一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖及其制备方法

技术领域

本发明属于生物制备的技术领域，具体是指一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖及其制备方法。

背景技术

酵母细胞壁是一种天然的绿色食品添加剂，含有多种生物活性物质，由里至外分别为β-葡聚糖、蛋白质和甘露聚糖。其中，β-葡聚糖(即β-1,3-葡聚糖)具有增强细胞免疫力、抗癌、抗肿瘤、抗辐射、控制胆固醇及清除自由基等作用。β-葡聚糖又可以分为水（碱）溶性β-葡聚糖及水（碱）不溶性β-葡聚糖两种。在众多来源的β-葡聚糖中，酵母细胞壁来源的水不溶性β-葡聚糖被证实具有极佳的生物活性，受到了广泛的关注，而啤酒酵母也一直作为安全的模式生物而广泛应用于食品工业和医药工业。

酵母细胞是由细胞壁、细胞膜、液泡和核酸等小分子物质构成，其中细胞壁是获取酵母β-葡聚糖的主要来源。对于传统的细胞壁提取方法，其产物大多是含有未除去氨基酸、蛋白质、细胞器和未被分解完全的细胞的混合物，这些都会影响到细胞壁的纯净度，从而导致酵母β-葡聚糖的制备过程复杂化。在以酵母细胞壁为原料的β-葡聚糖的制备过程中，常见的酸法、酶法、超声波法、高压均质法等提取方法常难以有效的将酵母β-葡聚糖中的蛋白质和脂质去除殆尽，也无法除去残留灰质等不溶性杂质，导致酵母β-葡聚糖产品的纯度较低。如公开号为CN113897294A的专利提供的酵母β-葡聚糖提取方法以啤酒废酵母为原料，工艺繁琐，成本较高，且所得酵母β-葡聚糖的纯度只有92.4%-93.5%。

此外，通常所得的酵母β-葡聚糖由于具有特殊的三维螺旋结构而难溶于水、酸、碱等常用溶剂，分子量巨大，大大降低了酵母β-葡聚糖的利用率。改变酵母来源水不溶性β-葡聚糖为可溶性的传统方法有酸法、酶法、氧化降解法、超声降解法等，通过将多糖长链结构降解为短链，以降低分子量达到可溶的目的。多糖是高分子化合物，其纯品在微观上是不均一的，通常所说的多糖纯品实际是指一定分子量范围内的均一组分。而这些方法的作用条件苛刻，反应过程不易控制，得到的产物分子量较大且分散，其中含有寡糖、双糖以及十几个分子链组成的多糖等，严重影响了酵母β-葡聚糖的分子量排布以及多糖均一度；此外，技术手段相对落后，工艺不成熟，难以满足工业化生产的要求。如公开号为CN101353383A的专利在热水处理、碱处理破碎细胞后对碱提液进行酸中和、高温浸提去除去甘露聚糖，得到水溶性酵母β-葡聚糖，同时对碱提沉淀物酶解、水洗处理，得到非水溶性酵母β-葡聚糖，此方法热水处理的温度最高达121℃，使用大量的酸、碱，不仅会影响产物活性，而且对环境不友好，所得产品的重均分子量高达8-20万Dalton，分子量大且均一度低。

因此，亟需一种将水不溶性酵母β-葡聚糖成功转变为水溶性的同时得到纯度高、分子量小且均一度高的酵母β-葡聚糖的方法，以扩大酵母β-葡聚糖的应用范围。

发明内容

针对背景技术中存在的问题，本发明提出一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖及其制备方法，制得的酵母β-葡聚糖产品的纯度最高达到99.5%，呈洁白丝状，易溶于水，重均分子量在9549-83621Da之间。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）将新鲜的废酵母泥水洗至不含啤酒味，然后过80目筛，得到较干净的酵母细胞；

（2）将每g湿重的步骤（1）的酵母细胞加入到2.5mL含0.04M EDTA和0.14M 2-巯基乙醇的混合溶液中，30℃保温15min，然后3000 r/min离心10min，得到沉淀A；此步骤中，巯基化处理可使酵母细胞发生质壁分离，便于后期裂解酵母细胞并对酵母细胞壁进行分离提取。

