一种抗黄单胞菌属病害相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种抗黄单胞菌属病害相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

黄单胞菌属病原细菌是重要的植物病原菌，其寄主范围广，在多种重要农作物上引起严重的细菌性病害，例如水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、柑橘溃疡病、茄科细菌性斑点病等，其病害防控难度较大。研究显示，该类病原细菌分泌到寄主细胞内的三型效应蛋白是构成其致病力的主要因素。其中，AvrBs2是黄单胞属种最保守的效应蛋白之一，在黄单胞菌种普遍存在，且是多个黄单胞属致病变种的关键毒力因子，例如细菌性条斑病菌

Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)，辣椒细菌性斑点病菌

Xanthomonascampestrispv.vesicatoria等。然而其分子机制尚不清楚。

本专利申请人通过研究，首次揭示了黄单胞属三型效应蛋白AvrBs2的致病分子机制。研究发现AvrBs2是一种环化磷酸糖脂合成酶，如图1，在黄单胞菌侵染植物过程中，能在植物细胞内合成一种新的环状磷酸糖脂化合物，我们将其命名为黄单胞碱，该化合物结构式为bis-1’,6’-cyclic dimericα-D-galactose-phosphate,c-di-galactose-phosphae。如图2，我们的研究结果显示AvrBs2通过合成黄单胞碱去执行其毒性功能，帮助细菌致病。

发明内容

如图3，申请人发现黄单胞属细菌中存在一个编码磷酸二酯酶的基因xanP,并证实该基因编码的蛋白产物能够分解黄单胞碱，解除其对植物的毒性功能。

申请人基于以上的突破性研究发现，本发明的目的是提供一种抗黄单胞菌属病害相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的抗黄单胞菌属病害相关蛋白来源于水稻细菌性条斑病菌(Xoc)菌株RS105，名称为黄单胞碱磷酸二酯酶，XanP，为如下A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白质具有相同功能的蛋白质。

序列表中序列2由261个氨基酸残基组成。

为了使A1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

上述A1)或A2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1-786位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述抗黄单胞菌属病害相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

本发明提供一种分离的多核苷酸，其从5’到3’的方向包含编码来自黄单胞属的黄单胞碱水解酶xanP家族的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述编码xanP的核苷酸序列是来自水稻细菌性条斑病菌黄单胞碱水解酶xanP的序列，如序列1中所示。

又或者，可以对编码xanP的核苷酸序列进行修饰，例如一个或几个密码子(即核苷酸三联体)的缺失和/或添加和/或替代。所述修饰既可以是沉默的，例如经修饰的编码XanP的氨基酸序列与XanP的天然氨基酸序列相同。也可以是保守的，例如经修饰的编码XanP的氨基酸序列与XanP的天然氨基酸序列不同，且所述XanP变体具有与天然XanP相当或者相同的黄单胞碱水解活性。本发明还涵盖非沉默的或非保守的修饰。

又或者，可以对编码xanP的核苷酸序列进行修饰，例如一个或几个密码子(即核苷酸三联体)的缺失和/或添加和/或替代。在一个具体的实施方案，所述修饰的编码xanP的核苷酸序列与XanP的天然氨基酸序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的核苷酸序列同源性或同一性，所述修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与XanP天然氨基酸序列相同。在另一个具体的实施方案中，所述经过修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与XanP天然氨基酸序列不同的变体，且所述XanP变体具有与天然XanP相同或相当的黄单胞碱水解活性。在另一个实施方案中，对编码XanP的核苷酸序列进行修饰，经过修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与XanP天然氨基酸序列不同的XanP变体，所述XanP变体的氨基酸序列与XanP的天然氨基酸序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的氨基酸序列同源性或同一性，且所述XanP变体具有与天然XanP相同或相当的黄单胞碱水解活性。

又或者，黄单胞菌属以外其他细菌中的核苷酸序列，这些序列从5’到3’的方向包含编码的蛋白质序列与XanP的同源性有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％，且具有与XanP相同或相当的化学活性，能够水解黄单胞碱。

又或者，对编码XanP同源蛋白的核苷酸序列进行修饰，例如一个或几个密码子(即核苷酸三联体)的缺失和/或添加和/或替代。所述XanP变体编码的氨基酸序列与XanP的天然氨基酸序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的氨基酸序列同源性或同一性，且所述变体核苷酸编码蛋白质具有与天然XanP相同或相当的黄单胞碱水解活性。

