一种玉米抗粘附肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于活性肽制备技术领域，具体涉及一种玉米抗粘附肽及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性杆菌，螺旋形、微需氧、对生长条件要求十分苛刻，1983年首次从慢性活动性胃炎的胃粘膜活检组织中分离成功，是所知能够在猕猴、大鼠等动物胃中生存的微生物种类。幽门螺杆菌感染引起的疾病有胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等，严重者可能会导致胃癌。

目前，幽门螺旋杆菌感染的治疗方案包括两大类，1.是以抗生素为主，辅加抑酸剂(铋剂)的方案：2.是以质子泵抑制剂为主的方案，常用抗生素为青霉素、庆大霉素、克拉霉素和阿莫西林等。但随着幽门螺旋杆菌对抗生素的耐药性逐年上升，其根除率也在下降，并且服用抗生素具有很多副作用，如肠道不适、过敏等。因此，开发抗生素的替代疗法对于防治幽门螺旋杆菌感染和治疗具有重要的意义。

近年来，已经报道了一些能够抑制幽门螺旋杆菌粘附的天然来源的食源性组分被相继报道，如卵黏蛋白肽、小麦胚芽蛋白肽、蔓越莓中的黄酮类物质和多糖等，但总体种类较少。因此研发天然、安全、价格低廉且更高效的具有抑制幽门螺旋杆菌粘附作用的食源性组分具有重要意义。

玉米蛋白粉(corn gluten meal，CGM)是玉米湿法生产淀粉中产量最大、蛋白质含量最高的副产物(约占60％)，但是因其溶解性差和疏水性强的特性限制了其在食品行业中的应用，导致大多玉米蛋白粉均直接作为饲料使用，造成了其粮食资源的极大浪费。因此，倘若能够对玉米蛋白进行改性，开发具有抑制幽门螺旋杆菌粘附活性的功能食品，提高其附加值，对玉米蛋白的精深加工具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种玉米抗粘附肽及其制备方法和应用，所述玉米抗粘附肽为一种新的活性肽，具备抑制幽门螺旋杆菌粘附的作用。

本发明提供了一种玉米抗粘附肽，所述玉米抗粘附肽的氨基酸序列包括TIFPQ、LGQCVEF和TIIPQ中的任意一种或多种。

优选的，所述玉米抗粘附肽的氨基酸序列为TIFPQ、LGQCVEF和TIIPQ中的任意一种或多种。

本发明提供了上述技术方案所述的玉米抗粘附肽的制备方法，包括如下步骤：

以中性蛋白酶酶解玉米蛋白粉，得到酶解液，所述酶解液中包括所述玉米抗粘附肽。

优选的，所述酶解前，将玉米蛋白粉制备成悬浊液，所述悬浊液中玉米蛋白粉的质量浓度为15％(w/v)。

优选的，所述中性蛋白酶的用量为400U/g蛋白；所述酶解的温度为45℃，时间为150min，pH为7.0。

优选的，所述酶解后，还包括对所述酶解液进行分离纯化，收集分子量小于1000Da的组分，得到所述玉米抗粘附肽。

优选的，所述分离纯化包括凝胶色谱分离和离子交换色谱分离。

优选的，用于所述凝胶色谱分离的色谱预装柱为Superdex Peptide 10/300GL；所述离子交换色谱分离包括两步离子交换色谱分离，第一步离子交换色谱分离使用的离子交换剂为Q-Sepharose High Performance，第二步离子交换色谱分离使用的离子交换剂为Mone Q。

本发明还提供了所述的玉米抗粘附肽或所述的制备方法得到的一种玉米抗粘附肽在制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附功能的产品中应用。

本发明还提供了一种具备抑制幽门螺旋杆菌粘附功能的产品，所述产品中包括上述技术方案所述的玉米抗粘附肽或所述的制备方法得到的玉米抗粘附肽。

有益效果：

本发明提供了一种玉米抗粘附肽，所述玉米抗粘附肽的氨基酸序列包括TIFPQ、LGQCVEF和TIIPQ中的任意一种或多种。本发明所述玉米抗粘附肽从玉米蛋白粉中分离得到，为一种新的玉米抗粘附肽，其具有抑制幽门螺旋杆菌粘附的作用，可以用于制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附功能的药品或食品，为幽门螺旋杆菌感染的防治提供技术支持。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中玉米抗粘附肽制备的技术路线图；

