一种基于Cas9n诱导的链替换串联Cas12a核酸诊断的方法

技术领域

本发明设计了一种基于Cas9n诱导的链替换串联Cas12a核酸诊断的方法，其特征在于：诊断病原微生物具有超灵敏性以及高特异性，具有良好的临床诊断能力；本方法微量诊断病原微生物，可以为阻断疾病的快速快播提供有效指导，降低爆发大规模公共卫生问题的可能性，同时丰富了病原微生物的诊断技术。

背景技术

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是目前引起食品安全和医疗感染最常见的多重耐药菌之一；MRSA染色体的耐药基因MecA是MRSA感染呈散发或暴发流行的重要原因；疾病的准确和及时诊断是有效治疗、干预和流行病学监测的前提；目前针对微生物的诊断方法主要基于核酸扩增诊断技术；聚合酶链式反应(PCR)、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）, 环介导等温扩增技术（LAMP）, 重组酶聚合酶扩增（RPA）, 链置换扩增术(SDA), Exponentialamplification reaction (EXPAR), 滚环扩增（RCA）等；然而这些检测方法容易出现假阳性问题，在实际现场诊断中具有一定的局限性。

CRISPR/Cas系统是原核生物的一种自我保护机制；其发挥免疫的功能包括适应、表达和干扰3个阶段；该系统可以识别外来核酸的序列，然后通过与CRISPR相关Cas酶的内切酶活性将其清除；CRISPR/Cas系统已经广泛应用于基因组的定向编辑，表观遗传学，细胞成像记录和基因治疗；CRISPR/Cas系统除了卓越的基因组编辑能力外，还与光、磁、电和电化学传感器相结合，用于检测ssDNA、dsDNA、RNA和蛋白质等小分子；随着检测系统的不断成熟，CRISPR/Cas系统有望成为下一代生物传感诊断平台的最佳候选系统之一。

随着CRISPR Cas系统数量的持续增加；目前由单个crRNA与Cas蛋白组合而成的第2类CRISPR-Cas系统主要用于核酸诊断，研究主要集中在Cas9、Cas12a、Cas13a和Cas14a上；第一个CRISPR诊断平台是基于Cas9对寨卡病毒的检测方法；此外， Cas9n可以触发HCR等温扩增反应，并最终通过核酸染料进行荧光检测；Cas12a检测系统可检测dsDNA和ssDNA，当dsDNA被识别时，需要一个PAM位点（5′-TTTV-3′）才能进行切割，而ssDNA靶链的识别不需要PAM序列的协助；基于Cas12a的DETECTR检测系统开发以来，它已被用于各种疾病的快速检测；SHERLOCK技术被发明出来，此后被用于检测RNA病毒流行病，如埃博拉、寨卡、拉沙热和登革热；CRISPR/Cas在分子检测技术中的应用才刚刚起步，现有的CRISPR/Cas系统已与多种等温扩增技术和其他基因检测技术相结合，使核酸分子检测更加方便、快速和高效。

本发明利用Cas9n-sgRNA系统串联Cas12a-crRNA系统开发出了一套超灵敏度、高特异性的病原微生物诊断技术，无需特殊复杂的引物设计，双RNA识别过程极大可能性避免了假阳性结果的产生，同时实现了痕量病原微生物的核酸诊断，拓宽了CRISPR-Cas系统的应用，具有在临床诊断领域的潜能。

发明内容

为实现上述目的，针对超灵敏诊断临床样本中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的问题，提供了一种基于Cas9n诱导的链替换串联Cas12a核酸诊断的方法。

本发明优势在于：其一，由sgRNA、crRNA双RNA识别过程，提高了检测特异性；其二，Cas12a-crRNA在识别靶链过程中无PAM结构的要求，降低了对crRNA的设计要求；其三，Klenow聚合酶替换和扩增过程能过够提高检测灵敏，整个检测过程只需要将PCR后的产物直接加入至荧光检测体系即可进行检测；其四，虽然Cas9蛋白没有反式切割活性，Cas12a蛋白需要PAM序列才能对dsDNA进行快速检测，该检测系统充分利用了两种Cas酶的特性，开发出了可直接对双链DNA进行快速检测方法。

本发明采用的技术方案为：

1. 将10μl的菌接种于5ml的LB液体培养基中， 37℃，180 rpm摇床培养12h；8000rpm/min离心2min收集菌体，使用OMEGA基因组提取试剂盒(# D3350)提取细菌基因组DNA，置于-80℃保存。

2.将MecA扩增引物和基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；其中设置不加目的基因组作为空白对照组。

3．将50 nM Cas9n, 50 nM sgRNA, 0.2 U/μlexo

附图说明

图1基于Cas9n诱导的链替换串联Cas12a诊断系统的原理图；

图2基于Cas9n诱导的链替换串联Cas12a诊断系统链替换的可行性；

图3基于Cas9n诱导的链替换串联Cas12a诊断系统荧光检测的可行性；

图4基于Cas9n诱导的链替换串联Cas12a诊断系统荧光检测的特异性；

图5基于Cas9n诱导的链替换串联Cas12a诊断系统荧光检测的灵敏度。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步说明，有助于本领域的技术人员更全面的理解本发明。

实施例1

将10μl的菌接种于5ml的LB液体培养基中， 37℃，180 rpm摇床培养12h；8000rpm/min离心2min收集菌体，使用OMEGA基因组提取试剂盒(# D3350)提取细菌基因组DNA，置于-80℃保存。

实施例2

将MecA扩增引物和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数。将50 nM Cas9n, 50 nMsgRNA, 0.2 U/μlexo

实施例3

将MecA扩增引物和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；将50 nM Cas9n, 50nM sgRNA, 0.2 U/μlexo

实施例4

将MecA扩增引物和伤寒沙门氏菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；将50 nM Cas9n, 50 nM sgRNA, 0.2 U/μlexo

实施例5

将MecA扩增引物和阴沟肠杆菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；将50 nM Cas9n, 50 nM sgRNA, 0.2 U/μlexo

实施例6

将MecA扩增引物和大肠埃希菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；将50 nM Cas9n, 50 nM sgRNA, 0.2 U/μlexo

实施例7

将MecA扩增引物和弗氏柠檬酸杆菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；将50 nM Cas9n, 50 nM sgRNA, 0.2U/μlexo

实施例8

将MecA扩增引物和酿脓链球菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；将50 nM Cas9n, 50 nM sgRNA, 0.2 U/μlexo

实施例9

将MecA扩增引物和铜绿假单胞菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；将50 nM Cas9n, 50 nM sgRNA, 0.2 U/μlexo

实施例10

将MecA扩增引物和肺炎链球菌基因组DNA加入扩增体系，其中扩增体系包括：2μl扩增引物（10μM）、1μl基因组DNA和22μlPCR mix；然后将其放入95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个反应循环数；将50 nM Cas9n, 50 nM sgRNA, 0.2 U/μlexo

实施例11

将MecA扩增引物和10组不同浓度耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因组DNA（10