又或者以上所述的多核苷酸序列与其他多核苷酸序列的融合多核苷酸序列和该多核苷酸序列中部分核苷酸序列，且其编码蛋白质具有与天然XanP相同或相当的黄单胞碱水解活性。

由所述核苷酸表达得到的蛋白质，具有水解黄单胞碱的活性。

优选的，所述编码基因为如下1)或2)或3)：

1)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述抗黄单胞菌属病害相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗黄单胞菌属病害相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。

序列表中序列1自5′末端第1-786位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

与所述抗黄单胞菌属病害相关蛋白相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用，也属于本发明的保护范围；所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码所述抗黄单胞菌属病害相关蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)抑制所述抗黄单胞菌属病害相关蛋白编码基因表达的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下1)或2)或3)：

1)序列表中序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述抗黄单胞菌属病害相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗黄单胞菌属病害相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％ SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

所述微生物具体可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。

所述转基因细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括植物的繁殖材料。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

所述抗病性为对黄单胞菌细菌引起的病害的抗性。

针对黄单胞菌属病原细菌的“抗黄单胞碱转基因抗病育种方法”，即通过将黄单胞菌中编码黄单胞碱磷酸二酯酶XanP的xanP基因转化到不同的寄主植物(包括但不限于稻(Oryza，包括Oryza sativa L.)、柑橘属(Citrus)、辣椒(Capsicum frutescens L.)、番茄(Solanumlycopersicum L.)、油菜(Brassica campestris L.)、甘蓝(Brassica oleraceaL.))中，使不同的寄主植物获得分解由AvrBs2介导合成的黄单胞碱的能力，以降低效应蛋白AvrBs2的细胞毒性，增强转基因植物对不同黄单胞菌属病害的抗病性。

具体地，本发明涉及用于在植物细胞中表达黄单胞碱的磷酸二酯酶XanP的转基因构建体、包含所述转基因构建体的重组载体、以及用所述转基因构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因植物细胞和转基因植物及其制备方法。本发明还涉及赋予植物水解黄单胞碱(bis-1’,6’-cycl ic dimeric

α-D-galactose-phosphate,c-di-galactose-phosphae)和对黄单胞菌属病害抗病性增强的方法。

本发明还提供了一种核酸构建体，其包含本发明中分离的多核苷酸。本发明还提供了一种重组载体，其包含本发明中分离的多核苷酸，或包含本发明的核酸构建体。在一个实施方案中，所述重组载体是重组克隆质粒或重组表达质粒。本发明还提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，或包含本发明的核酸构建体，或包含本发明的重组载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是原核宿主细胞，例如细菌宿主细胞。在一个具体的实施方案中，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia col i)宿主细胞。在另一个具体的实施方案中，所述细菌宿主细胞是农杆菌宿主细胞，诸如根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)宿主细胞。

本发明还提供了一种转基因植物细胞和转基因植物，其包含本发明的分离的多核苷酸，或包含本发明的核酸构建体，或包含本发明的重组载体，或包含本发明的宿主细胞。在一个实施方案中，本发明分离的多核苷酸整合在所述转基因植物细胞的基因组中。在一个实施方案中，所述植物或所述植物细胞是农作物，包括粮食作物、果蔬作物和经济作物。在一个实施方案中，所述植物或所述植物细胞包括但不限于下组的植物或植物细胞：稻(Oryza，包括Oryza sativa L.)、柑橘属(Citrus)、辣椒(Capsicum frutescens L.)、番茄(Solanumlycopersicum L.)、油菜(Brassica campestris L.)、甘蓝(Brassica oleraceaL.)。在一个实施方案中，所述转基因植物细胞和转基因植物具有水解黄单胞碱和增强对黄单胞菌属病害的抗病性。

本发明还提供了制备本发明的转基因植物细胞和转基因植物的方法，其包括将本发明中分离的多核苷酸、核酸构建体、重组载体或重组宿主细胞导入植物细胞的步骤。在一个实施方案中，本发明中分离的多核苷酸整合在所述转基因植物细胞的基因组中。在一个实施方案中，所述转基因植物细胞和转基因植物具有水解黄单胞碱和增强对黄单胞菌属病害的抗病性。