（3）将每g沉淀A加入到4mL含有30mg蜗牛酶和1M山梨醇的0.02M柠檬酸-磷酸缓冲液(pH=5.8)中，30℃保温40-60min；蜗牛酶可针对性裂解酵母细胞。

（4）将步骤（3）保温后的溶液6000 r/min离心10min，得沉淀B，将沉淀B以质量体积比1g:1mL加水混匀，得到混悬液；

（5）沿离心管壁依次加入密度为1.62g/mL、1.55g/mL、1.48g/mL和1.41g/mL的密度梯度介质，然后缓缓加入步骤（4）的混悬液于最上层，在水平离心机中3000 r/min密度梯度离心15-20min，以便对发生质壁分离的酵母细胞进行细胞内容物的分离和去除；

（6）吸取梯度离心后的离心管中从上向下数第二个条带的内容物，水洗2次后离心得沉淀C，干燥沉淀C，即得纯净的酵母细胞壁；

（7）向酵母细胞壁中加入体积(单位mL)为酵母细胞壁质量(单位g)的60-80倍的水配制成悬浊液，以50-90℃水浴保温4-8h；

（8）将保温后的悬浊液离心，以去除悬浊液中的甘露聚糖及水溶性蛋白质，得沉淀D，将沉淀D离心洗涤后加入浓度为1%-2%的NaOH溶液，沉淀D与NaOH溶液的质量体积比为1g:(10-30)mL，随后60℃水浴保温2h，离心，以去除碱溶性酵母β-葡聚糖(或称水溶性葡聚糖，该类葡聚糖在本申请转变酵母来源水不溶性β-葡聚糖为可溶性的技术方案中作为杂质存在)，同时进一步去除残留的甘露聚糖、水溶性蛋白质及脂质，得沉淀E；

（9）将沉淀E水洗至中性，然后加入1000 U/g木瓜蛋白酶和900 U/g菠萝蛋白酶，以50℃水浴保温6h，随后加热灭酶，将处理物水洗并冷冻干燥，备用；

（10）向干燥后的处理物中加入二甲基亚砜并加热2h，使处理物溶于二甲基亚砜，然后8000 r/min离心，弃沉淀，收集上层清液；对该上清液进行冷冻干燥，即可得到水（碱）不溶性酵母β-葡聚糖。

（11）向步骤（10）的上层清液中加入乙醇，乙醇的体积为上层清液体积的5倍，静置后6000 r/min离心，弃去上层乙醇溶液，得沉淀F；

（12）将沉淀F加蒸馏水溶解，随后进行减压浓缩，收集浓缩液；

（13）将浓缩液进行冷冻干燥，即得高纯度水溶性酵母β-葡聚糖。

优选地，所述步骤（5）中密度梯度介质与混悬液的体积比均为 4:1；密度梯度介质为蔗糖、氯化艳或氯化钠中的任一种；

更为优选地，所述步骤（5）中使用的密度梯度介质为蔗糖。

优选地，所述步骤（10）中处理物与二甲基亚砜的质量体积比为1mg:0.2mL；二甲基亚砜的体积分数为50%-90%，溶解的温度为60-80℃。

更为优选地，所述步骤（10）中二甲基亚砜的体积分数为90%，溶解的温度为70℃。

优选地，所述步骤（11）中乙醇的浓度为40-100%；静置的时间为0.5-36h。

更为优选地，所述步骤（11）中乙醇的浓度为60%；静置的时间为36h。

本发明还包括上述方法制备的高纯度水溶性酵母β-葡聚糖。

优选地，所述高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的纯度最高为99.5%，重均分子量在9549-83621Da之间。

本发明的有益效果：

1. 本方法以废酵母泥为原料，先提取得到水不溶性酵母β-葡聚糖，再将其不溶性转变为水溶性，最终制得高纯度水溶性酵母β-葡聚糖。本方法通过使用巯基化处理使酵母细胞发生质壁分离（如图2），在此基础上采用蜗牛酶针对性地裂解酵母细胞，并通过密度梯度离心对发生质壁分离的酵母细胞进行细胞内容物的去除，避免了使用超声、自溶等手段破碎细胞造成的细胞内部蛋白质、核酸物质与细胞壁碎片紧密缠绕而难以除去的状况。该分离过程简单高效且对设备要求不高。

