一种检测曲霉的引物探针组合、试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，尤其涉及一种检测曲霉的引物探针组合、试剂盒。

背景技术

曲霉是引起感染病最多的霉菌菌种，有250多种广布自然界，其中有40多种为致病菌。曲霉可寄生于正常人的皮肤和上呼吸道，为条件致病菌。一般正常人对曲霉菌有一定的抵抗力，不引起疾病。曲霉菌病大多为继发性，当机体抵抗力降低时，病原菌可经皮肤黏膜损伤处或吸入呼吸道，进而进入血液循环到其他组织或器官而致病。免疫抑制、恶性肿瘤、器官移植(常见于肺移植)患者为曲霉感染的主要患者人群。曲霉的主要感染部位为肺部，肺部感染分三大类：过敏性支气管感染、慢性感染、侵袭性感染。主要感染肺部的曲霉菌有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉等。烟曲霉病占所有曲霉病的90％以上。

线粒体是真核生物细胞内一个重要的细胞器，因为有氧呼吸在线粒体内进行，线粒体又被称为真核细胞的能量供应站。作为半自主细胞器，线粒体内拥有一定量的独立于细胞核的遗传体系，称为线粒体基因。

因为真菌培养比较困难且生长缓慢，目前检测曲霉感染的主要方法为GM检测，其缺点是受某些食物或药物的影响可致假阳性结果。目前也有利用qPCR技术检测曲霉的报道，但是其检测靶标为烟曲霉一个菌种或烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉三个菌种的基因组DNA(18S RNA、ITS区或28S RNA)，目前还没有利选用线体基因作为检测靶标用于检测曲霉的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种检测曲霉的引物探针组合、试剂盒。该引物探针组合可快速实现烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的三种常见曲霉的联合检测，灵敏度高、特异性好、重复性高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种检测曲霉的引物探针组合，包括：

检测烟曲霉的引物、探针：SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针；

检测黑曲霉的引物、探针：SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针；和/或

检测黄曲霉的引物、探针：SEQ ID NO:7～8所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针。

本发明针对烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的线粒体基因的特异性保守区序列设计引物和探针，其中，烟曲霉线粒体基因的特异性保守区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；黑曲霉线粒体基因的特异性保守区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；黄曲霉线粒体基因的特异性保守区域的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。其中：

SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；

SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；

SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团MGB。

本发明还提供了所述的引物探针组合在制备检测曲霉的试剂盒中的应用；所述曲霉包括烟曲霉、黄曲霉或黑曲霉中的至少一种。

本发明还提供一种检测曲霉的试剂盒，包括所述的引物探针组合。

本发明提供的试剂盒还包括针对SEQ ID NO.16所示的保守区域设计得到的用于检测内参基因的引物和探针：核苷酸序列如SEQ ID NO.10～11所示的引物以及核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的探针。

其中，SEQ ID NO:12所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。

本发明提供的试剂盒还包括无菌水和ddPCRMix。

本发明还提供一种检测曲霉的方法，以本发明所述的引物探针或试剂盒对待测样本进行检测。

本发明中，所述检测为PCR检测，检测的程序为：95℃5min，[98℃15s，60℃30s]×40cycles。

本发明中，所述待测样本包括人痰液样本、肺泡灌洗液样本、血液样本和胸腹水样本。一些实施方案中，本发明所述检测为非诊断目的的检测，例如对环境的样本或对食品进行检测，其中，所述环境中的样本包括水样或物体表面拭子。

本发明针对烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉的线粒体基因的特定区域设计引物和探针，可快速实现烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的三种常见曲霉的联合检测，对已检测的22种菌均无交叉，具有灵敏度高、特异性好、重复性高的特点。

具体实施方式

本发明提供了一种检测曲霉的引物探针组合、试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

如无特殊说明，本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1.1引物探针设计

1.1.1依据曲霉(涵盖烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉)线粒体基因序列分析结果，采用Primer Express软件，分别各设计一对引物和一条探针；同时搭配一组外源内参的引物探针，具体信息如下：

