提高氧化葡萄糖酸杆菌1,3-二羟基丙酮产量和生产强度的方法

本申请是申请日为2021年4月25日，申请号为202110445471.3的分案申请。

技术领域

本发明涉及提高氧化葡萄糖酸杆菌1,3-二羟基丙酮产量和生产强度的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

1,3-二羟基丙酮(Dihydroxyacetone,DHA)是最简单的三碳酮糖，外观白色或乳白色粉末状结晶，具有甜凉味，易吸湿并分解。1,3-二羟基丙酮能在皮肤上形成薄膜防止水分蒸发，而且1,3-二羟基丙酮还可以与皮肤表层的角质层细胞发生席夫碱反应，从而会使皮肤表层颜色变成棕色，这个可以与晒太阳达到类似的效果，因此，在化妆品中可以被用作防晒剂。根据这种功效还可以减少因过度的紫外线照射可能带来的皮肤性疾病，例如白斑和白癜风等皮肤性疾病。

1,3-二羟基丙酮生产方法主要有化学合成法和微生物合成法。化学法合成法的特点主要是难以在生产条件与原来成本之间找到一个合适的平衡点，因为当生产条件相对简单时原料成本要求高，当原料成本低时生产条件却要求高，而且在合成过程中还需要贵重金属参与。该方法生产1,3-二羟基丙酮存在很多弊端主要包括产物纯度低、副产物多、环境污染严重及产物分离纯化成本高，因此采用化学法生成1,3-二羟基丙酮越来越受到限制。相较而言，微生物合成法由于其反应条件温和、专一性强和底物利用率高，而在工业中被主要采用。此外，微生物发酵工艺对环境污染小、产品相对易于分离纯化而且生产成本也较低。从技术的经济性和环境的友好性来看，微生物发酵法可以很好的避开化学合成方法存在的弊端，相对来说更具发展潜力；而且1,3-二羟基丙酮在工业生产的过程中可以以氧化葡萄酸杆菌为宿主，通过微生物发酵法转化甘油生产1,3-二羟基丙酮，该方法操作流工艺简单、易于操作控制、成本低而且生产周期短，因此该方法成为了目前国内外生产1,3-二羟基丙酮的主要手段。

氧化葡萄酸杆菌中存在很多种多元醇脱氢酶，一般这些脱氢酶也会被称为甘油脱氢酶。该类酶可以氧化具有Bertrand-Hudson构象的糖醇，如甘油、山梨醇、葡萄糖酸等。在这些酶大多是乙醇、山梨醇和甘油脱氢酶，它们的辅基大多是吡咯并喹啉(Pyrroloquinolinequinone，PQQ)。其中甘油是具有这种构象的最简单分子，而且目前以甘油为底物生产1,3-二羟基丙酮是国内外研究的热点之一。但是目前，以甘油为底物生产1,3-二羟基丙酮的产量还较低，无法适应目前的工业化生产。

发明内容

针对目前1,3-二羟基丙酮产量的较低、还无法满足工业化生产的问题，本发明为了进一步提高氧化葡萄酸杆菌生产1,3-二羟基丙酮的能力，通过敲除与其代谢通量有潜在关系的脱氢酶基因，构建得到一系列重组菌，从而获得了结果发现重组菌株的1,3-二羟基丙酮的产量、转化率及生产强度均比对照高。为了解决上述问题，本发明提供一种通过敲除影响1,3-二羟基丙酮代谢通量的脱氢酶基因，从而增强1,3-二羟基丙酮发酵的生产强度和转化率的方法。

本发明的第一个目的是提供生产1,3-二羟基丙酮的基因工程菌，所述基因工程菌是敲除氧化葡萄糖酸杆菌中的脱氢酶基因，所述脱氢酶基因包括编码L-艾杜糖酸-5-脱氢酶I5D、NAD依赖型木糖醇脱氢酶NAD-dependent XD2、乙醇脱氢酶AD4、醛酮脱氢酶ASD、异柠檬酸脱氢酶ID、NAD(P)H脱氢酶NADH-D2、锌依赖型乙醇脱氢酶Zinc-dependent AD和/或葡萄糖酸脱氢酶G2D的基因。

在一种实施方式中，所述编码L-艾杜糖酸-5-脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述编码NAD依赖型木糖醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述编码乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述编码醛酮脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4；所述编码异柠檬酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述编码NAD(P)H脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述编码锌依赖型乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述编码葡萄糖酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，以G.oxydans WSH-003为宿主。