本发明还提供了赋予植物细胞或植物水解黄单胞碱和增强对黄单胞菌属病害的抗病性的方法，其包括将本发明中分离的多核苷酸、核酸构建体、重组载体或重组宿主细胞导入植物细胞的步骤。

在一个实施方案中，本发明分离的多核苷酸整合在所述转基因植物细胞的基因组中。

实验证明，xanP在水稻中表达能够增强对细菌性条斑病菌的抗病力。XanP作为黄单胞菌水解酶，在植物中表达后，能够分解黄单胞菌效应蛋白AvrBs2合成的黄单胞碱，减少该化合物在植物细胞中的累积，从而减弱该化合物对水稻免疫的抑制作用和减少细菌通过该化合物摄取营养物质，达到抑制细菌生长和病斑扩增的作用。

附图说明

图1是黄单胞菌分泌效应蛋白AvrBs2在植物细胞中合成黄单胞碱。左图为Xoc野生型(WT)、avrBs2基因敲除体(ΔavrBs2)、野生型avrBs2基因回补体(ΔavrBs2-C)和酶活缺失型avrBs2

图2是黄单胞碱促进Xoc对水稻的致病力。用1mM的黄单胞碱，溶于0.01％SilwetL-77，或对照(0.01％ SilwetL-77)喷雾处理水稻叶片表面后，接种avrBs2敲除菌株(ΔavrBs2)到野生型水稻日本晴叶片，14天后统计发病状况。上图为发病病斑照片，下图为病斑长度统计柱状图。显著性分析，t检测(***，P<0.001)。

图3是薄层色谱法分析原核表达纯化的XanP水解黄单胞碱。将xanP基因或其酶活缺失突变体xanP

图4是转基因表达盒的示意图。LB，T-DNA的左边界；RB，T-DNA的右边界；35Spromoter，花椰菜花叶病毒的35S启动子，即CaMV35S启动子；Ubipromoter，玉米泛素启动子；HptII，潮霉素磷酸转移酶II基因；xanP，来源于稻生黄单胞菌条斑致病变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)的黄单胞水解酶xanP基因；3FLAG，编码3倍FLAG标签的核苷酸序列；胭脂碱合成酶基因Nos的转录终止序列。

图5显示了转基因水稻的XanP蛋白的Western印记检测。通过western杂交对野生型和表达XanP的的转基因水稻进行检测发现在组成性表达xanP的两个转基因株系OE-xanP-4和OE-xanP-5中均检测到XanP蛋白的表达，而在野生型水稻中未检测到条带。丽春红染色(Ponceau S)显示总蛋白上样量。

图6xanP转基因水稻对不同Xoc菌株的抗病性增强。不同Xoc菌株(RS60，RS85和SD21)分别注射接种到野生型或者xanP转基因水稻，14天后统计发病状况。左图为发病病斑照片，右图为病斑长度统计柱状图。字母a，b表示经过方差分析和Tukey’s honestsignificance test多重比较分析后，显示显著性差异关系。

图7xanP转基因水稻接种Xoc菌株RS105后植物内黄单胞碱累积量显著降低。Xoc菌株RS105接种野生型水稻日本晴或者xanP转基因水稻株系OE-xanP-4和OE-xanP-5后，分析水稻病斑中黄单胞碱的含量。左图为薄层色谱法检测黄单胞碱含量，右图为含量统计柱状图。a，b和c表示经过方差分析和Tukey’s honest significance test多重比较分析后，显示显著性差异关系。

具体实施方式

发明详述定义

本文中“序列同源性或同一性％”是指通过序列对比，并且必要时插入空隙以获得同源性或同一性的最大百分比(而且，在计算序列同一性％时不考虑任何保守替代)，候选序列中相同于目标序列的氨基酸残基的百分数。此处所述序列包括氨基酸序列和核苷酸序列。可使用本领域已知的各种方法测定序列同源性或同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megal ign(DNASTAR)等。本领域技术人员可以确定用于序列对比的具体参数，以及全长序列的最大比较所需的任何算法。

本文中“核酸构建体”与“转基因构建体”同义，指单链或双链核酸分子，这些分子分离自天然基因或经过改变而含有以自然界不存在的方式而结合和并列的核酸片段。当核酸构建体含有表达本发明XanP所需的所有调控序列时，术语“核酸构建体”与“表达盒”是同义词。

