用以检测丁硫克百威的碳基纳米酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农药丁硫克百威的检测，特别涉及用以检测丁硫克百威的碳基纳米酶及其制备方法和应用。

背景技术

丁硫克百威是近年来常用的低毒杀虫剂，所属氨基甲酸酯类农药，具有高效广谱的杀虫及杀线虫活性，被广泛应用于水稻上昆虫的控制，其作用机理是通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性来影响昆虫正常的神经传导。丁硫克百威在土壤和植物中易于降解，其代谢物的毒性远高于母体；丁硫克百威的主要代谢产物为克百威，克百威与胆碱酯酶抑制的结合不可逆决定了其对人类及动物体的毒性极高。同时，其代谢产物克百威水溶性好，渗透能力强，对环境污染比较严重。由于高浓度的丁硫克百威具有健康风险，因此在对丁硫克百威进行定量检测是至关重要的。

目前，丁硫克百威的检测主要可以分为两大类：一种是基于传统仪器分析方法，主要包括高效液相色谱法、分光光度法、气相色谱法和酶联免疫测定方法。这些分析方法是灵敏的和高规格的，为农药残留提供了有效的技术支撑，然而，它们涉及复杂的样品制备，耗时和昂贵，并且需要复杂的仪器，这限制了它们进一步应用于实现低成本快速检测农药残留样品。第二类是基于酶抑制法。乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种天然酶，促进神经递质乙酰胆碱水解形成胆碱和醋酸盐。某些农药会影响乙酰胆碱酯酶的活性，它已被探索为一种检测农药的简单方法。酶抑制法简单易操作、成本低，是一种相对成熟的农药残留速测技术。该方法通常用来检测一类农药，由于受外界因素影响较大，并且不能给出农药化合物的确切名称和定量结果，对于特异性检测丁硫克百威存在一定难度。

纳米酶模拟了天然酶的催化活性。作为模拟酶在化学、生物医学和生物传感领域受到越来越多的关注，因为与传统酶相比，它们克服了天然酶的主要缺点，纳米酶具有更高的环境稳定性和较低的生产、纯化和存储成本。纳米酶已被广泛探索，用于开发新技术，包括免疫分析、生物传感、小分子检测(病原体、农药等)、诊断、影像学、治疗、微生物管理和污染物去除。但是截至到目前为止，还没有发现比较有效的纳米酶可以直接用于丁硫克百威的特异性检测，因此，寻找一种具有模拟氧化酶活性的纳米酶，实现对丁硫克百威的特异性检测，具有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术缺乏对丁硫克百威进行特异性检测的技术问题，本发明提供了一种用以检测丁硫克百威的碳基纳米酶。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:

用以检测丁硫克百威的碳基纳米酶，所述碳基纳米酶为基于金属掺杂的碳基纳米酶Ce-N-C或非金属掺杂的碳基纳米酶N-C，所述纳米酶Ce-N-C及N-C均具有模拟氧化酶活性；农药丁硫克百威通过影响纳米酶Ce-N-C或纳米酶N-C的活性从而实现对丁硫克百威的特异性检测。

进一步的，农药丁硫克百威在酸性条件下降低所述纳米酶Ce-N-C或纳米酶N-C的模拟酶活性，使所述纳米酶Ce-N-C或纳米酶N-C催化显色底物TMB生成的oxTMB量发生变化，oxTMB呈蓝色，通过上清液颜色变化定性检测所述丁硫克百威，所述oxTMB在特定波长处有紫外吸收峰，并通过相应的吸光度值来定量检测所述丁硫克百威。

具体的，取0～50μmol/L范围内不同浓度的丁硫克百威、15μg/mL纳米酶Ce-N-C或纳米酶N-C、0.5mmol/L的TMB、以及200mmol/L、pH为4.0的NaAc-HAc缓冲溶液，在37℃下反应15～30min，得上清液；观察上清液颜色变化来实现定性检测农药丁硫克百威，并测定上清液中oxTMB在500～800nm波长范围内的吸光度值，通过相应的吸光度值定量检测农药丁硫克百威。