本发明的第二个目的是提供一种提高1,3-二羟基丙酮产量的方法，所述基因工程菌是敲除氧化葡萄糖酸杆菌中的脱氢酶基因，所述脱氢酶基因包括编码L-艾杜糖酸-5-脱氢酶I5D、NAD依赖型木糖醇脱氢酶NAD-dependent XD2、乙醇脱氢酶AD4、醛酮脱氢酶ASD、异柠檬酸脱氢酶ID、NAD(P)H脱氢酶NADH-D2、锌依赖型乙醇脱氢酶Zinc-dependent AD和/或葡萄糖酸脱氢酶G2D的基因。

在一种实施方式中，所述编码L-艾杜糖酸-5-脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述编码NAD依赖型木糖醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述编码乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述编码醛酮脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4；所述编码异柠檬酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述编码NAD(P)H脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述编码锌依赖型乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述编码葡萄糖酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为G.oxydans WSH-003。

本发明的第三个目的是提供一种提高氧化葡萄糖酸杆菌1,3-二羟基丙酮生产强度的方法，其特征在于，敲除氧化葡萄糖酸杆菌中的脱氢酶基因；所述脱氢酶基因包括编码L-艾杜糖酸-5-脱氢酶、NAD依赖型木糖醇脱氢酶、乙醇脱氢酶、醛酮脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、NAD(P)H脱氢酶、锌依赖型乙醇脱氢酶和/或葡萄糖酸脱氢酶的基因。

在一种实施方式中，所述编码L-艾杜糖酸-5-脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述编码NAD依赖型木糖醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述编码乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述编码醛酮脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4；所述编码异柠檬酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；所述编码NAD(P)H脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述编码锌依赖型乙醇脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述编码葡萄糖酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌为G.oxydansWSH-003。

本发明的第四个目的是提供一种生产1,3-二羟基丙酮的方法，所述方法是利用所述基因工程菌，转化生产1,3-二羟基丙酮。

在一种实施方式中，将所述基因工程菌的种子液加入反应体系中，在在25-35℃，200-250rpm条件下反应，反应时间不少于60h。

在一种实施方式中，反应体系中含有甘油100g·L

本发明还提供了所述基因工程菌在生产1,3-二羟基丙酮中的应用。

本发明的有益效果：

本发明方法可提高1,3-二羟基丙酮产量、转化率及生产强度。与对照菌株G.

oxydansWSH-003相比，重组菌株G.oxydans WSH-1、G.oxydans WSH-2、G.oxydansWSH-3、G.oxydans WSH-4、G.oxydans WSH-5、G.oxydans WSH-6、G.oxydans WSH-7和G.oxydans WSH-8的1,3-二羟基丙酮产量(g·L

附图说明

图1为G.oxydansWSH-003敲除不同脱氢酶对1,3-二羟基丙酮产量的影响图。

图2为G.oxydansWSH-003敲除脱氢酶的对照组对1,3-二羟基丙酮产量的影响图

具体实施方式

(一)菌株：氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydansWSH-003。

(二)培养基类型

山梨醇基础培养基(g·L

种子培养基(g·L

发酵培养基(g·L

(三)1,3-二羟基丙酮的测定：高效液相色谱(HPLC)。仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪，色谱条件：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流动相为稀H

实施例1：脱氢酶敲除框的构建

以G.oxydansWSH-003的基因组为模板扩增待敲除的目的基因的上、下游各1000bp的序列，同时利用引物以pBBR1MCS-2为模板扩增出kana基因，以G.oxydansWSH-003基因组为模板扩增upp基因(基因序列如SEQ ID NO.12所示)。利用融合PCR技术将上述四个片段连接起来，构建基因敲除框：左侧同源臂(HAL)-kana-upp-右侧同源臂(HAR)，并将敲除框连接到pMD19-T载体的多克隆酶切位点上，转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中，并将转化子涂布在含有卡那霉素(kana)(50mg/L)的LB平板筛选，将测序正确的菌株进行保存。由于脱氢酶敲除框上带有kana(kana的核苷酸序列详见Genbank：MH539767.1的第1895-2689位)-upp基因，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到G.oxydansWSH-003中，获得能够在卡那霉素kana和头孢西丁的山梨醇基础培养基中正常生长的upp基因缺陷的菌株G.oxydans(敲除基因::kana-upp)，第一轮经过kana抗生素筛选完成后，将其在含有5-氟尿嘧啶(300mg/L)和头孢西丁(50mg/L)的山梨醇基础培养基进行第二轮筛选，从而获得了目的重组菌。