本文中“宿主细胞”包括任何能接受本发明所述分离的核酸序列，或能接受含有该序列的构建体或载体，并使该序列稳定维持在细胞内的细胞。宿主细胞包含了本发明所述分离的核酸序列后，能获得由该序列编码的性状或特征。

黄单胞碱申请人发现并命名的一种环状糖磷脂化合物，其英文名xanthopine,结构式bis-1’,6’-cyclic dimericα-D-galactose-phosphate。黄单胞碱是黄单胞菌属病原细菌分泌到植物细胞内的三型效应蛋白AvrBs2合成的一种代谢物，是参与黄单胞菌致病过程的重要毒性因子。

本发明还涉及上述蛋白质的变体或突变体，其中所述变体或突变体的氨基酸序列相对于本文所述氨基酸序列有一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或添加，但该变体或突变体仍具有水解黄单胞碱活性。所述氨基酸的取代、缺失和/或添加都是本领域常规技术可以完成的。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社(Academic Press)出版的Protein中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Iys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly，以及它们相反的互换。

对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的分离的核酸序列编码的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的具有水解黄单胞碱活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲合标记等技术测定(参见，如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

本发明还涉及与本文所述氨基酸序列(例如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列)具有一定同源性或同一性的氨基酸序列，如同源性或同一性为至少约50％，优选至少约60％，优选至少约65％，优选至少约66％，优选至少约67％，优选至少约68％，优选至少约69％，优选至少约70％，优选至少约71％，优选至少约72％，优选至少约73％，优选至少约74％，优选至少约75％，优选至少约76％，优选至少约77％，优选至少约78％，优选至少约79％，更优选至少约80％，更优选至少约81％，更优选至少约82％，更优选至少约83％，更优选至少约84％，更优选至少约85％，更优选至少约86％，更优选至少约87％，更优选至少约88％，更优选至少约89％，更优选至少约90％，更优选至少约91％，更优选至少约92％，更优选至少约93％，更优选至少约94％，最优选至少约95％，最优选至少约96％，最优选至少约97％，最优选至少约98％，最优选至少约99％，只要具有所述氨基酸序列的蛋白具有水解黄单胞碱活性，该序列就属于本发明的范围。

本发明还涉及如下的蛋白质，其具有含本文所述氨基酸序列(例如序列2所示氨基酸序列)之水解黄单胞碱活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少60％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少100％。

本发明还涉及上述多核苷酸的变体或突变体，其中所述变体或突变体的核苷酸序列相对于本文所述核苷酸序列有一个或几个三联体密码子的取代、缺失和/或添加，但该变体或突变体仍具有水解黄单胞碱活性的蛋白质。所述三联体密码子的取代、缺失和/或添加都是本领域常规技术可以完成的。

本发明的核酸序列可以是基因组序列、cDNA序列、RNA序列、半合成的序列、完全人工合成的序列或其任何组合物。

当合适时，可以优化编码XanP的核苷酸序列，以提高在植物中的表达。换言之，可以使用植物偏爱的密码子来合成编码XanP的核苷酸序列，以提高表达。参见例如Campbel l和Gowri(1990)Plant Phys iol.92：1-11。合成植物偏爱型基因的方法是本领域公知的。参见例如美国专利号5,380,831；5,436,391；及Murray等，(1989)Nucleic AcidsRes.17：477-498。还可以为了降低核酸的二级结构而优化编码XanP的核苷酸序列，从而提高基因的表达。

核酸构建体或转基因构建体

本发明的另一方面涉及核酸构建体。

在一个实施方案中，所述核酸构建体用于在植物细胞中表达黄单胞碱水解酶XanP。转化水稻成熟胚诱导的愈伤组织的方法是已知的。参见例如Wang等，Nat.Commun.12,5479。

在一个实施方案中，本发明的核酸构建体以从5’到3’的方向包含编码黄单胞碱水解酶的核苷酸序列。例如，所述编码黄单胞碱水解酶的核苷酸序列可以是编码稻生黄单胞菌条斑致病变种的核苷酸序列，见序列表中的SEQ ID NO：1。

