一种高活力刺梨SOD提取物的干燥及制备方法和应用

技术领域

本发明属于刺梨提取物制备工艺技术领域，具体涉及一种高活力刺梨SOD提取物的干燥及制备方法和应用。

背景技术

刺梨(Rosaroxburghii Tratt.)又名山王果、木梨子，属于蔷薇科蔷薇属多年生落叶灌木。刺梨为药食同源类植物，其果实富含维生素C、超氧化物歧化酶(SOD)、黄酮等多种活性成分。其中，刺梨中维生素C、SOD等易受温度的影响。

目前，公开的刺梨活性提取物的干燥方法主要为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，现有技术刺梨活性提取物的干燥方法均含有加热程序，加热易导致刺梨活性提取物中维生素C减少和SOD失活，进而影响刺梨活性提取物的品质和后续应用，因此，如何不通过加热程序实现刺梨活性提取物的干燥是高活性刺梨活性提取物制备工艺的热点研究方向之一。

超氧化物歧化酶(SOD)，是一种具有清除体内超氧自由基的金属酶类。它能有效地清除机体内超氧自由基，从而有效的预防活性氧对生物体的毒害作用，因而具有抗辐射、抗肿瘤及延缓机体衰老等功能，药用价值极高。随着SOD药理作用研究的深入，其提取技术也越来越受到人们的重视。

现有技术从刺梨中提取出SOD的报道较少，公开的提取方法主要有热变性法、等电点沉淀法、丙酮分级沉淀法等，其中，丙酮分级沉淀法使用的丙酮为有毒试剂，热变性法采用加热程序，加热步骤易造成SOD变性失活，导致刺梨提取物中SOD活力低，大大降低了其应用功效。

[中国专利申请]CN201910331300.0公开了一种刺梨SOD提取方法及装置，具体公开了对刺梨鲜果进行处理，冷冻干燥加工成刺梨粉，然后浸提，再依次进行超声处理、加热、pH调节、丙酮沉淀及真空干燥步骤提取SOD的方法。该方法的制备工艺中的加热步骤、冷冻干燥均含加热程序，加热导致提取物SOD活力减小；此外，该方法采用了毒性试剂丙酮，有毒试剂的使用一方面造成环境污染，另一方面影响该方法所得SOD的应用安全性。

[中国专利申请]CN201810527134.7公开了一种刺梨中SOD的提取方法，具体公开了将刺梨于冰浴下研磨、NaCl低温浸泡过夜、冷冻离心、热变性处理、等电点沉淀、丙酮沉淀处理等步骤提取SOD的方法。该方法热变性步骤造成SOD活力降低，此外，该方法采用了毒性试剂丙酮，不利于SOD后续的应用安全。

[中国专利申请]CN201210265598.8公开了一种SOD的提取方法，具体公开了刺梨加硫磺烘干、粉碎、浸提、离心分离、过滤、浓缩、喷雾干燥等步骤提取SOD的方法。该方法在SOD的提取、浓缩、干燥步骤均采用了加热方式，易引起SOD活力减少，降低SOD的应用功效，不适于工业化应用。

[中国专利申请]CN202110713363.X公开了一种富含SOD及多种营养成分的刺梨提取物的制备方法及其应用，具体公开了通过将刺梨破碎后进行酸处理、提取、分离精制、膜浓缩、过滤和真空干燥等步骤制备SOD刺梨提取物的方法。该方法真空干燥步骤有升温程序，加热条件下易导致SOD活力减少，真空干燥耗时长，能耗大，干燥后提取物颜色深，影响了产品质量。

为了解决上述问题，发明团队对刺梨SOD提取物的干燥方法和提取工艺进行研究，提供一种刺梨SOD提取物的冷藏干燥和制备方法，本发明制备刺梨SOD提取物的方法操作简便，提取及干燥过程中全程未加热，操作温度保持在25℃以下，充分保留了SOD活性，成品刺梨活性提取物中SOD活力高，质量好，利于刺梨SOD提取物后续的工业化应用。

发明内容

本发明的第一目的是克服现有技术的刺梨SOD提取物的干燥方法采用加热程序导致刺梨中SOD活力降低等问题，提供一种高活力刺梨SOD提取物的冷藏干燥方法。

本发明的第二目的是克服现有技术制备刺梨SOD提取物的过程中采用加热程序导致提取物中SOD活力低等问题，提供一种高活力刺梨SOD提取物的制备方法，该方法制备所得刺梨SOD提取物，其美白作用显著增强。