图2为玉米抗粘附肽(TIFPQ)的质谱检测图；

图3为玉米抗粘附肽(LGQCVEF)的质谱检测图；

图4为玉米抗粘附肽(TIIPQ)的质谱检测图；

图5为菌落浓度与OD

图6为FITC荧光强度值和OD

具体实施方式

本发明提供了一种玉米抗粘附肽，所述玉米抗粘附肽的氨基酸序列包括TIFPQ、LGQCVEF和TIIPQ中的任意一种或多种。

本发明所述玉米抗粘附肽的氨基酸序列优选为TIFPQ(SEQ ID NO.1)、LGQCVEF(SEQ ID NO.2)和TIIPQ(SEQ ID NO.3)中的任意一种或多种，更优选为TIFPQ、LGQCVEF或TIIPQ。本发明所述玉米抗粘附肽从玉米蛋白粉中分离得到，具有抑制幽门螺旋杆菌粘附的作用。

本发明还提供了上述技术方案所述的玉米抗粘附肽的制备方法，包括如下步骤：

以中性蛋白酶酶解玉米蛋白粉，得到酶解液，所述酶解液中包括所述玉米抗粘附肽。

本发明在所述酶解前，优选还包括将玉米蛋白粉与水混合，得到悬浊液。本发明所述悬浊液中玉米蛋白粉的质量浓度优选为15％(w/v)。本发明所述玉米蛋白粉优选为经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉，所述玉米蛋白粉可以充分的去掉与蛋白质紧密结合的淀粉物质，有利于蛋白质的酶解。本发明对所述玉米蛋白粉的来源没有特殊限定，从本领域中常规购买的经挤压膨化后去淀粉的玉米蛋白粉均可。

得到所述悬浊液后，本发明优选以中性蛋白酶酶解所述悬浊液，得到酶解混合物。本发明所述中性蛋白酶的用量优选为400U/g蛋白，所述蛋白优选以玉米蛋白粉中蛋白含量计。本发明所述酶解的温度优选为45℃；所述酶解的时间优选为150min；所述酶解的pH优选为7.0。

得到所述酶解混合物后，本发明优选还包括对所述酶解混合物进行灭酶反应，所述灭酶反应的温度优选为100℃，时间优选为10min。完成所述灭酶反应后，本发明优选还包括对所述灭酶反应后的混合物进行离心，取上清液，即为酶解液。本发明所述离心的转速优选为4000r/min，时间优选为10min。本发明所述酶解液中包括所述玉米抗粘附肽。

得到所述酶解液后，本发明优选对所述酶解液进行分离纯化，收集分子量小于1000Da的组分，得到所述玉米抗粘附肽。

本发明优选采用凝胶色谱对所述酶解液进行分离，收集抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对更强且分子量小于1000Da的组分。本发明所述所述凝胶色谱分离的预装柱为Superdex Peptide 10/300GL。本发明所述凝胶色谱分离的条件优选包括：上样浓度为50mg/mL，上样量为1mL；洗脱液为pH 7.0的含0.15mol/LNaCl的20mM PBS缓冲液；洗脱液的流速为0.25mL/min；检测波长为214nm。本发明优选还包括测定收集得到的各组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，得到抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对更强且分子量小于1000Da的组分。本发明优选采用实施例1中所述的方法测定所述抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，下同，不再赘述。本发明所述抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对更强且分子量小于1000Da的组分中的蛋白浓度优选为4mg/mL。

得到所述抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对更强且分子量小于1000Da的组分后，本发明优选对所述抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对更强且分子量小于1000Da的组分进行第一步交换色谱分离，得到组分A。本发明在进行第一步离子交换色谱分离时，使用的离子交换剂优选为Q-Sepharose High Performance。本发明进行所述第一步离子交换色谱分离的条件优选包括：上样量为50mL；洗脱液A优选为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为20mM，pH值优选为7.5；洗脱液B为pH 7.5的含1mol/LNaCl的20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱液的流速为2mL/min，检测波长为214nm，梯洗体积60mL，峰组分收集的体积为6mL/管。本发明优选还包括测定收集得到的峰组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，得到抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对更强的组分，即为组分A。本发明所述组分A中的蛋白浓度优选为2mg/mL。