本发明的核酸构建体还可含有能使上述序列在所选宿主细胞中表达所必需的调控序列。所述调控序列与上述分离的核酸序列在核酸构建体中可操作地连接。

调控序列可以是启动子序列，包括介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的、及杂合的启动子，而且可以从编码细胞外或细胞内多肽的基因中得到，这些多肽可以与该细胞同源或不同源。众多用于原核细胞的启动子为本领域所熟知。

调控序列也可以是适当的转录终止序列，即被本文所述的宿主细胞识别以终止转录的序列。该终止序列与编码多肽的核酸序列的3’端可操作地连接。任何在宿主细胞中有功能的终止子都可以在本发明中使用。

调控序列可以是适当的前导序列，即mRNA上对细胞的翻译很重要的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5’端可操作地连接。任何在宿主细胞中有功能的前导序列都可以在本发明中使用。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列。该序列与核酸序列的3’端可操作地连接，而且当转录时，被细胞作为信号来识别，从而将聚腺苷酸残基加到转录出的mRNA上。任何在该细胞中有功能的聚腺苷酸化序列都可以在本发明中使用。

核酸构建体还可以包括一个或几个这样的核酸序列，这些核酸序列编码一个或几个有利于指导异源多肽表达的因子，例如，转录激活因子(如反式作用因子)、伴侣蛋白和加工型蛋白酶。任何在宿主细胞特别是细菌细胞和植物细胞中有效的因子都可以在本发明中使用。编码一个或几个这些因子的核酸不一定与编码异源多肽的核酸序列串联。

重组载体或重组表达载体

可以将上述各种核酸和调控序列连接在质粒或病毒等常规载体上，产生本发明的“重组表达载体”，所用方法是本领域技术人员所熟知的(例如可参见J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatus，1989，Molecular Cloning Laboratory mannual，第2版，ColdSpring，NY)。载体的选择通常取决于载体与所用宿主细胞的兼容性。所述载体可以是线性或闭合环状质粒。这样的载体可以是自主复制型载体，即，以染色体外实体的形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒(一种染色体外元件)，微型染色体，或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何手段。或者，所述载体也可在导入细胞后，整合到基因组中并随染色体一起复制。载体系统可以是单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(它们共同包含目标核酸序列)，或是转座子。

宿主细胞

本发明还涉及含有本发明核酸序列的重组“宿主细胞”。可将含有本发明核酸序列的核酸构建体或载体引入宿主细胞中，使本发明的核酸序列整合至染色体上或使载体自主复制，从而本发明的核酸序列得以在该宿主细胞中稳定表达或者分泌，导致赋予该宿主细胞水解黄单胞碱活性。

宿主细胞可以是原核生物如细菌的细胞，也可以是真核生物如植物的细胞。常用的细菌细胞有革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌的细胞，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌的细胞。

将表达载体引入细菌宿主细胞可通过原生质体转化(如Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学168：111-115)，利用感受态细胞(如Young和Spizizin，1961，J.Bacteriol.81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.56：209-221)，通过电穿孔(如Shigekawa和Dower，1988，Biotech.6：742-751)，或通过接合作用(如Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.169：5771-5278)而实现。

转基因植物

将异源DNA导入植物细胞后，可以通过本领域已知的多种方法来确认异源基因在植物基因组中的整合。

PCR测定法：可以使用对目标基因或土壤杆菌载体背景等特异性的寡核甘酸引物来进行PCR，用以筛选植物细胞中是否存在所整合的基因。

Southern测定法：可以通过基因组DNA的Southern印迹测定法来确认植物转化。

一般而言，从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶上分开，并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术，用例如放射性同位素标记的靶DNA片段探查膜或印迹，以确认所导入的外源基因在植物基因组中的整合。

RT-PCR测定法：可以通过总RNA的RT-PCR测定法来确认异源基因在转基因植物中的转录。

Western印迹测定法：可以对转基因植物进行Western印迹，其中使用能结合XanP蛋白上的一个或几个表位的抗体。

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

Xoc菌株RS105、RS60和RS85：记载在文献Wanget.al.2015.Rice OsFLS2-mediatedperception of bacterial flagellins is evaded by

Xanthomonasoryzaepvs.oryzae and oryzicola.Molecular Plant 8,1024-1037.中。Xoc菌株SD21为申请人从田间分离得到。上述菌株均经过常规鉴定，公众可以从中国农业大学获得。

