一株多粘类芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株多粘类芽孢杆菌Paenibacilus polymyxa及其在防治葡萄枝干病害等植物病害上的应用，属于植物病害生物防治技术领域。

背景技术

葡萄是我国重要的经济作物，在我国具有悠久的栽培历史。据FAO统计，截至2021年，我国葡萄栽培面积位居世界第二位，葡萄及其相关产业在我国农业生产中占有较大的比重。然而，在葡萄种植生产过程中常常受到各类病害的威胁，目前全球已经报道了71种与葡萄有关的病害，病害问题已经成为了限制葡萄产业健康发展的关键因素之一。葡萄枝干病害是一类为害葡萄枝干、根部等维管束病害的统称，自上世纪70年代首次报道以来，目前已被发现广泛分布于全球主要葡萄种植地区(VARELA C P,REDONDO V,COSTAS D,AGUIN O,MANSILLA P.Fungi associated with grapevine trunk diseases in nursery-producedVitis vinifera plants.Phytopathologia Mediterranea,2019,57(3):407-424.)。葡萄枝干病害具有病原菌种类多、症状复杂、发生规律尚不清晰、发病机制研究较为基础等特点，迄今，田间缺乏高效的防控手段。目前对于葡萄枝干病害仍以化学防治为主，但实际生产中仍然缺乏高效防治该类病害的药剂，且化学药剂的施用易造成环境污染、农药残留等问题，采用生物防治手段控制葡萄枝干病害已成为该类病害防治研究的热点(GRAMAJE D,

类芽孢杆菌属细菌(Paenibacilus spp.)在自然界中分布较广，是土壤与植物微生态的优势种群之一，具有抗逆性强、抗菌物质丰富、促生效果好等特点，一些菌种已得到商品化应用。多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)是一类重要的植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，对水稻纹枯病菌(KAVITHA S,SENTHILKUMAR S,GNANAMA NICKAM S,et al.Isolation and partial characterizationof antifungal protein from Bacilus polymyxa strain VLB16.ProcessBiochemistry,2005,40(10):3236-3243.)、辣椒炭疽病菌(邓阳.Paenibacillus polymyxaJSa-9抗菌物质的结构鉴定及小麦生防应用研究.南京：南京农业大学,2012.)、镰刀菌(ZHAI Y,ZHU J X,TAN T M,et al.Isolation and characterization of antagonisticPaenibacilus polymyxa HX-140 and its biocontrol potential against Fusariumwilt of cucumber seedlings.BMC Microbiology,2021,21:75)等多种植物病原真菌具有很好的抑制效果，美国环境保护署(EPA)认可其为可商业化应用的微生物之一(GRADY E N,MACDONALD J,LIU L,et al.Current knowledge and perspectives of Paenibacilus：areview.Microbial Cell Factories,2016,15:203)，我国农业农村部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。目前，尚无关于多粘类芽孢杆菌防治葡萄枝干病害的相关研究报道，因此探索多粘类芽孢杆菌在防治葡萄枝干病害中的作用，有望为葡萄枝干病害等葡萄病害的有效防控提供一种有效措施。

发明内容

本发明目的在于提供一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)BJ-2及其应用。该菌对引起葡萄枝干病害的病原菌具有较强的抑制作用，用该菌防治葡萄枝干病害具有较好的防治效果，从而可减少化学农药的投入，减轻环境污染，实现农业可持续发展。

本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)，采集分离自河北省张家口怀来县的葡萄枝干病害的病组织，其分类命名为多粘类芽孢杆菌Paenibacilus polymyxa，名称为BJ-2，已于2021年12月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.24114。

本发明自河北省张家口怀来县土木葡萄基地采集的葡萄枝干病害样品组织中分离得到一株对于葡萄病原真菌具有广谱性抑制作用的菌株。基于16S rRNA分子鉴定和理化性质研究，将该菌株鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)，命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)BJ-2,其生理特征如下：

本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)BJ-2在LB培养基上不产色素，菌落为乳白色不透明，圆形或近圆形，边缘光滑，表面油状。所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)BJ-2的生理生化特征为革兰氏染色阳性，可产纤维素酶和淀粉酶。

本发明的多粘类芽孢杆菌具有针对葡萄病原真菌的抑菌活性。所述葡萄病原真菌为可可毛色二孢菌(Lasiodiplodia theobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、甜樱间座壳(Diaporthe eres)、大豆间座壳(Diaporthe sojae)、葡萄炭疽菌(Coletotrichum viniferum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、Neopestalotiopsis sp.、Coniela vitis、Dactylonectria macrodidyma。

