一种用于抗病毒的磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用于抗病毒的磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸及其应用。

背景技术

流感病毒每年都会导致全球性流行病，季节性流感每年最多可造成65万人死亡。目前可用于治疗流感的药物较少，主要有神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦、帕拉米韦等；离子通道M2阻滞剂如金刚烷胺等；RNA依赖的RNA聚合酶抑制剂如法匹拉韦。此外，以上小分子化药耐药性问题日益严重，开发新型抗流感病毒药物具有重要应用价值。

寡核苷酸疗法被认为是继小分子药物和蛋白药物后新一代有效的药物发现技术平台。PMO指磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸，PMO结构中用吗啉环替代核酸结构中五元糖环，并用电中性的二甲基磷酰胺替代带负电荷的磷酸酯基团。具有核酸酶稳定性好、水溶性强、毒性低等优点。特别是使用生理条件下带正电荷的哌嗪基团替换PMOs主链中结构中部分二甲胺基，得到的带正电荷的哌嗪基修饰PMO(PMOplus)，能够有效促进目标序列进入细胞。美国Sarepta Therapeutics基于该技术，已有3款治疗杜氏肌营养不良症的药物批准上市，表现出良好的有效性和安全性。特定PMO反义序列可通过碱基互补配对原则特异性结合RNA上对应核酸片段，通过空间位阻作用阻断蛋白质合成，产生相应生物学效应。这一作用特点使PMO技术特别适合于在抗病毒治疗领域，已有多种基于PMO技术开的的抗病毒药物开展临床前或临床研究，如治疗埃博拉病毒感染的AVI-7537，治疗马尔堡病毒感染的AVI-7288和治疗流感的AVI-7100等。以上药物主要通过阻断病毒特定蛋白mRNA含AUG启动密码子区域，阻断蛋白质翻译过程而发挥抗病毒作用。有研究报道了一种直接基于流感病毒节段5病毒基因组序列设计反义序列的方法。通过研究流感病毒节段5基因组二级结构，针对未与核蛋白结合区域RNA二级结构，设计相应的反义序列。其中针对878–888区域的2’-甲氧基修饰反义寡核苷酸和2’-甲氧基修饰反义锁核苷表现出最佳抗病毒活性，表明该区域是潜在的反义寡核苷酸药物设计靶点。然而论文中所设计反义寡核苷酸序列较短，仅包含11个碱基，且采用的2’-甲氧基修饰反义寡核苷酸和2’-甲氧基修饰反义锁核苷，需借助转染试剂促进细胞吸收。以上问题限制了其作为抗流感病毒药物进行进一步研究。

发明内容

本发明解决的是小分子化药耐药性问题严重，而目前已有的寡核苷酸疗法中反义寡核苷酸序列存在细胞吸收较难的问题，因此提供一种用于抗病毒的磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸及其应用，该磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸可以与流感病毒第5节段病毒RNA中特定区域结合，通过空间位阻作用阻断病毒RNA转录，发挥抗病毒作用，并使用核酸酶稳定性好、反义效率高、水溶性好的PMO结构，同时通过引入生理条件下带正电荷的哌嗪基团，有利于PMO化合物跨膜进入细胞，能有效增强化合物生物活性。

为了解决上述问题，本发明提供一种用于抗病毒的磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸，所述磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸包含如SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反义寡核苷酸为磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸中的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的结构式如下式1所示：

其中，Base为碱基；R为N,N-二甲胺基或哌嗪基。

优选地，所述反义寡核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述反义寡核苷酸的5’-末端为-OH，且5’-末端的-OH与下式2-式6中任一结构连接：

优选地，所述反义寡核苷酸中，所有的碱基为C的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R均为N,N-二甲胺基；所有的碱基为G的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R均为N,N-二甲胺基；碱基为T的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R相同或不同的选自N,N-二甲胺基与哌嗪基；碱基为A的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R相同或不同的选自N,N-二甲胺基与哌嗪基。

优选地，所述反义寡核苷酸中，哌嗪基的数量为1-9个。

优选地，所述反义寡核苷酸的结构式如下式7所示：

本发明的第二方面提供一种用于抗病毒的药物组合物，所述药物组合物包括上述的反义寡核苷酸和药学上可接受的载体。

本发明的第三方面提供上述的反义寡核苷酸在制备抗病毒的药物中的应用。

优选地，所述病毒为流感病毒，所述流感病毒为H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H7N9和H9N2中的至少一种。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明的用于抗病毒的磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸，可以与流感病毒第5节段病毒RNA中特定区域结合，通过空间位阻作用阻断病毒RNA转录，发挥抗病毒作用；并且使用核酸酶稳定性好、反义效率高、水溶性好的PMO结构，同时通过引入生理条件下带正电荷的哌嗪基团，有利于PMO化合物跨膜进入细胞，能有效增强化合物生物活性。

