一种真菌细菌复合制剂及其在促进花生生长与抗盐性中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及两种丛枝菌根真菌异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02和一种乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成的真菌细菌复合制剂，尤其是一种能显著促进花生生长与抗盐性的真菌细菌复合制剂。

背景技术

中国是世界上盐碱地面积最大的国家之一，受盐碱影响的耕地总面积已达到5亿亩，并且由于不合理轮作和过量使用化肥等原因，盐碱化土壤面积还在逐年增加。土壤盐碱化抑制了作物的正常发育，导致作物减产，严重影响我国农业的可持续发展。

花生富含丰富的油脂和蛋白质，是我国重要的油料作物，也是我国重要的经济作物和出口创汇农作物。在油料作物中，花生总产量居第一位，且出油率远高于其他油料作物，对保障我国粮油安全和改善膳食结构有重要作用。同时，花生属于中等耐盐作物，在一些盐碱化土壤区有较大的种植面积。然而，随着土壤盐碱化的加剧，盐碱化正成为影响花生产量的重要威胁之一。

花生不同生育时期的耐盐性不同，其中出苗期和幼苗期对盐害最为敏感。而花生苗期生长对花生的根系伸展、花芽分化和根瘤固氮都具有重要意义。盐碱化严重影响花生苗期的形态建成，是生产中限制花生产量的主要因素之一。因此，若能采取有效方法促进花生的生长，提高花生苗期的抗盐性，对提高盐碱地花生产量有重要意义。

CN109666608A公开了一株花生根际荧光假单胞菌1502IPR-01，该菌株从花生根际土壤中分离而得，能降低花生的钠含量，增强植株的抗盐胁迫能力。CN106282052A公开了一种改良滨海盐碱土壤的复合乳酸菌菌剂，该菌剂由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)Zhang组成；这两种菌对盐碱土上植物的生长代谢有明显的影响，可以协同提高植物的发芽率、整齐度、均匀度和植株生长能力。然而，上述菌剂在提高花生抗盐性方面的效果不够理想，尤其是在出苗期和幼苗期促进花生幼苗形态建成方面有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的在于通过探究真菌和细菌菌剂对花生生长和抗盐性的影响，确定适宜在花生中应用的微生物制剂，从而提供一种能显著促进花生生长与抗盐性的微生物制剂及其应用。

为了实现本发明的目的，发明人进行了大量的试验研究，最终获得了如下技术方案：一种促进花生生长与抗盐性的真菌细菌复合制剂，该真菌细菌复合制剂分为两部分，部分1由两种丛枝菌根真菌异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B和摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02的培养物的混合物组成，部分2由一种乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8的培养物组成。

需要说明的是，本发明采用的异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B，别名为根内球囊霉(Glomus intraradices)，BGC菌种保藏编号为BGC JX04B，国家自然科技共享平台资源号为1511C0001BGCAM0055。摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)BGCXJ02，别名为摩西球囊霉(Glomus mosseae)，BGC菌种保藏编号为BGC XJ02，国家自然科技共享平台资源号为1511C0001BGCAM0021。本申请采用的两种丛枝菌根真菌异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B和摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae)BGCXJ02，均购自于丛枝菌根真菌种质资源库(BGC)。

本发明所采用的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8，分离自内蒙古传统自然发酵酸牛奶中，具有优异的抗胃肠道消化液耐受能力，能够存活于动物肠道内；该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2012年06月28日，保藏号为CGMCC No.6312。

进一步优选地，如上所述促进花生生长与抗盐性的真菌细菌复合制剂，其中的部分1由异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B的培养物和摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02的培养物按照体积比1：(0.8～1.2)混合而成，混合后孢子数为40～60个/g；部分2的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8的培养物中活菌数不低于5.0×10

进一步优选地，如上所述促进花生生长与抗盐性的真菌细菌复合制剂，其中部分1的培养物按照盆钵培养法而得，部分2的培养物按照倾注培养法而得。

进一步优选地，如上所述促进花生生长与抗盐性的真菌细菌复合制剂，其中部分1是以玉米为寄主，灭菌的河沙和蛭石按3：1混合为基质，分别接种异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02后扩繁，4个月后收获含有孢子、菌丝及侵染根段的河沙和蛭石作为培养物。