本发明还提供一种生物农药，所述生物农药含有所述的多粘类芽孢杆菌BJ-2。

本发明又提供一种微生物肥料，所述微生物肥料含有所述的多粘类芽孢杆菌BJ-2。

所述多粘类芽孢杆菌或其产生的抑菌活性物质在制备对植物病原真菌具有拮抗活性和/或对植物具有促生作用的生物农药和/或生物菌肥中的应用也属于本发明的保护范围内。

本发明还提供所述多粘类芽孢杆菌在防治植物病原真菌中的应用。

所述植物病原真菌为葡萄病原真菌，优选为可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae、葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea、甜樱间座壳Diaporthe eres、大豆间座壳Diaporthe sojae、Coletotrichum viniferum、灰葡萄孢Botrytis cinerea、Neopestalotiopsis sp.、Coniela vitis和Dactylonectria macrodidyma中的一种或多种。

所述的多粘类芽孢杆菌在促进植物幼苗生长中的应用也属于本发明的保护范围。

所述应用中，优选的，所述促进植物幼苗生长的方法是将权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌发酵液稀释至1×10

本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)BJ-2具有对葡萄病原真菌的抑菌活性并且具有较宽的抑菌谱。菌株BJ-2对葡萄蔓枯病的大豆间座壳(Diaporthesojae)中GG-6抑制效果最佳，抑制率达67％，对大豆间座壳菌的生长有明显的抑制作用。菌株BJ-2对葡萄枝枯病菌(Neopestalotiopsis sp.)中PTP038的抑菌活性最差，抑制率为44％。BJ-2对其他5种葡萄主要真菌病害的抑制率均在54％-65％之间。此外，菌株BJ-2发酵液对葡萄离体绿枝条及大田葡萄上的枝干病害有明显的防治作用，且对黄瓜、萝卜等植物生长具有明显的促进作用。菌株BJ-2在生物制剂方面具有非常好的应用前景，对于生物防治葡萄真菌病害具有重要的意义。

附图说明

图1菌株BJ-2菌落特征

图2菌株BJ-2的淀粉酶检测结果

其中，左：大肠杆菌Escherichia coli JM109，右：菌株BJ-2。

图3菌株BJ-2蛋白酶检测结果

其中，左：大肠杆菌Escherichia coli JM109，右：菌株BJ-2。

图4菌株BJ-2纤维素酶检测结果

其中，左：大肠杆菌Escherichia coli JM109，右：菌株BJ-2。

图5基于16SrDNA系统进化树

图6菌株BJ-2不同处理对幼苗叶绿素含量的影响

其中，处理1为清水对照，处理2为2×10

图7菌株BJ-2不同处理对黄瓜幼苗鲜重的影响

其中，处理1为清水对照，处理2为2×10

图8菌株BJ-2不同处理对黄瓜幼苗干重的影响

其中，处理1为清水对照，处理2为2×10

图9菌株BJ-2不同处理对黄瓜幼苗壮苗指数的影响

其中，处理1为清水对照，处理2为2×10

图10菌株BJ-2不同浓度发酵菌液对萝卜幼苗茎长的影响。

图11菌株BJ-2不同浓度发酵菌液对萝卜幼苗根长的影响。

图12菌株BJ-2不同浓度发酵菌液对萝卜幼苗鲜重的影响。

图13菌株BJ-2不同浓度发酵菌液对萝卜幼苗干重的影响。

具体实施方式

实施例1.菌株BJ-2的获得与鉴定

菌株BJ-2分离自河北省张家口怀来县表现葡萄枝干病害症状的葡萄病枝干组织。分离方法为组织分离法，具体方法如下：(1)去掉田间采集的葡萄枝干病样的树皮，从枝干组织的病健交界处切出5mm

参照《常见细菌系统鉴定手册》对菌株BJ-2进行生理生化特征研究，同时基于16SrRNA序列对菌株BJ-2进行了分子鉴定。

1菌株BJ-2的生理生化特征

1.1淀粉酶的检测

将待测菌株在LB固体培养中培养3d后，挑取单菌落点接在淀粉酶检测培养基(可溶性淀粉1g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5 g，牛肉膏5g，琼脂15g。)上，28℃恒温培养24-48h，观察有无透明圈，如有则说明菌株具有产生淀粉酶的能力。

检测结果：如图2所示，待测菌株BJ-2菌落外围没有明显透明圈产生，说明菌株BJ-2不产生淀粉酶，不具有淀粉水解酶活性。

1.2蛋白酶检测

将待测菌株在LB固体培养基中培养3d后，挑取单菌落点接在蛋白酶检测培养基(蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，CaCl