附图说明

图1是本发明实施例中PMO-1的质谱图；

图2是本发明实施例中PMO-2的质谱图；

图3是本发明实施例1中PMO-1及PMO-2细胞毒性实验结果图；

图4是本发明实施例2中PMO-1及PMO-2抗流感病毒活性实验结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例的第一方面提供一种用于抗病毒的磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸，所述磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸包含如SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述反义寡核苷酸为磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸中的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的结构式如下式1所示：

其中，Base为碱基；R为N,N-二甲胺基或哌嗪基。

所述SEQ ID NO.1的序列结构为：

5’-TGGAAGAAGAACAAGGAGTTGC-3’。

本发明实施例的用于抗病毒的磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸，区别于常用的针对病毒mRNA翻译起始密码子AUG区域的反义寡核苷酸等设计方法，基于病毒RNA二级结构，选取流感病毒节段5病毒基因组中不与核蛋白结合的区域为靶点，设计反义序列，该系列磷酰胺吗啉代寡核苷酸可以与流感病毒第5节段病毒RNA中特定区域结合，通过空间位阻作用阻断病毒RNA转录，发挥抗病毒作用。同时，该磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸使用核酸酶稳定性好、反义效率高、水溶性好的PMO结构，同时通过引入生理条件下带正电荷的哌嗪基团，有利于PMO化合物跨膜进入细胞，能有效增强化合物生物活性。

其中，碱基中，A代表腺嘌呤，结构式为

在一些实施例中，所述反义寡核苷酸的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

在一些实施例中，所述反义寡核苷酸的5’-末端为-OH，且5’-末端的-OH与下式2-式6中任一结构连接：

反义寡核苷酸的5’-末端的-OH与上述结构连接后，可以起到增加水溶性的作用。

在一些实施例中，所述反义寡核苷酸中，所有的碱基为C的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R均为N,N-二甲胺基；所有的碱基为G的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R均为N,N-二甲胺基；碱基为T的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R相同或不同的选自N,N-二甲胺基与哌嗪基；碱基为A的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R相同或不同的选自N,N-二甲胺基与哌嗪基。即碱基为C、G的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R均为N,N-二甲胺基，碱基为T、A的磷酰胺吗啉代核苷酸单体的R可以为N,N-二甲胺基，也可以为哌嗪基。由于哌嗪基碱基单体的制备成本较高，为降低制备成本，采用易于制备且偶联效率高的碱基A与碱基T引入哌嗪基。

在一些实施例中，所述反义寡核苷酸中，哌嗪基的数量为1-9个；优选地，哌嗪基的数量为3-6个；进一步优选地，哌嗪基的数量为5个。每个哌嗪基的引入会使寡核苷酸分子带相应的正电荷，合适的正电荷数量有利于分子进入细胞，经实验研究发现，含哌嗪基碱基数量为碱基总数20％-30％时，有较好的跨膜效果，因此，哌嗪基的数量采用上述范围内的数值时，可更好的增强化合物生物活性。

在一些实施例中，所述反义寡核苷酸的结构式如下式7所示：

本发明的第二方面提供一种用于抗病毒的药物组合物，所述药物组合物包括上述的反义寡核苷酸和药学上可接受的载体。

本发明的第三方面提供上述的反义寡核苷酸在制备抗病毒的药物中的应用。

在一些实施例中，所述病毒为流感病毒，所述流感病毒为H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H7N9和H9N2中的至少一种。

实施例

磷酰胺吗啉代反义寡核苷酸的制备：

PMO-1的结构式如下式8所示：

PMO-2的结构式如下式7所示：

PMO-2的制备方法为：

称取树脂修饰分子修饰的氨甲基聚苯乙烯固相合成树脂0.050g(载量0.6mmol/g)，在固相合成管中加入NMP 2.0mL，室温下溶胀2.0h后排空溶液，二氯甲烷2.0mL洗涤树脂3次，按下表流程及条件进行固相合成过程，将吗啉代核苷单体分子按照序列碱基顺序(5’-TGGA

PMO-1的制备方法与PMO-2相同，仅常规替换其中部分核苷酸，此处不做赘述。制备产物质谱数据为：HRMS(ESI)m/z[M+H]

实施例1：PMO-1及PMO-2细胞毒性实验

将MDCK细胞以约2×10

实施例2：PMO-1及PMO-2抗病毒活性实验

将MDCK细胞以约2×10

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。