本发明人长期从事花生耐盐碱栽培方向研究，研究中发现丛枝菌根真菌异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02和乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8无拮抗作用，而且对花生正常和盐胁迫条件下的生长代谢均有积极影响，可以促进花生生长，并提高抗盐性。基于此发现，本发明人通过扩繁，将两种丛枝菌根真菌制成混合真菌菌剂，并通过培养发酵，将一种乳酸菌制备成了细菌菌剂，最终形成一种真菌细菌复合制剂。因此，本发明提供了上述真菌细菌复合制剂的应用，即：上述的真菌细菌复合制剂在促进花生生长与抗盐性的应用。

本发明涉及的真菌细菌复合制剂可以采用如下方法制备：

(1)将异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02分别以玉米为寄主，灭菌的河沙和蛭石按3：1混合为基质进行扩繁，4个月后收获含有孢子、菌丝及侵染根段的河沙和蛭石，再将两种真菌的培养物按体积比1：(0.8～1.2)混合均匀，作为部分1；

(2)将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8接种在MRS培养液中，在37℃条件下恒温培养12-24小时，离心洗涤后，在沉淀中加入灭菌脱脂牛乳液、葡萄糖和酵母浸膏，调整其菌数大于5.0×10

另外，本发明还提供了一种促进花生生长与抗盐性的花生种植方法，该方法包括施用上述的真菌细菌复合制剂，其中的部分1施于花生播种时，每株施用0.1-0.2g于种子下方1-2cm处，部分2施于花生出苗约2周时，用量为5.0×10

进一步优选地，如上所述促进花生生长与抗盐性的花生种植方法，其在开沟后将所述部分1均匀施于沟内，然后在上方1-2cm处播种。

进一步优选地，如上所述促进花生生长与抗盐性的花生种植方法，其中部分1在花生播种时施用，部分2施于花生出苗约2周时，二者使用间隔在30天以内。

进一步优选地，如上所述促进花生生长与抗盐性的花生种植方法，其中所述复合制剂的两部分均不能与农药同时使用，任一部分与农药使用应间隔3天以上。

与现有技术相比，本发明涉及的真菌细菌复合制剂由两种丛枝菌根真菌异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02以及一种乳酸菌植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成，该真菌细菌复合制剂对花生的生长代谢有显著影响，尤其可以促进花生生长，提高花生抗盐性，施用于花生种植过程中可促进花生幼苗形态建成，对提高盐碱地花生产量有重要意义。

附图说明

图1：各处理下花生幼苗形态和株高比较，图中不同字母代表同组的不同处理之间具有差异显著性(p<0.05)。

图2：各处理下地上部鲜重比较，图中不同字母代表同组的不同处理之间具有差异显著性(p<0.05)。

图3：各处理下地上部干重比较，图中不同字母代表同组的不同处理之间具有差异显著性(p<0.05)。

图4：各处理下根部鲜重比较，图中不同字母代表同组的不同处理之间具有差异显著性(p<0.05)。

图5：各处理下根部干重比较，图中不同字母代表同组的不同处理之间具有差异显著性(p<0.05)。

图6：各处理下花生功能叶片叶绿素荧光比较，图中不同字母代表同组的不同处理之间具有差异显著性(p<0.05)。

具体实施方式

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。另外，下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

以下实施例中，所述的真菌细菌复合制剂采用如下方法制备：

(1)制剂部分1的丛枝菌根真菌制备采用常规的盆钵培养法，将所述的两种丛枝菌根真菌异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B和摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02以玉米为寄主，灭菌的河沙和蛭石3：1混合为基质，分别进行扩繁，4个月后，收获含有孢子、菌丝及侵染根段的河沙和蛭石。再将两种真菌的收获物按体积比1：1混合均匀作为制剂部分1，孢子数约为50spores/g。

(2)制剂部分2的乳酸菌制备采用常规的倾注培养法，将所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8接种在MRS培养液中，进行恒温培养，离心洗涤后，在沉淀中加入灭菌脱脂牛乳液、葡萄糖和酵母浸膏，调整其菌数大于5.0×10

实施例1：真菌菌剂在花生种植中的试验

实验类型：盆栽试验

实验地点：青岛农业大学(青岛，中国)

实验时间：2022.07-2022.11

实验作物：花生(品种为宇花33号)