实施例2：重组菌G.oxydansWSH-1的构建

按照实施例1的方法构建敲除I5D基因的敲除框为I5DL-kana-upp-I5DR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到G.oxydansWSH-003中，按照实施例1相同方法筛选，获得了敲除I5D基因的重组菌G.oxydansWSH-1。

实施例3：重组菌G.oxydansWSH-2的构建

按照实施例1的方法构建敲除NAD-dependent XD2基因的敲除框为NAD-dependentXD2L-kana-upp-NAD-dependent XD2R，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到G.oxydansWSH-003中，按照实施例1相同方法筛选，获得了敲除NAD-dependent XD2基因的重组菌G.oxydansWSH-2。

实施例4：重组菌G.oxydansWSH-3的构建

按照实施例1的方法构建敲除AD4基因的敲除框为AD4L-kana-upp-AD4R，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到G.oxydansWSH-003中，按照实施例1相同方法筛选，获得了敲除AD4基因的重组菌G.oxydansWSH-3。

实施例5：重组菌G.oxydansWSH-4的构建

按照实施例1的方法构建敲除ASD基因的敲除框为ASDL-kana-upp-ASDR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydansWSH-003中，按照实施例1相同方法筛选，获得了敲除ASD基因的重组菌G.oxydansWSH-4。

实施例6：重组菌G.oxydansWSH-5的构建

按照实施例1的方法构建敲ID基因的敲除框为IDL-kana-upp-IDR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydansWSH-003中，按照实施例1相同方法筛选，获得了敲除ID基因的重组菌G.oxydansWSH-5。

实施例7：重组菌G.oxydansWSH-6的构建

按照实施例1的方法构建敲除NADH-D2基因的敲除框为NADH-D2L-kana-upp-NADH-D2R，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydansWSH-003中，按照实施例1相同方法筛选，获得了敲除NADH-D2基因的重组菌G.oxydansWSH-6。

实施例8：重组菌G.oxydansWSH-7的构建

按照实施例1的方法构建敲除Zinc-dependent AD基因的敲除框为Zinc-dependent AD L-kana-upp-Zinc-dependent AD R，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydansWSH-003中，按照实施例1相同方法筛选，获得了敲除Zinc-dependent AD基因的重组菌G.oxydansWSH-7。

实施例9：重组菌G.oxydansWSH-8的构建

按照实施例1的方法构建敲除G2D基因的敲除框为G2DL-kana-upp-G2DR，将测序正确的脱氢酶敲除框片段转化到氧化葡萄糖酸杆菌G.oxydansWSH-003中，按照实施例1相同方法筛选，获得了敲除G2D基因的重组菌G.oxydansWSH-8。

实施例10：重组菌与对照菌发酵生产1,3-二羟基丙酮

挑取实施例2-9制备的重组菌G.oxydans WSH-1、G.oxydans WSH-2、G.oxydansWSH-3、G.oxydans WSH-4、G.oxydans WSH-5、G.oxydans WSH-6、G.oxydans WSH-7和G.oxydans WSH-8与对照菌G.oxydansWSH-003，首先分别在山梨醇基础培养基中培养2-3d，挑取单克隆至种子培养基中活化培养24h，再以8％(v/v)的接种量，将上述活化培养好的种子液分别接种到发酵培养基中，在30℃，220rpm条件下进行发酵培养，待发酵72h时，底物甘油消耗完结束发酵。

对发酵液中1,3-二羟基丙酮含量进行检测，发酵结果如图1和表1所示，与对照菌株G.oxydansWSH-003相比，重组菌株G.oxydans WSH-1、G.oxydans WSH-2、G.oxydans WSH-3、G.oxydans WSH-4、G.oxydans WSH-5、G.oxydans WSH-6、G.oxydans WSH-7和G.oxydansWSH-8的1,3-二羟基丙酮产量(g·L

表1G.oxydansWSH-003敲除不同脱氢酶的发酵结果

对比例1

按照实施例1的方法，将G.oxydansWSH-003基因组上的基因NADH-DTII(NADHdehydrogenase type II，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)、ADLP(Aldehydedehydrogenase-like protein，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)、NADH-D(Q)(NADHdehydrogenase(quinone)，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)分别敲除，得到菌株G.oxydans WSH-9、G.oxydans WSH-10、G.oxydans WSH-11，然后按照实施例10的方法发酵生产中1,3-二羟基丙酮，并进行1,3-二羟基丙酮含量的测定，结果如图2所示，结果显示菌株G.oxydans WSH-9、G.oxydans WSH-10、G.oxydans WSH-11的1,3-二羟基丙酮的产量、转化率及生产强度相比对照提高不显著。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。