实施例1、本发明抗黄单胞菌属病害的抗病基因的获得

本专利申请人通过研究，首次揭示了黄单胞属三型效应蛋白AvrBs2的致病分子机制。

研究发现AvrBs2是一种环化磷酸糖脂合成酶。申请人利用同源重组技术构建了水稻细菌性条斑病菌(Xoc)菌株RS105背景下的avrBs2基因敲除体菌株和其质粒回补体菌株，具体步骤参见Li et al.,TheTypeIII Effector AvrBs2inXanthomonasoryzaepv.oryzicola Suppresses Rice Immunity and Promotes Disease Development.Mol.PlantMicrobe Interact.2015,28,869-880。将各菌株在NA培养基中培养中过夜培养后，收集菌体，注射野生型水稻日本晴植株叶片，两周后统计叶片发病病斑长度(Li et al.,TheTypeIII Effector AvrBs2 in Xanthomonas oryzaepv.oryzicola Suppresses RiceImmunity and Promotes Disease Development.Mol.Plant Microbe Interact.2015,28,869-880)；此外，将发病叶片病斑区域剪下后，收集，液氮冷冻后打碎成粉末，称重，每100mg粉末加入100μl的蒸馏水和100μl的苯酚溶液，混匀后，65℃处理5min，然后13,400g离心10min，取上清，在TLC silica gel 60薄层层析板(Merck Millipore,Darmstadt,Germany)上，在展开剂(异丙醇/蒸馏水/乙酸＝3/1/1；v/v/v)中层析20min，然后用二苯胺-苯胺-磷酸显色剂处理，100℃放置10min后显色。结果如图1所示，在黄单胞菌侵染植物过程中，avrBs2能在植物细胞内合成一种新的磷酸糖脂化合物，我们将其命名为黄单胞碱，其结构式如式I所示。进一步，我们对该化合物进行分离纯化，鉴定其结构名为bis-1’,6’-cyclicdimericα-D-galactose-phosphate。

该黄单胞碱获得方法如下：首先将avrBs2的编码区构建到地塞米松(Dex)诱导表达型载体pTA7001中，然后将测序验证正确的pTA7001-avrBs2质粒DNA转化到农杆菌菌株EHA105中，用于转化水稻获得转pTA7001-avrBs2水稻(Li et al.,TheTypeIII EffectorAvrBs2 in Xanthomonas oryzaepv.oryzicola Suppresses Rice Immunity andPromotes Disease Development.Mol.Plant Microbe Interact.2015,28,869-880.)。

转pTA7001-avrBs2水稻种子去壳后，先用75％乙醇浸泡2min，然后用50％的次氯酸钠溶液浸泡40min表面灭菌，然后无菌水洗6次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放置到1/2MS固体培养基上生长一周；将长好的幼苗用1/2MS液体培养基+30μM DEX，每瓶400ml 1/2MS液体培养基+30μMDex诱导50-100颗幼苗处理1-2周；400ml培养液(或200g幼苗研磨成粉末，加入200ml ddH

申请人进一步对黄单胞碱在侵染中的毒性功能进行了分析。首先，申请人将纯化的黄单胞碱配置成溶解到0.001％silwet的溶液中，配置成1mM的悬浮液，然后用黄单胞碱悬浮液或者mock(0.001％silwet水溶液)喷雾处理六周大的水稻叶片，24小时后处理，按图1中所述方法用ΔavrBs2敲除体菌株接菌水稻叶片，两周后统计叶片病斑长度。结果如图2所示，用黄单胞碱溶液预先处理的水稻叶片发病病斑长度显著大于mock处理的叶片病斑长度，说明AvrBs2通过合成黄单胞碱去执行其毒性功能，帮助细菌致病。