本发明提供的所述纳米酶Ce-N-C和纳米酶N-C均作为仿氧化酶催化剂，用于特异性检测丁硫克百威。

所述纳米酶Ce-N-C和纳米酶N-C具有模拟氧化酶活性，所述纳米酶Ce-N-C或纳米酶N-C可催化显色底物TMB生成的氧化态的TMB即oxTMB，丁硫克百威在酸性条件下不稳定会分解出带巯基(-SH)的物质，-SH可降低两种纳米酶的模拟氧化酶活性，使得到的oxTMB的量变少，oxTMB显蓝色，可通过上清液颜色变化来定性检测丁硫克百威，氧化态的TMB(oxTMB)在特定波长处有紫外吸收峰，并通过相应的吸光度值来定量检测农药丁硫克百威。

本发明提供的Ce-N-C和N-C纳米酶具有模拟氧化酶的特点，将其应用于农药丁硫克百威的检测，该方法与传统的检测丁硫克百威的方法相比，成功实现了其特异性检测。

另外，本发明还提供了上述两种碳基纳米酶的制备方法，所述纳米酶Ce-N-C是以葡萄糖和双氰胺作为前驱体，加入Ce(SO

进一步的，所述纳米酶Ce-N-C的制备方法包括如下步骤：

a)取1.0～5.0g葡萄糖(Glucose)，5.0～10.0g双氰胺(DICY)于容器中，然后加入1～5mmol L

b)将所述白色粉末置于管式炉中，在N

更进一步的，在步骤b)中的冷却降温过程中，继续通入N

进一步的，所述纳米酶N-C的制备方法包括如下步骤：

a′)、取1.0～5.0g三聚氰胺，1.0～5.0g三聚氰酸加入至30～50mL水中，将混合溶液在室温下搅拌8～12h，将产物离心、干燥后，得到白色粉末；

b′)、将所述白色粉末置于管式炉中，在N

c′)、取1.0～5.0g葡萄糖和所述的淡黄色粉末于容器中，加入30～50mL水，超声均匀，在室温下搅拌8～12h，将产物离心、真空干燥后，得到白色粉末；

d′)、将步骤c′)得到的所述白色粉末置于管式炉中，在N

更进一步的，在步骤b′)和d′)所述的冷却降温过程中，继续通入N

本发明提供了一种基于金属掺杂碳基纳米酶Ce-N-C和非金属掺杂的N-C纳米酶用于特异性检测丁硫克百威的应用，实现丁硫克百威的特异性检测，与现有的丁硫克百威检测方法相比，具有以下有益效果：

本发明提供的Ce-N-C和N-C纳米酶用以检测丁硫克百威，此方法避免使用了气相色谱法、液相色谱法等昂贵的设备，且不需要受过训练的专业人员，以及复杂的样品制备和纯化步骤，实现了低成本快速检测丁硫克百威。

其次，Ce-N-C和N-C纳米酶的制备过程简单，耗费较低，稳定性好，反应条件温和，不受环境因素的干扰。与现有的纳米酶合成方法相比，本发明选择了生产成本低、同时也含还有丰富官能团的无机材料作为前驱体，制备了具有模拟氧化酶活性的Ce-N-C和N-C纳米酶。

更为重要的一点是，传统的乙酰胆碱酯酶抑制法，通常只能检测一类农药，基于农药化学结构的特异性检测仍然是一个挑战。本发明所使用的Ce-N-C和N-C纳米酶可以特异性的识别丁硫克百威，实现丁硫克百威的便捷准确检测，另外，本发明提供的Ce-N-C和N-C纳米酶检测丁硫克百威，在整个检测过程中无需复杂的处理程序，样品使用量少，反应条件温和、检测速度快，测试结果可以直接由紫外-分光光度计显示，能够实现现场实时监测，有利于快速准确分析农药丁硫克百威。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的Ce-N-C纳米酶的TEM成像图；

图2为本发明实施例2提供的N-C纳米酶的TEM成像图；

图3为本发明实施例3提供的各个体系的紫外吸收谱图；

图4为本发明实施例4提供的各个体系的紫外吸收谱图；

图5为本发明实施例5提供的Ce-N-C纳米酶检测丁硫克百威的标准工作曲线；

图6为本发明实施例6提供的N-C纳米酶检测丁硫克百威的标准工作曲线；

图7为本发明实施例7提供的不同农药抑制Ce-N-C纳米酶活性的抑制率示意图；

图8为本发明实施例7提供的不同农药抑制N-C纳米酶活性的抑制率示意图。

具体实施方式

本发明公开了用以检测丁硫克百威的碳基纳米酶及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了使本领域技术人员能够更好的理解本发明，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。