2、本方法采用低温(50-90℃<100℃)水浴对酵母细胞壁中的甘露聚糖进行去除，避免了产业化时常规高温提取(>100℃)导致的安全问题及能源问题，在去除大量甘露聚糖的同时，也节约了成本。本发明不使用酸，使用少量浓度仅1%-2%的碱即可轻松去除水提时残余的甘露聚糖和水溶性的蛋白质及脂质，并且在低碱浓度(<2%)条件下，经[苯酚硫酸法]检测提取液，可以检测到除去水溶性酵母β-葡聚糖的效果明显。一方面降低了生产成本、污染小、对环境较为友好，另一方面也降低了酸、碱对酵母β-葡聚糖结构造成的破坏。

3、本发明在酶法去除蛋白的基础上采用二甲基亚砜辅助纯化。酵母细胞壁是由甘露聚糖—蛋白质—β-葡聚糖形成致密的镶嵌结构。已有文献表明，经过多种方法纯化得到的β-葡聚糖产物，纯度只有80-90%，其中仍含有杂质和蛋白质，可能原因是部分蛋白质与多糖的紧密连接结构导致酶法不能降解；而本发明利用二甲基亚砜可溶解水不溶性酵母β-葡聚糖的性质提取酵母β-葡聚糖，离心后，其他不溶物成为沉淀。这样就能去除不能溶解的绝大部分蛋白质和原料中掺杂的灰质，相比只通过水提、碱提、酶解这三步，产品的纯度得到了明显提升。并且，所用的二甲亚砜可通过冷冻干燥机回收后再次循环利用，有效提高了试剂利用率，降低工艺成本。

4、本发明以废酵母泥为原料，成本低廉且容易获得，具有废物利用的社会效益，利用二甲基亚砜辅助纯化样品有效去除前述步骤所得样品中94.60%的杂质，并结合乙醇提取，最终得到高纯度水溶性酵母β-葡聚糖产品，其水不溶性到水溶性的转化率最高为42.86%，纯度最高为99.5%，重均分子量在9549-83621Da之间，分子量低且相对均一，不仅提高了酵母β-葡聚糖的利用率，一定程度上也促进了酵母β-葡聚糖溶解度的提高，所得的酵母β-葡聚糖溶解度较好，可在常温下溶于水、酸、碱等溶剂；现有方法提取的酵母β-葡聚糖产品中大都含有多种分子量的酵母β-葡聚糖，而本发明可得到分子量单一的酵母β-葡聚糖产品。此外，该酵母β-葡聚糖在转化为水溶性后仍具有较好的生物活性，例如在细胞炎症反应中能够有效降低IL-1β和IL-6的mRNA相对表达量，从而有效清除炎症因子，具有一定的抗炎效果。

5、本发明的制备方法步骤简便、操作性高、原料经济、成本低廉、所用试剂均可回收再利用，绿色环保，成功制得了分子量低、纯度高且在常温下溶于多种试剂的酵母β-葡聚糖产品，过程简单，操作性高，制备成本低，为扩大酵母β-葡聚糖的应用范围提供了有效参考，适合工业化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中密度梯度离心后的梯度区带图。

图2为实施例2中酵母细胞(a)、质壁分离细胞(b)和酵母细胞壁(c)的光学显微图。

图3为实施例2中二甲基亚砜处理前的干燥样品(a)、二甲基亚砜处理后的干燥样品(b)及利用二甲基亚砜去除的杂质(c)的对比图。

图4为实施例2中高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的外观图。

图5为实施例2中高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的傅里叶红外光谱图。

图6为实施例2中高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的薄层色谱图，其中，a为葡萄糖标准品，b为甘露糖标准品，c为该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖。

