一种青霉菌及其回收微藻并促进微藻产油的方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种青霉菌及其回收微藻并促进微藻产油的方法和应用。

背景技术

微藻是一种光合效率高、环境适应性强的生物，其主要化学成分是脂类、蛋白质和碳氢化合物。微藻可以通过光合作用固定CO

张靖洁等人在菌藻耦合对小球藻生物量和产油率影响的实验中，分别利用假单胞菌、菠萝泛菌与埃氏小球藻构成菌藻耦合体系，显著提高了了埃氏小球藻的生物量，并提高了藻细胞油脂中单不饱和脂肪酸(十六烯酸和十八烯酸)合成积累量，但假单胞菌和菠萝泛菌均无法有效回收微藻(张靖洁,段露露,程蔚兰,季春丽,崔红利,李润植.菌藻耦合提高小球藻生物量和产油率[J].生物技术通报,2019)。顾琼等利用卷枝毛霉对小球藻进行高效收获时，其共培养48h使小球藻的收获率达到91.08％(顾琼,金文标,陈远清,郭仕达,万超凡.利用卷枝毛霉成球特性高效收获微藻[J].环境科学,2017)、中国专利CN114317283A中报道了利用黑曲霉捕获微藻，接种黑曲霉菌丝球后24～72h使微藻的收获率维持在93％～97％；卷枝毛霉和黑曲霉虽能使小球藻的收获率达到90％以上，但并未提高微藻油脂含量。由此可见，现有技术中缺少一种既能保证快速、稳定收获微藻，又能促进微藻产油的菌种，因此，寻找到一种高效回收微藻并促进微藻产油的微生物菌种是十分重要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种青霉菌及其回收微藻并促进微藻产油的方法和应用，以解决现有微藻产油技术中产油微藻培养耗时长、油脂含量低，且无法高效回收微藻的问题。

基于上述目的，本发明提供了一种青霉菌，所述青霉菌的保藏名称为Penicilliumsp.AHP141，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M20221363。

优选的，所述青霉菌的ITS拼接遗传核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供所述青霉菌高效回收微藻并促进微藻产油的方法，具体包括如下步骤：

步骤一、将青霉菌Penicillium sp.AHP141接种于液体培养基中，摇床振荡培养至形成菌丝球；

步骤二、将所述菌丝球加入到微藻培养液中进行培养使其回收微藻，并形成菌藻耦合体；

步骤三、将所述菌藻耦合体接种到液体培养基中进行共培养，以促进微藻产油。

步骤一中接种的青霉菌Penicillium sp.AHP141为孢子悬液。

优选的，接种于液体培养基中的孢子悬液的孢子浓度为1×10

优选的，步骤一中青霉菌培养的温度为25～35℃，转数为110～200rpm，时间为24～96h。

优选的，步骤二中采用的微藻种子液的藻细胞数为1×10

优选的，步骤三中所述共培养条件为25～32℃，转数为120～180rpm，时间为96～168h。

可选的，所述微藻包括小球藻。

优选的，所述液体培养基包括PDB培养基、改良的BG-11培养基。

本发明还提供所述青霉菌在废水处理以及提高菌藻产油量中的应用。

本发明的有益效果：本发明克服了现有技术中微藻的收获成本高、油脂含量低的问题，且絮凝回收微藻后形成的菌-藻耦合体可在短时间内降低废水COD、TP、TN，并促进油脂的积累，满足商业化生产应用的需求，是促进微藻回收、产油的一条新途径，具备良好的应用前景。本发明使微藻收获率最高达到99.7％，在100％屠宰废水中进行菌藻共培养时，油脂产量提高了24.46％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为青霉菌Penicillium sp.AHP141在固体培养基上的生长状态图；

图2为实施例1中青霉菌Penicillium sp.AHP141经培养后形成菌丝球状态图；

图3为实施例1中青霉菌Penicillium sp.AHP141絮凝小球藻Chlorella sp.后形成菌藻耦合体状态图；

图4为实施例1、2、3中青霉菌Penicillium sp.AHP141对小球藻Chlorella sp.、实球藻Pandorina sp.和栅藻Scendesmus sp.絮凝收获的结果统计图；

图5为实施例4中屠宰废水处理前后颜色变化；

图6为实施例4中油脂产量统计图；

图7为实施例6中油脂产量统计图；

图8为实施例8中油脂产量统计图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

本发明提供了一种青霉菌，青霉菌的保藏命名为Penicillium sp.AHP141，于2022年9月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO：M20221363。

本发明还提供了一种青霉菌菌高效回收微藻并促进微藻产油的方法，该方法是利用青霉菌Penicillium sp.AHP141与微藻形成耦合体从而达到高效原位回收微藻并促进微藻产油，微藻包括小球藻，但不限于小球藻。具体方法如下：