本发明的第一目的通过如下技术方案实现：

一种刺梨SOD提取物的干燥方法：将刺梨SOD提取物装入透析袋中，在透析袋外放置适量硅胶，进行冷藏干燥，得到干燥的刺梨SOD提取物。

本发明的冷藏干燥方法普遍适用于本领域常规或常用的提取方法制得的刺梨SOD提取物。

本发明的第二目的通过如下技术方案实现：

一种高活力刺梨SOD提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣30～﹣10℃环境下冷冻，粉碎，3000～5000r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤，超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入1～3倍体积比，pH为4.5～6.5的磷酸缓冲溶液，于2～25℃条件下提取5～25min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为30～50％，搅拌后在2～8℃下静置2～12h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为70～90％，搅拌后在2～8℃下静置2～12h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液进行冷藏干燥，即得。

优选为，一种高活力刺梨SOD提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣25～﹣15℃环境下冷冻，粉碎，3500～4500r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入1.5～2.5倍体积比，pH为5.0～6.0的磷酸缓冲溶液，于5～20℃条件下提取10～20min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为35～45％，搅拌后在4～6℃下静置4～8h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为75～85％，搅拌后在4～6℃下静置4～8h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液进行冷藏干燥，即得。

进一步优选为，一种高活力刺梨SOD提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣20℃环境下冷冻，粉碎，4000r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入2.0倍体积比，pH为5.0的磷酸缓冲溶液，于10℃条件下提取15min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为40％，搅拌后在5℃下静置6h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为80％，搅拌后在5℃下静置6h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液进行冷藏干燥，即得。

优选为，上述步骤(6)中，所述冷藏干燥方法具体为：将精制酶液装入透析袋中，在透析袋外放适量硅胶，置于2～10℃冷藏干燥8～20h。

进一步优选为，冷藏干燥的温度为4～8℃，时间为10～16h。

更进一步优选为，冷藏干燥的温度为5℃，时间为12h。

优选为，上述步骤(3)中，所述超滤膜的规格为10～100KD。

进一步优选为，所述超滤膜的规格为10KD、50KD、100KD。

本方法制备所得刺梨SOD提取物中，SOD的酶活力≥55000U/g。

本方法制备所得刺梨SOD提取物在美白功能方面的应用。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供了一种不需加热即可实现刺梨SOD提取物干燥的方法，本发明的方法利用刺梨提取物中的SOD是大分子不能透过透析袋的特点和硅胶的吸水作用，实现了刺梨SOD提取物的冷藏干燥。相较于现有技术的真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥等方法，本发明的干燥方法无加热升温程序，在10℃以下就能达到刺梨SOD提取物干燥的效果，有效解决了刺梨SOD提取物干燥过程中因加热升温导致SOD失活的问题。

2、本发明不仅提供了一种能充分保留刺梨提取物中SOD的活力的冷藏干燥方法，还为其他热敏感物质的干燥提供了技术参考。该方法操作简便，适用性广，实用性强，适于在试验研究和生产中进行推广应用。

3、本发明提供了一种刺梨SOD提取物的制备方法，该制备方法通过刺梨冷冻粉碎、离心、微滤、超滤、反渗透膜浓缩、提取、盐析和脱盐等步骤，充分实现了刺梨中SOD的富集和除杂，本发明的制备方法全程未加热，在25摄氏度以下温度内对刺梨中SOD进行了提取，实充分保留了SOD的活力，本发明的制备方法制备所得刺梨SOD提取物中，SOD的酶活力高于55000U/g。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但不用于限制本发明的保护范围。

实施例1制备方法：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣20℃环境下冷冻，粉碎，4000r/min离心，得刺梨汁；

(2)

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、50KD超滤膜超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入2.0倍体积比，pH为5.0的磷酸缓冲溶液，于10℃条件下提取15min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为40％，搅拌后在5℃下静置6h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为80％，搅拌后在5℃下静置6h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液装入透析袋中，在透析袋外放适量硅胶，置于5℃冷藏干燥12h，即得刺梨SOD提取物干燥品。

实施例2制备方法：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣30℃环境下冷冻，粉碎，3000r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、10KD超滤膜超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入1.0倍体积比，pH为4.5的磷酸缓冲溶液，于2℃条件下提取5min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为30％，搅拌后在2℃下静置2h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为70％，搅拌后在2℃下静置2h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液装入透析袋中，在透析袋外放适量硅胶，置于5℃冷藏干燥12h，即得刺梨SOD提取物干燥品。

实施例3制备方法：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣25℃环境下冷冻，粉碎，3500r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、50KD超滤膜超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入1.5倍体积比，pH为5.0的磷酸缓冲溶液，于5℃条件下提取10min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为35％，搅拌后在4℃下静置4h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为75％，搅拌后在4℃下静置4h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液装入透析袋中，在透析袋外放适量硅胶，置于4℃冷藏干燥10h，即得刺梨SOD提取物干燥品。

