知，只加入荧光探针的细胞在405nm的激光激发下可发射强烈的绿色荧光(A)，而加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)培育2小时(B)或4小时(C)的细胞的荧光强度则发生明显的降低，表明细胞中的谷胱甘肽被NEM消除，该荧光探针可用于检测内质网的谷胱甘肽。

实施例6荧光探针对铁死亡过程中谷胱甘肽含量的荧光成像

将4份人子宫颈癌HeLa细胞株分别加入到四个铺有盖玻片的培养皿中，并置于温度为37℃的5％二氧化碳培养箱中，在采用DMEM培养基(含10％小牛血清)以及100μg/ml的双抗进行培养，36小时后对铺有并长满细胞的盖玻片的培养皿采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次。第一份铺有细胞的培养皿不做处理。第二份铺有细胞的培养皿，加入10μM铁死亡诱导剂Erastin(Era.)并培育4小时。第三份铺有细胞的培养皿，加入10μM铁死亡诱导剂Erastin(Era.)和100μM铁死亡抑制剂去铁胺(DFO)并培育4小时。第四份铺有细胞的培养皿，加入10μM铁死亡诱导剂Erastin(Era.)和15μM铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)并培育4小时。将上述四份细胞中分别加入5μM荧光探针在37℃下培养20分钟，然后进行荧光成像。由图22所示，在405nm波长的光激发下，第一份细胞出现强烈的绿色荧光(A)，Erastin处理的细胞的荧光出现显著的降低(B)，而同时使用Erastin和DFO(C)、或Erastin和Fer-1(D)处理的细胞的荧光并未出现显著的变化。由此可见，细胞内质网的谷胱甘肽含量在Erastin诱导的铁死亡过程中呈现显著的下降，而铁死亡抑制剂DFO和Fer-1可有效的阻止谷胱甘肽含量的下降。通过对内质网谷胱甘肽含量的实时成像，可评估铁死亡抑制剂的效果。

实施例7荧光探针在评估铁死亡抑制剂效果的应用

将6份人子宫颈癌HeLa细胞株分别加入到六个铺有盖玻片的培养皿中，并置于温度为37℃的5％二氧化碳培养箱中，在采用DMEM培养基(含10％小牛血清)以及100μg/ml的双抗进行培养，36小时后对铺有并长满细胞的盖玻片的培养皿采用不含血清的DMEM培养基冲洗3次。第一份铺有细胞的培养皿不做处理。第二份铺有细胞的培养皿，加入10μM铁死亡诱导剂Erastin(Era.)并培育4小时。第三份铺有细胞的培养皿，加入10μM Erastin(Era.)和20μM维生素E(VE)并培育4小时。第四份铺有细胞的培养皿，加入10μM Erastin(Era.)和20μM芸香叶苷(Rut.)并培育4小时。第五份铺有细胞的培养皿，加入10μM Erastin(Era.)和40μM芸香叶苷(Rut.)并培育4小时。第六份铺有细胞的培养皿，加入10μM Erastin(Era.)和40μM芸香叶苷(Rut.)并培育4小时。将上述六份细胞中分别加入5μM荧光探针在37℃下培养20分钟，然后进行荧光成像。由图23所示，在405nm波长的光激发下，第一份不做处理的细胞出现强烈的绿色荧光(A)，Erastin处理的细胞的荧光(B)出现显著的降低，而第三份使用Erastin和VE处理的细胞荧光(C)未发生显著变化，同时使用Erastin和芸香叶苷处理的细胞荧光(D、E和F)也并未发生显著变化。由此可见，细胞内质网的谷胱甘肽含量在Erastin诱导的铁死亡过程中呈现显著的下降，而铁死亡抑制剂维生素E可有效的阻止谷胱甘肽含量的下降。同时，不同浓度的芸香叶苷也能够组织细胞中谷胱甘肽含量的骤降，表明芸香叶苷对铁死亡有较好的抑制效果，可作为潜在的铁死亡抑制剂。