1、青霉菌Penicillium sp.AHP141培养及菌丝球制备。青霉菌Penicilliumsp.AHP141的培养以孢子悬液接种，接种的孢子悬液的孢子浓度优选为1×10

2、菌-藻耦合体制备。将上述Penicillium sp.AHP141菌丝球加入藻细胞数在1×10

3、菌-藻耦合体的应用并促进微藻产油。将上述制备好的菌-藻耦合体加入到有机废水中进行振荡培养。菌-藻耦合体接种量为0.25～2个/mL，进一步优选为0.25～0.5个/mL；培养温度为25～32℃，进一步优选为28～30℃；转数为120～180rpm，进一步优选为140～160rpm；培养时间为12～168h，进一步优选为24～120h。经过培养，可以有效处理废水，同时实现微藻油脂产量的增加。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例中用到的改良BG-11培养基以水为溶剂，包括以下浓度的组分：

葡萄糖10g/L，KNO

实施例中用到的藻种来源如下：

实验所用藻种来自于安徽省工业微生物分子育种工程实验室。

实施例1

在超净工作台中，严格按照无菌操作将斜面保存的青霉菌(Penicilliumsp.AHP141)菌种用接种环以划线形式接入PDA培养基平板表面，放入培养箱中，30℃条件下进行活化扩培。挑选平板上菌落较大的单一菌株，接到种子培养基平板上，放入培养箱中，30℃培养3d，青霉菌(Penicillium sp.AHP141)在固体平板培养基上的生长状态如图1所示。

在超净工作台中向青霉菌(Penicillium sp.AHP141)平板中加入10mL无菌水，用接种环轻轻刮取孢子，然后将得到的孢子悬浮液转移到新的无菌试管中，振荡一段时间使孢子呈均匀分散状态，再以无菌水将霉菌孢子稀释成不同浓度的孢子悬浮液，然后再显微镜下利用血细胞计数板计数。

向含100mL PDB的锥形瓶中加入青霉菌(Penicillium sp.AHP141)孢子使得孢子浓度为5×10

取小球藻Chlorella sp.藻液加入至改良BG-11中，使得藻液浓度为1×10

实施例2

向含100mL PDB的锥形瓶中加入青霉菌(Penicillium sp.AHP141)孢子使得孢子浓度为1×10

取实球藻Pandorina sp.藻液转移至改良BG-11中，使得藻液浓度为5×10

实施例3

向含100mL PDB的锥形瓶中加入青霉菌(Penicillium sp.AHP141)孢子使得孢子浓度为1×10

取栅藻Scendesmus sp.藻液转移至改良BG-11中，使得藻液浓度为1×10

在实施例1、2、3中通过检测吸光度来计算微藻收获率；

计算公式为：微藻收获率＝(1-收获前吸光度/收获后吸光度)×100％；

将结果进行统计，如图4所示。

由图4可知，青霉菌(Penicillium sp.AHP141)在不同条件下对小球藻、实球藻、栅藻的絮凝率均达到了90％以上，其中小球藻的絮凝率达到99.7％。

实施例4

向含100mL PDB的锥形瓶中加入青霉菌(Penicillium sp.AHP141)孢子使得孢子浓度为5×10

取藻细胞浓度为1×10

取100mL 100％、75％、50％、25％的屠宰废水于250mL锥形瓶中，分别接种50颗青霉菌-小球藻耦合体、10mL藻细胞浓度为1×10

将处理完屠宰废水后的小球藻、青霉菌-小球藻耦合体离心过滤，取沉淀用蒸馏水水冲洗3遍，称取湿菌体重量。每克湿菌体加10mL 4mol/L的盐酸，振荡混匀，室温下处理一定时间，然后沸水浴3-5min，立即置于-20℃速冷。冷却后，加入10mL甲醇，振荡2min混匀，按甲醇:氯仿＝1:1体积比加入10mL氯仿，振荡2min，4000rpm离心20min收集下层氯仿层，再加入等体积的0.15％氯化钠溶液，混匀后4000rpm离心20min，收集下层氯仿层，所有氯仿层溶液用已知重量的接收瓶收集氯仿层，在80～85℃水浴中蒸去氯仿，于105℃烘1h冷却后称重，记录油脂重量，图6为油脂产量统计图。

由图6可知，青霉菌-小球藻耦合体系的油脂产量明显高于单纯小球藻的油脂产量，青霉菌-小球藻耦合体系在处理50％屠宰废水组时油脂产量达到最大，其油脂产量为454.44mg/L，高于单纯小球藻组的384.33mg/L，由此可以说明，该方法能使微藻在短时间内快速积累油脂，提高油脂产量。