得到所述组分A后，本发明优选对所述组分A进行第二步离子交换色谱分离，得到组分B。本发明所述第二步离子交换色谱分离使用的离子交换剂优选为Mone Q。本发明进行所述第二步离子交换色谱分离的条件优选包括：上样量为10mL；洗脱液A优选为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为20mM，pH值优选为7.0；洗脱液B优选为pH 7.0含1mol/LNaCl的20mM Tris-HCl缓冲液；洗脱液的流速优选为1mL/min，检测波长优选为214nm，梯洗体积优选为20mL，峰组分收集的体积优选为1mL/管。本发明优选还包括测定收集得到的峰组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，得到抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对更强的组分，即为组分B。

得到所述组分B后，本发明优选对所述组分B进行质谱测序，得到所述玉米活性肽。本发明所述玉米活性肽的氨基酸序列包括TIFPQ、LGQCVEF和TIIPQ。本发明优选采用LC-MS/MS进行所述质谱测序。本发明对所述质谱测序的过程和步骤没有特殊限定，采用本领域中常规质谱测序步骤即可。进行所述质谱测序前，本发明还包括对所述第二组分进行脱盐冻干。本发明对所述脱盐冻干的过程、步骤以及脱盐后的状态均没有特殊限定，采用本领域中常规脱盐冻干的过程和步骤即可。

本发明还提供了所述的玉米抗粘附肽或所述的制备方法得到的玉米抗粘附肽在制备具备抑制幽门螺旋杆菌粘附功能的产品中应用。本发明所述产品优选包括食品和药品。本发明对所述食品和药品的类型没有特殊限定，本领域中常规类型的食品和药品均可。

本发明还提供了一种具备抑制幽门螺旋杆菌粘附功能的产品，所述产品中包括上述技术方案所述的玉米抗粘附肽或所述的制备方法得到的玉米抗粘附肽。本发明所述玉米抗粘附肽优选为所述产品中的活性成分。本发明对所述产品中所述玉米抗粘附肽的用量没有特殊限定，根据制备的产品常规添加即可。本发明所述产品优选包括药品和/或食品。本发明所述产品优选还包括辅料和/或其他活性成分。当所述产品中还包括其他活性成分时，本发明对所述其他活性成分的类型、功效和用量均没有特殊限定，依据制备的产品合理添加即可。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

在下述实施例中所使用的方法，如无特殊说明，采用的均为本领域中的常规试验方法；所使用的生物材料和试验材料，如无特殊说明，均可通过本领域中常规购买渠道获得。

实施例1

一种玉米抗粘附肽，由以下步骤组成(技术路线图见图1)：

1、玉米蛋白酶解液的制备

取一定量经挤压膨化并去除淀粉的玉米蛋白粉(购自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司)，加水配制成底物浓度为15％(w/v)的悬浊液，然后用中性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：加酶量400U/g蛋白，酶解温度45℃，酶解时间150min，酶解pH 7.0，酶解结束后100℃加热灭酶10min，酶解物在4000r/min离心10min并弃去沉淀，所得上清液为玉米蛋白酶解液，通过测定其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，确认其为具有高抑制幽门螺旋杆菌粘附活性多肽混合物。抑制幽门螺旋杆菌粘附活性测定的方法均参照步骤5中进行，下同，不再赘述。

2、玉米蛋白酶解液的凝胶色谱分离

所使用的凝胶色谱柱为Superdex Peptide 10/300GL预装柱，将步骤1中具有高抑制幽门螺旋杆菌粘附活性的多肽混合物采用凝胶色谱分离得到不同分子量组分的多肽混合物，上样浓度50mg/mL，上样量1mL，洗脱液为pH 7.0含0.15mol/LNaCl的20mM PBS缓冲溶液，流速为0.25mL/min，检测波长为214nm；测定各分子量组分的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，收集小于1000Da组分且抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对较高的组分用于离子交换色谱分离。

3、离子交换色谱分离

3.1Q-Sepharose High Performance强阴离子交换色谱分离

将凝胶色谱所得分子量小于1000Da且抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对较高的组分过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为4mg/mL，使用强阴离子交换剂为Q-SepharoseHigh Performance分离。上样量为50mL，所述强阴离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.5的20mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：pH7.5含1mol/L NaCl的的20mMTris-HCl缓冲液，流速为2mL/min，检测波长214nm，梯洗体积为60mL，峰组分每管收集6mL；测定各管收集液的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，收集抑制幽门螺旋杆菌粘附活性相对较高的组分(第6管)用于Mono Q离子交换色谱分离。