检测结果：如图3所示，在菌株BJ-2的周围无透明圈产生，说明它不能产生蛋白酶，不具有蛋白水解酶活性。

1.3纤维素酶检测

将待测菌株在LB固体培养基中培养3d后，挑取单菌落点接在纤维素酶检测培养基上(碳源、氮源减半LB，加0.2％羧甲基纤维素钠)，28℃恒温培养24-48h，1g/L刚果红染色1h，用NaCl溶液浸泡洗涤2次进行洗脱。每次浸泡30min，观察有无透明圈，如有则说明菌株具有产生纤维素酶的能力。

检测结果：如图4所示，BJ-2菌株周围能产生透明圈，说明该菌株能产生纤维素酶，具有纤维素水解酶活性。

2菌株BJ-2的分子鉴定

2.1基因组DNA的提取

将保存的菌液涂平皿后，25℃培养3d后，用接种环刮下菌体后使用LB液体培养基洗出，采用北京博迈德基因技术有限公司细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取细菌的基因组DNA。

2.2 PCR扩增

以菌株BJ-2的基因组DNA为模板，选用细菌16S rDNA通用引物27f和1492r进行PCR扩增。引物序列分别为：27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492r：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR反应体系为(50μL)：25μL 2×Taq PCR Master Mix，2μL DNA模版，2μL 27f，2μL 1492r，19μL ddH

PCR扩增反应程序：先95℃预变性3min，然后95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，进行35循环，最后72℃延伸8min，12℃终止反应

PCR扩增产物通过电泳检测，片段长度约为1500bp。

2.3序列分析与分子鉴定

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证后，送至北京博迈德基因技术有限公司测序。所获得序列与NCBI网站GenBank数据库中的序列进行比对，获得与测序16S rDNA序列相似度最高的菌株种类。结果显示，BJ-2菌株的与多粘类芽孢杆菌Paenibacilus polymyxa菌株P2-5的16S rDNA序列相似度为99.58％，将其初步鉴定为多粘类芽孢杆菌近缘种群菌株。

BJ-2菌株16S rDNA序列的PCR扩增片段测序结果如序列表中序列1所示。

根据基因片段序列，利用MEGA软件，分别基于16S rDNA序列利用ML方法构建系统发育树，如图5所示，结果表明菌株BJ-2与多粘类芽孢杆菌标准菌株IAM 13419(GenBank登录号：D16276.1)聚合到一起，据此，将菌株BJ-2鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibaciluspolymyxa。将菌株BJ-2保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏日期2021年12月16日，保藏编号为CGMCCNo.24114。

实施例2.菌株BJ-2的抑菌活性测定

采用对峙培养法，以9种葡萄病原真菌的17株菌株(表1，表中菌株为田间采集并分离纯化的菌株，均经过常规菌种鉴定)为靶标菌，检测菌株多粘类芽孢杆菌(Paenibaciluspolymyxa)菌株BJ-2对葡萄病原真菌的拮抗能力。用打孔器(5mm)分别切取在PDA培养基上25℃恒温培养3～7天的可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、甜樱间座壳(Diaporthe eres)、大豆间座壳(Diaporthesojae)、葡萄炭疽菌(Coletotrichum viniferum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、Neopestalotiopsis sp.、Coniela vitis、Dactylonectria macrodidyma菌落边缘的菌饼，放置到PDA平板中央，同时吸取4μL培养好的发酵液(菌株BJ-2在LB固体培养基上37℃培养2～3d，后挑取单菌落于LB液体培养基内，37℃200rpm/min摇培8～10h)滴加在直径为6mm的滤纸片上，放置距平板边缘约1cm处，1个平板放4个滤纸片，并以滤纸片上滴加同样剂量的清水作为对照，28℃培养箱中培养5d，测量相对菌株BJ-2方向病原菌菌丝生长的半径(D)和抑菌带宽度(d)，计算抑菌率。每个处理重复3次。结果如表2所示：

抑制率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％

实验结果表3所示，多粘类芽孢杆菌(Paenibacilus polymyxa)BJ-2对不同葡萄真菌病害具有不同程度的抑菌活性，对引起葡萄蔓枯病的大豆间座壳(Diaporthe sojae)中GG-6抑制效果最佳，抑制率为67.16％，对大豆间座壳菌的生长有明显的抑制作用。菌株BJ-2对葡萄枝枯病菌(Neopestalotiopsis sp.)中PTP038的抑菌活性最差，抑制率为44.59％。菌株BJ-2对其他5种葡萄真菌病害病原菌的抑制率均超过50％，在54％-65％之间。

表1供试的17株葡萄病原真菌

表3菌株BJ-2对17株葡萄病原真菌的抑菌活性

实施例3.菌株BJ-2对葡萄溃疡病的防治作用

3.1发酵液的制备

BJ-2菌株发酵液的制备：用灭菌的牙签挑取菌株BJ-2单菌落接种于装有10mL的LB液体培养基中，25℃180rpm振荡培养12h后倒入装有100mL的发酵培养基的三角瓶中25℃180rpm振荡培养3d，得到菌株BJ-2的发酵液(1.08×10