实施例1纳米酶Ce-N-C纳米酶的合成

a)取1.0g葡萄糖(Glucose)，5.0g双氰胺(DICY)于100mL烧杯中，然后加入3.5mmolL

b)将步骤a)中所制得的白色粉末置于干净的瓷舟中，将瓷舟置于管式炉中，在N

实施例2纳米酶N-C的合成

a‵)取2.5g三聚氰胺，2.5g三聚氰酸溶于40mL水中，将混合溶液在室温下搅拌12h，将产物离心、干燥后，得到白色粉末。

b‵)将步骤a‵)中所制得的白色粉末置于干净的瓷舟中，将瓷舟置于管式炉中，在N

c‵)取1.0g葡萄糖(Glucose)和步骤b‵)中得到的C

d‵)将上述步骤c‵)中得到的白色粉末置于干净的瓷舟中，将瓷舟置于管式炉中，在N

将本实施例将得到的N-C纳米酶通过透射电子显微镜进行观察，结果见图2，通过图2的N-C纳米酶的TEM成像图看出，本实施例制备得到的N-C纳米酶具有无定形的结构特征。

实施例3纳米酶Ce-N-C具有模拟氧化酶活性的验证

实验体系a：催化反应体系为15μg/mL的实施例1制备的Ce-N-C纳米酶、0.5mmol/L的TMB、200mmol/L、pH为4.0的NaAc-HAc缓冲溶液，在37℃下反应15min，离心，取上清液，用紫外-可见分光光度计检测其在500～800nm内的吸光度值；

对照试验b：此催化反应体系不加Ce-N-C纳米酶，与实验体系a相同条件下反应15min后检测吸光度值；

对照试验c：此催化反应体系不加显色物质TMB，在与上述实验体系相同条件下静置15min后检测吸光度值。

如图3所示，实验体系a显示在652nm处出现明显的紫外吸收峰，表明Ce-N-C纳米酶在pH＝4.0下可以催化显色底物TMB，生成的产物为oxTMB，oxTMB呈蓝色，在652nm处可以观察到明显的紫外吸收峰，说明Ce-N-C纳米酶具有明显的模拟氧化酶活性。对照试验b在652nm附近没有明显的吸收峰，说明，若无Ce-N-C纳米酶作催化剂，TMB无法自行氧化；对照试验c在652nm附近无明显的吸收峰，说明实验体系a的峰不是Ce-N-C纳米酶自身的响应峰。

实施例4纳米酶N-C具有模拟氧化酶活性的验证

实验体系d：催化反应体系为15μg/mL实施例2制备得到的纳米酶N-C、0.5mmol/L的TMB、200mmol/L、pH为4.0的NaAc-HAc缓冲溶液，在37℃下反应15min，离心，取上清液，用紫外-可见分光光度计检测其在500～800nm内的吸光度值；

对照试验e：此催化反应体系不加N-C纳米酶，与实验体系d相同条件下反应15min后检测吸光度值；

对照试验f：此催化反应体系不加显色物质TMB，在与上述实验体系相同条件下静置15min后检测吸光度值。

如图4所示，实验体系d显示在652nm处出现明显的紫外吸收峰，表明N-C纳米酶在pH＝4.0下可以催化显色底物TMB，生成的产物为oxTMB，oxTMB呈蓝色，在652nm处可以观察到明显的紫外吸收峰，说明N-C纳米酶具有明显的模拟氧化酶活性。对照试验e在652nm附近没有明显的吸收峰，说明，若无N-C纳米酶作催化剂，TMB无法自行氧化；对照试验f在652nm附近无明显的吸收峰，说明实验体系d的峰不是N-C纳米酶自身的响应峰。