实施例5

取15mL实施例4中处理后的100％屠宰废水，分别利用硫酸——重铬酸钾消解体系(GB11914-89)、碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ636-2012)、钼酸铵分光光度法(GB11893-89)来测定屠宰废水处理前后COD、TN、TP的变化。

将COD、TN、TP结果进行统计，如表1所示。

表1青霉菌耦合小球藻体系对100％屠宰废水中COD、TN、TP的去除率

由表1可知，不同浓度的屠宰废水在小球藻和青霉菌-小球藻耦合体的处理下COD、TN、TP整体大都呈现下降趋势，但菌-藻耦合组对废水COD、TN、TP的去除效果更好，COD、TN、TP的去除率分别达到83.34％、79.27％、56.21％，由此可见，菌藻耦合体系在净化废水领域有较好的应用前景，为日后废水资源化应用奠定了基础。

实施例6

向含100mL PDB的锥形瓶中加入青霉菌(Penicillium sp.AHP141)孢子使得孢子浓度为1×10

取藻细胞浓度为5×10

取100mL 100％、75％、50％、25％的屠宰废水于250mL锥形瓶中，分别接种25颗青霉菌-实球藻耦合体、10mL藻细胞浓度为5×10

将处理完屠宰废水后的实球藻、青霉菌-实球藻耦合体离心过滤，取沉淀用蒸馏水水冲洗3遍，称取湿菌体重量。每克湿菌体加10mL 4mol/L的盐酸，振荡混匀，室温下处理一定时间，然后沸水浴3-5min，立即置于-20℃速冷。冷却后，加入10mL甲醇，振荡2min混匀，按甲醇:氯仿＝1:1体积比加入10mL氯仿，振荡2min，4000rpm离心20min收集下层氯仿层，再加入等体积的0.15％氯化钠溶液，混匀后4000rpm离心20min，收集下层氯仿层，所有氯仿层溶液用已知重量的接收瓶收集氯仿层，在80～85℃水浴中蒸去氯仿，于105℃烘1h冷却后称重，记录油脂重量，图7为油脂产量统计图。

由图7可知，青霉菌-实球藻耦合体系在处理50％屠宰废水组时油脂产量达到最大，其油脂产量为372.81mg/L，高于单纯实球藻组的318.98mg/L。

实施例7

取15mL实施例6中处理后的100％屠宰废水，分别利用硫酸——重铬酸钾消解体系(GB11914-89)、碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ636-2012)、钼酸铵分光光度法(GB11893-89)来测定屠宰废水处理前后COD、TN、TP的变化。

将COD、TN、TP结果进行统计，如表2所示。

表2青霉菌耦合实球藻体系对100％屠宰废水中COD、TN、TP的去除率

由表2可知，青霉菌-实球藻耦合体系对屠宰废水的COD、TN、TP的去除率分别达到80.99％、84.04％、50.82％。

实施例8

向含100mL PDB的锥形瓶中加入青霉菌(Penicillium sp.AHP141)孢子使得孢子浓度为1×10

取藻细胞浓度为5×10

取100mL 100％、75％、50％、25％的屠宰废水于250mL锥形瓶中，分别接种30颗青霉菌-栅藻耦合体、10mL藻细胞浓度为5×10

将处理完屠宰废水后的栅藻、青霉菌-栅藻耦合体离心过滤，取沉淀用蒸馏水水冲洗3遍，称取湿菌体重量。每克湿菌体加10mL 4mol/L的盐酸，振荡混匀，室温下处理一定时间，然后沸水浴3-5min，立即置于-20℃速冷。冷却后，加入10mL甲醇，振荡2min混匀，按甲醇:氯仿＝1:1体积比加入10mL氯仿，振荡2min，4000rpm离心20min收集下层氯仿层，再加入等体积的0.15％氯化钠溶液，混匀后4000rpm离心20min，收集下层氯仿层，所有氯仿层溶液用已知重量的接收瓶收集氯仿层，在80～85℃水浴中蒸去氯仿，于105℃烘1h冷却后称重，记录油脂重量，图8为油脂产量统计图。

由图8可知，青霉菌-栅藻耦合体系在处理50％屠宰废水组时油脂产量达到最大，其油脂产量为411.98mg/L，高于单纯实球藻组的354.67mg/L。

实施例9

取15mL实施例6中处理后的100％屠宰废水，分别利用硫酸——重铬酸钾消解体系(GB11914-89)、碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法(HJ636-2012)、钼酸铵分光光度法(GB11893-89)来测定屠宰废水处理前后COD、TN、TP的变化。

将COD、TN、TP结果进行统计，如表3所示。

表3青霉菌耦合栅藻体系对100％屠宰废水中COD、TN、TP的去除率

由表3可知，青霉菌-栅藻耦合体系对屠宰废水的COD、TN、TP的去除率分别达到82.42％、77.65％、56.88％。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。