3.2Mono Q离子交换色谱

步骤3.1中分离得到的高活性组分使用Mono Q离子交换色谱进一步分离。将上一步离子交换色谱所得高活性组分过0.22μm的微孔滤膜，所得样品蛋白浓度为2mg/mL，上样量10mL，所述Mono Q离子交换色谱的洗脱液A：pH 7.0的20mM的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B：pH 7.0含1mol/L NaCl的的20mM Tris-HCl缓冲液，流速为1mL/min，检测波长214nm，梯洗体积为20mL，峰组分每管收集1mL；测定各管收集液的抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，收集抑制幽门螺旋杆菌粘附活性较高的组分(第10管)备用。

4、LC-MS/MS质谱测序

将步骤3.2中得到的组分脱盐冻干后进行质谱测序得到氨基酸序列分别为TIFPQ、LGQCVEF和TIIPQ的玉米抗粘附肽，结果如图2～4所示。

5、玉米抗粘附肽抑制幽门螺旋杆菌粘附活性的测定

将步骤4中得到的玉米抗粘附肽化学合成后(委托上海强耀生物科技有限公司合成)，测定其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性。

5.1玉米抗粘附肽抑制幽门螺旋杆菌粘附活性的测定：

1)利用H.pylori ATCC43504菌株作为抗粘附活性试验测定菌株。在37℃条件下将经过冻存的H.pylori ATCC43504菌株解冻，先与液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K

将传代的H.pylori ATCC43504的菌液，进行四次10倍梯度稀释获得五种不同浓度的菌液，在600nm条件下测定幽门螺旋杆菌菌液的OD值，同时通过平板涂布法计算菌落浓度，建立菌落浓度与OD

2)冻存人胃粘膜上皮细胞(GES-1)解冻后移入细胞培养瓶中，细胞培养基组成为1％青链霉素混合液、10％胎牛血清和89％DMEM培养基。在37℃，5％CO

3)异硫氰酸荧光素(FITC)标记幽门螺旋杆菌

制备FITC浓度为2mg/mL的DMSO溶液，无菌滤膜过滤处理。按照1：1的体积比将步骤1)中制备得到的传代的H.pylori ATCC43504的菌液与其混匀，在避免光照的条件下，生化摇摆台上混合30min后，在4500r/min的转速下离心处理3min，除去上清液，经过1×PBS缓冲液洗涤3次，除去多余的FITC，最后将菌液在液体培养基(3g大豆蛋白胨、2.5g K

4)FITC荧光强度值与OD

将上步中经过FITC标记处理的幽门螺旋杆菌菌液，按照四次10倍梯度稀释，在激发波长485nm和发射波长530nm条件下，测量其荧光强度值，与此同时在600nm条件下测OD值，建立FITC荧光强度值和OD

5)玉抗粘附肽抑制幽门螺旋杆菌粘附活性试验

将实施例1中制备得到的玉米抗粘附肽TIFPQ使用100％DMEM培养基，配制一定蛋白浓度的玉米抗粘附肽溶液，按照1：1(v/v)的比例与步骤3)中经过FITC标记过的菌液在室温避光条件下进行混合30min，使实施例1所得玉米抗粘附肽的终浓度为4mg/mL，得到混合后的菌液。

向有胃粘膜上皮细胞(GES-1)的96孔板中分别加入100μL混合后的菌液，以加入100μL100％DMEM培养基为阴性对照组，在培养箱中放置90min。然后将溶液去除，用PBS缓冲液清洗3次，随即，将PBS缓冲液按照每孔100μL量加入，在发射波长530nm、激发波长485nm条件下进行荧光强度值的测定，根据实施例1中5.1的步骤3)和4)，计算出阴性对照组和试验组的菌落浓度，采用以下公式计算粘附抑制率：

结果为：当玉米抗粘附肽(TIFPQ)的浓度为4mg/mL时，其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性为20.32％。

采用相同的方法测定玉米抗粘附肽LGQCVEF和TIIPQ抑制幽门螺旋杆菌粘附活性，结果为：当玉米抗粘附肽(LGQCVEF)的浓度为4mg/mL时，其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性为26.06％；当玉米抗粘附肽(TIIPQ)的浓度为4mg/mL时，其抑制幽门螺旋杆菌粘附活性为23.56％。

由以上实施例可以得出，本发明提供的玉米抗粘附肽具备抑制幽门螺旋杆菌粘附的作用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。