实施例5Ce-N-C纳米酶对丁硫克百威的定性和定量检测

将不同浓度的丁硫克百威(0μmol/L、0.01μmol/L、0.03μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.5μmol/L、0.7μmol/L)分别与15μg/mL的纳米酶Ce-N-C、200mmol/L、pH为4.0的NaAc-HAc缓冲溶液混合搅拌均匀，在37℃下反应30min，再加入0.5mmol/L的TMB反应15min，离心，取上清液。

5.1丁硫克百威的定性检测

Ce-N-C纳米酶具有模拟氧化酶活性，丁硫克百威在酸性下水解生成的巯基物质可以降低其模拟酶活性，导致oxTMB的量变少，oxTMB呈蓝色。观察各个上清液颜色，上清液颜色由蓝色逐渐变为浅蓝色(因不可提供带有颜色的附图，故此处带有蓝色上清液的状态图省略)，故可通过上清液颜色对丁硫克百威进行定性检测。从上清液的颜色变化说明，丁硫克百威可以抑制纳米酶模拟氧化酶活性，说明Ce-N-C纳米酶可定性检测丁硫克百威。

5.2丁硫克百威的定量检测

取上述各上清液利用紫外-可见分光光度计或酶标仪检测其500～800nm内的吸光度值，当无目标物丁硫克百威时，记录652nm处吸光度值，记为Abs

Ce-N-C纳米酶具有模拟氧化酶活性，丁硫克百威在酸性下水解生成的巯基物质可以降低其模拟酶活性，导致oxTMB的量变少，oxTMB呈蓝色且在652nm处有明显的紫外吸收峰，故通过紫外-可见分光光度计或酶标仪进行定量检测。

实施例6纳米酶N-C对丁硫克百威的定性和定量检测

将不同浓度的丁硫克百威(0μmol/L、1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L)分别与15μg/mL的N-C纳米酶、200mmol/L、pH为4.0的NaAc-HAc缓冲溶液混合搅拌均匀，在37℃下反应30min，再加入0.5mmol/L的TMB反应15min，离心，取上清液。

6.1丁硫克百威的定性检测

观察各个上清液颜色，上清液颜色由蓝色逐渐变为浅蓝色(因不可提供带有颜色的附图，故此处带有蓝色上清液的状态图省略)，从上清液的颜色变化说明，丁硫克百威可以抑制纳米酶模拟氧化酶活性，说明N-C纳米酶可定性检测丁硫克百威。

6.2丁硫克百威的定量检测

取上述各上清液利用紫外-可见分光光度计或酶标仪检测其500～800nm内的吸光度值，当无目标物丁硫克百威时，记录652nm处吸光度值，记为Abs

纳米酶N-C具有模拟氧化酶活性，丁硫克百威在酸性下水解生成的巯基物质可以降低其模拟酶活性，导致oxTMB的量变少，oxTMB呈蓝色且在652nm处有明显的紫外吸收峰，可通过上清液颜色对丁硫克百威进行定性检测，通过紫外-可见分光光度计或酶标仪进行定量检测。

实施例7纳米酶Ce-N-C/N-C特异性检测丁硫克百威

实验体系A：将丁硫克百威、敌敌畏、克百威、对氧磷、福美双、草甘膦、水胺硫磷、噻虫嗪(农药浓度均为50μmol/L)分别与Ce-N-C纳米酶(15μg/mL)、200mmol/L、pH为4.0的NaAc-HAc缓冲溶液混合搅拌均匀，在37℃下反应30min，再加入0.5mmol/L的TMB反应15min，离心，取上清液用紫外-可见分光光度计或酶标仪检测652nm处的吸光度值。

实验体系B：将丁硫克百威、敌敌畏、对氧磷、草甘膦、福美双、噻虫嗪、水胺硫磷、克百威(农药浓度均为50μmol/L)分别与N-C纳米酶(15μg/mL)、200mmol/L、pH为4.0的NaAc-HAc缓冲溶液混合搅拌均匀，在37℃下反应30min，再加入0.5mmol/L的TMB反应15min，离心，取上清液用紫外-可见分光光度计或酶标仪检测652nm处的吸光度值。

对实验体系A和实验体系B检测结果进行分析，图7和图8中的纵坐标为抑制率，所述抑制率＝[(Abs

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。