实施例4制备方法：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣15℃环境下冷冻，粉碎，4500r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、50KD超滤膜超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入2.5倍体积比，pH为6.0的磷酸缓冲溶液，于20℃条件下提取20min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为45％，搅拌后在6℃下静置8h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为85％，搅拌后在6℃下静置8h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液装入透析袋中，在透析袋外放适量硅胶，置于8℃冷藏干燥16h，即得刺梨SOD提取物干燥品。

实施例5制备方法：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣10℃环境下冷冻，粉碎，5000r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、100KD超滤膜超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入3.0倍体积比，pH为6.5的磷酸缓冲溶液，于25℃条件下提取25min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为50％，搅拌后在8℃下静置12h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为90％，搅拌后在8℃下静置12h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液装入透析袋中，在透析袋外放适量硅胶，置于10℃冷藏干燥20h，即得刺梨SOD提取物干燥品。

实施例6制备方法：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣30℃环境下冷冻，粉碎，4000r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、100KD超滤膜超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入3.0倍体积比，pH为6.5的磷酸缓冲溶液，于22℃条件下提取23min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为50％，搅拌后在6℃下静置8h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为90％，搅拌后在6℃下静置8h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液装入透析袋中，在透析袋外放适量硅胶，置于6℃冷藏干燥14h，即得刺梨SOD提取物干燥品。

实施例7制备方法：

(1)前处理：取刺梨鲜果，洗净后置于﹣20℃环境下冷冻，粉碎，5000r/min离心，得刺梨汁；

(2)过滤浓缩：取步骤(1)的刺梨汁，经微滤、50KD超滤膜超滤，收集超滤膜截留液，经反渗透膜浓缩，得浓缩液；

(3)提取：向步骤(2)的浓缩液中加入3.0倍体积比，pH为6.5的磷酸缓冲溶液，于14℃条件下提取16min，过滤，得粗酶液；

(4)盐析：向步骤(3)的粗酶液中加入硫酸铵使其饱和度为50％，搅拌后在4℃下静置10h，离心、收集上清液；向上清液中加入硫酸铵使其饱和度为80％，搅拌后在4℃下静置10h，离心，收集沉淀；

(5)脱盐：将沉淀溶于缓冲液内，装入透析袋中，低温透析，收集透析液得精制酶液；

(6)干燥：将精制酶液装入透析袋中，在透析袋外放适量硅胶，置于6℃冷藏干燥14h，即得刺梨SOD提取物干燥品。

实施例8应用：

实施例1-7制备所得刺梨SOD提取物在美白功能方面的应用。

干燥方法对比实验：

1、待测实验样品的制备

将本发明实施例1-7的方法制备所得精制酶液分为4组，分别按本发明冷藏干燥法、现有技术的真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥进行干燥得待测干燥刺梨SOD提取物；

2、实验方法

参照保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定方法(标准编号：GB/T5009.171-2003)，对上述干燥后的刺梨SOD提取物活力进行测定，结果见表1：

表1：不同干燥方法刺梨SOD活力测定结果单位：U/g

试验结论：从表1可以看出，本发明的冷藏干燥法对刺梨SOD提取物中SOD活力影响极小，充分保留了提取物中SOD的活力。相较于现有技术的真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥方法，本发明的冷藏干燥法无加热程序，且全过程均在低温条件下干燥，有效保留了SOD，具有成品SOD活力高的特点。

本发明刺梨SOD提取物的美白功效实验：

1.检测条件：酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素，其在475nm下有特征吸收峰，在抗氧化物存在时，多巴色素的产生会被抑制，在475nm测定多巴色素的吸光度即可测定并计算出样品的酪氨酸酶抑制能力。

2.酪氨酸酶的提取：取0.1g土豆加入1mL提取液进行匀浆研磨，离心后取上清液即得酪氨酸酶提取液。

3.样液制备：刺梨汁及富含SOD刺梨提取物分别稀释成不同浓度梯度的样品溶液，总反应体系为200mL。取不同浓度梯度的待测样本各20mL，分别依次加入140mL试剂一、20mL酪氨酸酶提取液，37℃下反应10min后，于475nm处测定其吸光度，空白管用纯水代替，每份样品平行测定3次。按照公式计算酪氨酸酶抑制率，绘制标准提取物浓度梯度与酪氨酸酶抑制率相关性曲线，并通过计算样品的IC

4.计算公式

酪氨酸酶抑制率％＝[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100

式中A为含有酪氨酸酶但不含样品的反应体系的吸光度值；B为不含酪氨酸酶且不含样品的反应体系的吸光度值；C为含有酪氨酸酶且含有样品的反应体系的吸光度值；D为不含酪氨酸酶但含有样品的反应体系的吸光度值。

富含SOD刺梨提取物与刺梨汁干粉的酪氨酸酶抑制试验结果见表2。

表2：富含SOD刺梨提取物酪氨酸酶抑制率测定表

5.结论

富含SOD刺梨提取物对酪氨酸酶抑制率较刺梨汁干粉明显要强。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。