申请人，通过对黄单胞属不同细菌的基因组序列比对分析发现，在avrBs2基因附近存在一个高度保守的基因xanP，该基因预测编码一个2H类型的功能未知的磷酸二酯酶，我们推测XanP可能是一个能够水解黄单胞碱的水解酶。于是申请人通过PCR扩增，将xanP的编码区扩增出来，是从细菌性条斑病菌菌株RS105中通过PCR扩增出来，以细菌性条斑病菌菌株RS105基因组基因为模板，以pET28a-xanP-F AAAGCATATGatgtcgtcgtttctggacac；pET28a-xanP-RaaaGAATTCTCAGACCTCATGCATCGTGC为引物，进行PCR扩增，扩增产物回收纯化后，用限制性内切酶NdeI和EcoRI酶切后，用T4连接酶连入pET28a载体得到重组质粒pET28a-xanP，然后转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)感受态细胞后,对单克隆菌落进行扩大培养，提取质粒并测序验证。结果表明，扩增得到磷酸二酯酶基因xanP，即为本发明的抗黄单胞菌属病害的抗病基因，其序列如序列表中序列1所示，序列表中序列1自5′末端第1-786位核苷酸为编码序列，编码序列表中序列2所示的氨基酸序列，即为本发明抗黄单胞菌属病害相关蛋白XanP。

序列表中序列1的核苷酸序列为：

序列表中序列2的氨基酸序列为：

实施例2、本发明抗黄单胞菌属病害相关蛋白对黄单胞碱的降解作用验证

在pET28a-xanP质粒的基础上，通过PCR定点突变的方法，获得了催化活性位点突变体质粒pET28a-xanP

申请人基于以上的突破性研究发现，在本发明中提出了针对黄单胞菌属病原细菌的“抗黄单胞碱转基因抗病育种方法”，即通过将黄单胞菌中编码磷酸二酯酶XanP的xanP基因转化到不同的寄主植物(包括但不限于稻(Oryza，包括Oryza sativa L.)、柑橘属(Citrus)、辣椒(Capsicum frutescens L.)、番茄(Solanumlycopersicum L.)、油菜(Brassica campestris L.)、甘蓝(Brassica oleracea L.))中，使不同的寄主植物获得分解由AvrBs2介导合成的黄单胞碱的能力，以降低效应蛋白AvrBs2的细胞毒性，增强转基因植物对不同黄单胞菌属病害的抗病性。

实施例2、转基因水稻的获得及其抗病性验证

一、转基因构建体的构建

为了在植物中表达xanP基因，设计并构建了转基因构建体(图4)。为了检测XanP蛋白质的表达，将PCR扩增的全长编码序列xanP(SEQ ID NO：1)，通过限制性内切酶KpnI和HindIII酶切后连接入植物表达载体pC1305，得到表达表达xanP基因的重组再提，将该重组载体命名为pXanP01。

在该pXanP01载体中,编码xanP基因多核苷酸序列3’端后面连入了编码3×Flag多核苷酸序列(SEQ ID NO：3)，xanP-3×Flag融合多核苷酸片段由玉米Ubi启动子驱动转录。

二、转基因植物的构建

2.1重组质粒转化到农杆菌EHA105感受态细胞中

在50μl农杆菌感受态细胞(EHA105)中加入5μlpXanP01质粒；冰上放置15分钟，再迅速放入液氮中90秒，然后放入37℃水浴1分钟；之后迅速放在冰上3分钟；加入500μl的LB液体培养基后；放入水平摇床，在28℃，200rpm条件复苏3小时；在超净工作台中，取的50ul菌液涂布在含有卡那霉素(Ka)+利福平(Rif)抗生素的LB培养基上；放入28℃条件下倒置涂布板培养48小时。然后挑取多个单斑混合后，接种到5ml含Ka+Rif抗生素的LB液体培养基中，在28℃，转速200rpm的摇床上培养24小时。2.2用农杆菌转化水稻日本晴成熟胚诱导的愈伤组织

2.2.1.水稻成熟胚诱导的愈伤组织

去壳的野生型水稻品种日本晴(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)成熟种子先用75％乙醇浸泡1-2min，然后用50％的次氯酸钠溶液浸泡40min，进行表面灭菌(最好在摇床上进行)，无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基NBi上，28℃,16h光照，8h暗培养。约7、14和30d后，剥下成熟胚盾片长出的愈伤组织，转入成熟胚继代培养基NBi上，在相同条件下继代培养7d。

2.2.2.农杆菌菌液的准备

将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含50μg/mLKa和25μg/mL RifYEP液体培养基中，200rmp、28℃振荡培养16-24h。在新的含有50μg/mLKa和25μg/mL RifYEP固体培养基上涂板，28℃暗培养2-3d，刮菌转接于共培养液体培养基中，加入乙酰丁香酮(Acetosyringone，AS)，使AS终浓度为100μΜ。调整菌液浓度至OD