实验土壤：灭菌土壤(土壤pH为6.74，容重1.21g/cm

实验组别：Control为空白对照处理，AMF为真菌菌剂(制剂部分1)处理，NaCl为盐处理，AMF+NaCl为真菌菌剂(制剂部分1)加盐处理。盐处理在花生植株生长第28天开始浇灌200mM NaCl溶液，每隔两天一次，重复3次，土壤平均含盐量为2.27g/kg。

实验设计：将大小均一的种子浸入2％(v/v)次氯酸钠中消毒10min，并在蒸馏水中彻底冲洗，在25℃避光条件下于蒸馏水中浸泡24h，再转移到铺垫湿滤纸的培养皿中25℃避光萌发24h。最后将种子种在装有灭菌土壤的花盆中(播种于土壤表面以下2cm处)。

使用量及方法：AMF和AMF+NaCl处理在播种前施用真菌菌剂(制剂部分1)，每株施用0.2g于种子下方1cm处。

表1真菌菌剂对花生幼苗生长指标的影响

注：Control为空白对照，AMF为真菌菌剂(制剂部分1)处理，NaCl为盐处理，AMF+NaCl为真菌菌剂+盐处理。同列不同小写字母分别表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。

由表1的试验结果可得，由异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B和摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02组成的真菌菌剂(制剂部分1)可促进花生幼苗的生长。在正常生长条件下，真菌菌剂使花生株高、地上部鲜重、根部鲜重、地上部干重和根部干重显著提高了18.29％、26.15％、40.06％、48.47％和42.98％。在盐胁迫条件下，真菌菌剂使花生株高、地上部鲜重、根部鲜重、地上部干重和根部干重显著提高了25.14％、69.02％、80.90％、40.01％和58.97％。结果表明，真菌菌剂对于花生幼苗的生长指标均有显著影响，可促进幼苗形态建成和植株生长，并提高花生抗盐性。

实施例2：细菌菌剂在花生种植中的试验

实验类型：盆栽试验

实验地点：青岛农业大学(青岛，中国)

实验时间：2022.07-2022.11

实验作物：花生(品种为宇花33号)

实验土壤：灭菌土壤(土壤pH为6.74，容重1.21g/cm

实验组别：Control为空白对照处理，LP为细菌菌剂(制剂部分2)处理，NaCl为盐处理，LP+NaCl为细菌菌剂(制剂部分2)加盐处理。盐处理在花生植株生长第28天开始浇灌200mM NaCl溶液，每隔两天一次，重复3次，土壤平均含盐量为2.27g/kg。

实验设计：将大小均一的种子浸入2％(v/v)次氯酸钠中消毒10min，并在蒸馏水中彻底冲洗，在25℃避光条件下于蒸馏水中浸泡24h，再转移到铺垫湿滤纸的培养皿中25℃避光萌发24h。最后将种子种在装有灭菌土壤的花盆中(播种于土壤表面以下2cm处)。

使用量及方法：LP和LP+NaCl处理在播种后21天施用细菌菌剂(制剂部分2)，兑水稀释后浇灌于花生根部，用量为5.0×10

表2细菌菌剂对花生幼苗生长指标的影响

注：Control为空白对照，LP为细菌菌剂(制剂部分2)，NaCl为盐处理，LP+NaCl为细菌菌剂+盐处理。同列不同小写字母分别表示处理间差异显著(P<0.05)，下同。

由表2的试验结果可得，由植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成的细菌菌剂(制剂部分2)对花生幼苗地上部的生长有积极影响，可显著提高株高和地上部干鲜重，对根部生物量无显著影响。在正常生长条件下，细菌菌剂使花生株高、地上部鲜重和地上部干重显著提高了16.16％、22.31％和33.21％。在盐胁迫条件下，细菌菌剂使花生株高、地上部鲜重和地上部干重显著提高了23.18％、49.63％和63.68％。结果表明，细菌菌剂对于花生幼苗的地上部生长有显著影响，可促进花生幼苗生长，并提高花生幼苗抗盐性。

实施例3：真菌细菌复合制剂在花生种植中的试验

实验类型：盆栽试验

实验地点：青岛农业大学(青岛，中国)

实验时间：2022.07-2022.11

实验作物：花生(品种为宇花33号)