3.2试验方法

3.2.1菌株BJ-2在离体的新鲜枝条上对葡萄溃疡病菌GX-5-5的治疗作用

从顺义北务香逸葡萄园采集健康新鲜当年生半木质化的夏黑葡萄绿枝条，剪去叶片先用清水清洗表面，后用75％的酒精湿巾擦拭消毒再用无菌水冲洗表面晾干备用。用灭菌的直径为4.0mm的打孔器在枝条节间中部处打取直径大小为4.0mm，深1.0mm的伤口，剥掉表皮，将事先培养的病原菌菌株用4.0mm打孔器均匀打成菌饼，用灭菌的牙签将菌饼置于伤口处，用剪成小段的封口膜将接菌饼的位置包好，插入装有蛭石基质营养钵中，以空白PDA平板为对照，喷施BJ-2菌株发酵液、接菌浸入无菌水和接空白PDA浸入无菌水的枝条作为对照。将加入千分之一吐温后的BJ-2三种浓度发酵液均匀喷施在枝条上，并使用枯草芽孢杆菌2000倍液作为对照药剂。每个处理接种7根枝条，进行3次重复。接种后将处理的枝条置于控温控制的接种室中，接种后中加湿培养2d，相对湿度为90％，此后，温度25℃，湿度60％；接种7-10d后，调查各处理的发病情况，对病斑长度进行测量。

3.2.2数据统计与分析

接种7-10d后对各处理的发病情况和病斑长度进行测量，采用SPSS 18软件对数据进行统计分析，计算公式如下：

防治效果(％)＝[(对照病斑长度-处理病斑长度)/(对照病斑长度-菌饼直径)]×100％

3.3结果

BJ-2三种浓度的发酵液与枯草芽孢杆菌2000倍液对葡萄溃疡病菌GX-5-5的治疗作用防治效果的实验结果如表示所示，10

表4菌株BJ-2对GX-5-5的防治效果

实施例4.BJ-2发酵菌液对黄瓜幼苗的促生作用

4.1材料与方法

4.1.1菌株BJ-2发酵液的制备

种子液制备：使用250mL容量的三角瓶装入100mL已灭菌的LB液体培养基，将BJ-2挑取单菌落接入LB液体培养基内，在25℃180rpm/min条件下，震荡培养12h。

发酵培养：BJ-2：将种子液倒入装有100mL的发酵培养基(蔗糖15g/L，蛋白胨15g/L，MgSO

4.1.2菌株BJ-2发酵液对黄瓜幼苗的促生作用

采用灌根法测定菌株BJ-2发酵液对黄瓜幼苗的促生作用。黄瓜种子经3％NaClO处理1min，无菌水漂洗3次后温水浸种6h，挑选萌发状态相似的黄瓜种子播种于装有草炭营养基质的盆钵(口径14.5cm，高12.0cm)中，出苗后，保留健康植株。将制备的2×10

4.1.3数据统计与分析

于第一次灌根后第28d时测量地上部及根的鲜重和干重并记录，并同时使用SPAD-502叶绿素仪测量叶绿素含量。用SPSS 25软件分析对数据进行统计分析。

4.2结果

叶绿素含量测定结果表明，BJ-2三种浓度发酵液对黄瓜叶绿素含量有明显促进作用，显著优于空白对照(图6)，相比空白对照分别增加了7.40％、5.76％、7.50％，三种浓度发酵液处理之间无显著性差异。

黄瓜根鲜重测定结果表明，2×10

壮苗指数结果显示，2×10

实施例5.BJ-2发酵菌液对萝卜幼苗的促生作用

5.1材料与方法

5.1.1菌株BJ-2发酵液的制备

方法与实施例4的4.1.1相同。

5.1.2菌株BJ-2发酵液对萝卜幼苗的促生作用

将萝卜种子放于3％NaClO中浸泡1min进行表面消毒后，使用无菌水洗涤3次。将种子放入培养皿中，使用无菌水浸润种子，然后置于26℃培养箱中对萝卜种子进行催芽处理12h后，将浓度为1×10

5.1.3数据统计与分析

分别于4d、7d和10d后测量各处理的幼苗茎长度、根长及鲜重，采用SPSS 25软件进行数据分析。

5.2结果

BJ-2发酵液对萝卜幼苗茎生长的影响结果显示，1×10

结果表明，与清水对照处理相比，BJ-2发酵液对萝卜幼苗的茎长生长有明显的促进作用，对根长生长无明显促进作用。其中1×10

以上所述实施例仅展示了本发明的几种实施方式，其描述较为具体，但对本发明而言只是说明性的，而非限制性的。对于本领域普通技术人员来说，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。