2.2.3.农杆菌侵染水稻愈伤组织

继代的愈伤组织放入100mL无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可)，室温放置15min，并不时轻轻摇动。倒掉菌液，将侵染过的水稻愈伤组织放在无菌滤纸上30min，吸去水稻愈伤表面多余的菌液，放入固体共培养基上，25℃，暗培养3天。

2.2.4.潮霉素抗性愈伤组织筛选和转基因水稻分化成苗

将共培养后的愈伤组织放入100mL无菌三角瓶中,用灭菌水洗9次，再用含400mg/LTimentin的灭菌水洗1次，用无菌滤纸吸干愈伤组织表面的水分；放在含有40mg/LHygromycin的抗性愈伤筛选培养基NBs上，28℃培养30天。大部分愈伤组织在筛选后10d左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出鲜黄色的抗性愈伤组织。挑选新长出的抗性愈伤组织转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选7-10d。

从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选鲜黄色致密的抗性愈伤组织转至含有40mg/LHygromycin的再生培养基NBr上,光培15-25d左右,有绿点出现。30-40天后进一步分化出小苗。当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时,将小苗移到生根培养基上,培养两周左右。选择高约10-15cm、根系发达的小苗，洗去培养基，灭菌水继续在组培室培养一周左右，待小苗茎杆生长较为粗壮时，移栽入土。获得xanP转基因水稻株系。

愈伤诱导培养基Nbi：KNO

400mg/L，MgSO

27.8mg/L，Na

3.00mg/L，ZnSO

共培养基Nbco：NBi培养基，添加100μM的乙酰丁香酮，pH值调至5.5。

抗性愈伤筛选培养基：NBi培养基，添加50mg/L的潮霉素和400μg/ml的特美汀。

分化培养基NBr：NBi培养基，添加0.5mg/L的α-萘乙酸、3mg/L的6-BA和200μg/ml的特美汀。

三、转基因水稻的western检测

依照常规技术制备SDS-PAGE凝胶，其中上层浓缩胶浓度为5％，下层分离胶浓度为12％。取xanP转基因水稻株系叶片组织，液氮冷冻打碎成粉末后，用2×SDS上样缓冲液提取总蛋白质，进行SDS-PAGE，然后转印迹到硝酸纤维素膜上。将膜放入含5％牛奶的TBS/T缓冲液中封闭1小时后，与1∶5000稀释的抗Flag单克隆抗体(sigma-Aldrich)室温孵育1小时，然后用TBS/T缓冲液洗3次。然后，再和1∶3000稀释的偶联有辣根过氧化物酶的山羊抗兔IgG抗体(CWBio)孵育1小时，用TBS/T缓冲液洗三次。然后添加化学发光显色液，进行化学发光成像。如图5所示，在xanP转基因水稻株系OE-xanP-4和OE-xanP-5中检测到XanP表达的条带，而在野生型日本晴中对应的位置未检测到目标条带。

实施例4：转基因水稻对细菌性条斑病菌的抗病力测定

将不同Xoc菌株(RS60、RS85和SD21)在NA培养基平板上划线，放入28℃培养箱培养48小时，然后挑取单斑，到NA液体培养基中培养24小时，收集菌体后，用10mM的MgCl

实施例5：转基因水稻接种条斑病菌后黄单胞碱累积量检测

用黄单胞菌(Xoc)菌株RS105，按实施例4中方法接种xanP转基因水稻OE-xanP-4和OE-xanP-5和野生型水稻日本晴植株，接种14天后，取叶片发病组织，称重后，液氮冷冻，振荡成粉末，然后分别加入等体积的苯酚和水，混匀后放入65℃孵育5分钟，然后13,400g，4℃离心10分钟，取水相。然后对样品进行薄层色谱分析，用苯胺-二苯胺显色液对黄单胞碱(如式I所示)进行显色。用浓度为2mM、1mM、0.8mM、0.6mM和0.4mM的黄单胞碱作为标准品同时进行薄层色谱分析，用Photoshop软件统计黄单胞碱条带灰度值，绘制标准曲线，并计算病斑中黄单胞碱含量。如图7所示，在Xoc侵染后，xanP转基因水稻株系OE-xanP-4和OE-xanP-5叶片病斑中黄单胞碱的累积量显著低于野生型日本晴叶片。