表1

/>

1.1.2样品

1.1.2.1菌DNA样品：外购灭活菌，磁珠法提取基因组DNA。

1.1.2.2人DNA样品：无菌痰液/肺泡灌洗液，磁珠法提取基因组DNA。

1.1.2.3外源内参模板：生物公司合成，溶解稀释后备用。

1.2数字PCR扩增体系

1.2.1 25XBc引物探针混合液

表2

1.2.2 ddPCR反应体系

表3

1.2.3扩增程序

98℃5min【98℃15s，60℃30s】*40

表4

/>

1.4结论

对以上多种病原菌，本发明试剂盒只检测出烟曲霉、黑曲霉和黄曲霉，不会检出其他的病原菌。说明，本发明引物探针特异性高，能准确地、特异地将两三种曲霉检测出来。

实施例2

以烟曲霉18sRNA的基因为靶标设计引物探针，其序列如下：

表5

引物探针扩增效率检测：

表6

采用本发明的引物探针以及表5的引物探针，分别以最优引物探针浓度，以以上3种人工合成DNA模板的浓度进行qPCR检测，结果浓度每降低10倍，Ct值就增加约3。因为2的3.3次方约等于10，说明在该体系中，引物探针的扩增效率均接近100％。

实施例3

分别使用以上的引物探针体系(18sRNA和A.FUM-MIT)，测4例烟曲霉阳性的痰液样本。通过我们公司开发的痰液DNA提取试剂TF1提取以后，每个体系分别加样5μl为模板。其检测值如下：

表7

在真实的阳性样本检测中，以烟曲霉线粒体基因为检测靶标的检测浓度是以18sRNA为检测靶标的检测浓度的390倍左右，对阳性样本的检出率更高，而以18sRNA为检测靶标的检测浓度较低，容易出现假阴性的结果。

实施例4空白检出限(LoB)值

每天提取20份去离子水，作为模板，在不同扩增仪上分别使用以上的引物探针体系(18sRNA和A.FUM-MIT)连续做三天。除所有检测值均为0的以外，使用spss23.0软件S-W分析检测结果是否服从正态分布，若服从正态分布则用参数法分析LoB值；若不服从正态分布则用非参数法分析LoB值。结果如下：

表8

线粒体基因为检测靶标的取3次计算结果的最大值为LoB值，即烟曲霉为0.09copies/μl，黄曲霉和黑曲霉均为0copies/μl；18sRNA为检测靶标的取3次计算结果的最大值为LoB值，即烟曲霉为0.29copies/μl、黄曲霉为0.19copies/μl、黑曲霉为21copies/μl。线粒体基因为检测靶标的引物探针体系的特异性明显高于18sRNA为检测靶标的引物探针体系。

实施例5空白检出限(LoD)值

1.1最低检出限(LoD)

若LoB＝0，则采用概率单位方案；若LoB≠0，则采用经典方案。配制3批试剂中最大的LOD作为最终报告值。

1.1.1概率单位方案

使用超纯水作为基质，分别掺入不同靶菌已知浓度的DNA，作为阳性标本。再使用超纯水，分别进行梯度稀释。

使用同一套仪器，包括液滴生成仪、PCR扩增仪、芯片阅读仪，使用3个批号试剂，分别重复检测各个靶菌标本不同浓度梯度30次。

分别计算各个靶菌标本每个浓度梯度的阳性检出率，选择阳性检出率≥95％的最低浓度，作为各个靶菌的LoD值。

1.1.2经典方案

使用超纯水作为基质，分别掺入不同靶菌已知浓度的DNA，作为阳性标本。再使用相应的超纯水，分别稀释至1×LoB、2×LoB、3×LoB、4×LoB、5×LoB五个浓度，作为低值标本。

使用同一套仪器，包括液滴生成仪、PCR扩增仪、芯片阅读仪，使用3个批号试剂，分别重复检测各个靶菌五个低值标本至少12次，合计至少60个低值标本测量结果。

分别计算各个靶菌LoD值，方法为：

1)分析每个批号试剂至少60个低值标本测量结果的数据分布。

2)若数据呈正态分布，则采用参数统计方法进行分析。

3)若数据呈偏态分布，则采用非参数统计方法进行分析。

结果如下表，检测限为LoD值。

表9

结果显示，本发明以线粒体基因为检测靶标的引物探针体系的灵敏度明显高于18sRNA为检测靶标的引物探针体系。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。