实验土壤：灭菌土壤(土壤pH为6.74，容重1.21g/cm

实验组别：Control为空白对照处理，AMF为真菌菌剂(制剂部分1)处理，LP为细菌菌剂(制剂部分2)处理，CMA为真菌细菌复合制剂(制剂部分1+2)处理。non-NaCl组为正常生长条件。NaCl组在前28天正常生长，第28天开始浇灌200mM NaCl溶液，每隔两天一次，重复3次，土壤平均含盐量为2.27g/kg。

实验设计：将大小均一的种子浸入2％(v/v)次氯酸钠中消毒10min，并在蒸馏水中彻底冲洗，在25℃避光条件下于蒸馏水中浸泡24h，再转移到铺垫湿滤纸的培养皿中25℃避光萌发24h。最后将种子种在装有灭菌土壤的花盆中(播种于土壤表面以下2cm处)。

使用量及方法：LP处理在播种后21天施用细菌菌剂(制剂部分2)，兑水稀释后浇灌于花生根部，用量为5.0×10

通过图1的试验结果比较发现，异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成的真菌细菌复合制剂相对于空白对照、LP处理植物乳杆菌P-8和AMF处理异形根孢囊BGCJX04B+摩西斗管囊霉BGCXJ02均可以促进花生幼苗形态建成，并显著提高花生株高。特别是在盐胁迫下，CMA处理相对于AMF、LP、Control处理株高分别显著提高了13.62％、15.42％和42.18％。

通过图2的试验结果比较发现，异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成的真菌细菌复合制剂相对于空白对照、LP处理植物乳杆菌P-8和AMF处理异形根孢囊BGCJX04B+摩西斗管囊霉BGCXJ02均可以显著提高花生幼苗地上部生物量，正常条件下相对于AMF、LP、Control处理分别提高了25.21％、29.13％和57.94％，盐胁迫条件下分别提高了12.56％、27.15％和90.25％。

通过图3的试验结果比较发现，异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成的真菌细菌复合制剂相对于空白对照、LP处理植物乳杆菌P-8和AMF处理异形根孢囊BGCJX04B+摩西斗管囊霉BGCXJ02均可以显著提高花生幼苗的干物质积累，正常条件下相对于AMF、LP、Control处理分别提高了25.24％、39.60％和85.96％，盐胁迫条件下分别提高了10.18％、21.77％和99.31％。

通过图4的试验结果比较发现，异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成的真菌细菌复合制剂相对于空白对照、LP处理植物乳杆菌P-8和AMF处理异形根孢囊BGCJX04B+摩西斗管囊霉BGCXJ02均可以显著提高花生幼苗根部的生物量，正常条件下相对于AMF、LP、Control处理分别提高了7.45％、27.44％和50.49％，盐胁迫条件下分别提高了16.40％、31.60％和62.97％。

通过图5的试验结果比较发现，异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成的真菌细菌复合制剂相对于AMF处理异形根孢囊BGCJX04B+摩西斗管囊霉BGCXJ02、LP处理植物乳杆菌P-8和空白对照均可显著提高盐胁迫下花生幼苗根部干重，分别显著提高了22.58％、36.94％和94.87％。在正常条件下相对于LP、Control处理也显著提高了33.32％和57.89％。

通过图6的试验结果比较发现，异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)BGCJX04B、摩西斗管囊霉(Funneliformis mosseae)BGCXJ02和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)P-8组成的真菌细菌复合制剂相对于空白对照、LP处理植物乳杆菌P-8和AMF处理异形根孢囊BGCJX04B+摩西斗管囊霉BGCXJ02均可以显著提高盐胁迫下花生叶片最大光化学效率(Fv/Fm)，缓解盐胁迫对花生叶片光合系统的损伤。在盐胁迫条件下，CMA处理相对于AMF、LP、Control处理最大光化学效率分别显著提高了3.01％、4.28％和10.01％。

总之，通过统计学比较，在花生幼苗生长指标的多个方面，真菌细菌复合制剂相比真菌菌剂(部分1)和细菌菌剂(部分2)均有显著性差异，这说明异形根孢囊霉BGCJX04B、摩西斗管囊霉BGCXJ02和植物乳杆菌P-8可协同促进花生生长，并提高花生抗盐性。