图7为实施例2中高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的重均分子量图。

图8为实施例2中LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞４种炎症因子mRNA相对表达量。

图9为实施例1-5的高纯度水溶性酵母β-葡聚糖重均分子量大小对溶解度的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）对新鲜废酵母泥进行水洗至不含啤酒味，过80目筛，得到较干净的酵母细胞；

（2）称取湿重4g步骤（1）的酵母细胞加入到10mL含0.04M EDTA和0.14M 2-巯基乙醇的混合溶液中，30℃保温15min，然后3000 r/min离心10min，得到沉淀A；

（3）取4g沉淀A加入到16mL含有120mg蜗牛酶和1M山梨醇的0.02M柠檬酸-磷酸缓冲液(pH=5.8)中，在30℃保温40min；

（4）将步骤（3）保温后的溶液6000 r/min离心10min，得沉淀B，将沉淀B以质量体积比1g:1mL加水混匀，得到混悬液；

（5）沿离心管壁依次加入密度为1.62、1.55、1.48、1.41 g/mL的氯化铯溶液作为密度梯度介质，再缓缓加入步骤（4）混悬液于最上层，其中密度梯度介质与混悬液的体积比均为4:1，在水平离心机中3000 r/min密度梯度离心20min；

（6）如图1所示，吸取离心后的离心管中从上向下数第二条带内容物，水洗2次后离心得沉淀C，干燥沉淀C，即得纯净的干燥酵母细胞壁；

（7）取干燥酵母细胞壁20g，向其中加入体积为酵母细胞壁质量的80倍的水配制成悬浊液，70℃水浴保温6 h；

（8）将保温后的悬浊液6000 r/min离心10min并去除上清，得沉淀D，将沉淀D离心洗涤3次，然后加入浓度为1.5%的NaOH溶液，其中沉淀D与NaOH溶液的质量体积比为1g:15mL，随后60℃水浴振荡保温2h，6000 r/min离心10min，弃去暗红色上层液，得沉淀E；

（9）将沉淀E水洗至中性，然后加入1000 U/g木瓜蛋白酶和900 U/g菠萝蛋白酶50℃水浴保温6h，随后加热灭酶，将处理物水洗并冷冻干燥，备用；

（10）取50 mg干燥后的处理物，向其中加入10 mL体积分数为50%的二甲基亚砜，60℃加热溶解2h，然后8000 r/min高速离心10min，弃去灰褐色杂质沉淀，收集上层清液；

（11）向上层清液中加入浓度为40%的乙醇，乙醇的体积为上层清液体积的5倍，静置0.5h后，6000 r/min离心，弃去上层乙醇溶液，得沉淀F；

（12）再将沉淀F加入蒸馏水溶解，随后进行减压浓缩，收集浓缩液；

（13）将浓缩液在-72℃、7Pa条件下进行冷冻干燥，即得高纯度水溶性酵母β-葡聚糖。

以血球计数法检测细胞壁提取效果，测得细胞壁提取率为98.2%；采用苯酚硫酸法测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的溶解度 (即酵母β-葡聚糖从水不溶性到水溶性的转化率)为36.2%；利用刚果红法测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的纯度为95.84%；另外，测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的重均分子量为83621Da。

实施例2

一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）对新鲜废酵母泥进行水洗至不含啤酒味，过80目筛，得到较干净的酵母细胞；

（2）称取湿重4g步骤（1）的酵母细胞加入到10mL含0.04M EDTA和0.14M 2-巯基乙醇的混合溶液中，30℃保温15min，然后3000 r/min离心10min，得到沉淀A；图2a为巯基化处理前正常酵母细胞的光学照片，图2b为巯基化处理后酵母细胞发生质壁分离的光学照片，可见巯基化处理成功使正常的酵母细胞发生了质壁分离。

（3）取4g沉淀A加入到16mL含有120mg蜗牛酶和1M山梨醇的0.02M柠檬酸-磷酸缓冲液(pH=5.8)中，在30℃保温40min；

（4）将步骤（3）保温后的溶液6000 r/min离心10min，得沉淀B，将沉淀B以质量体积比1g:1mL加水混匀，得到混悬液；

（5）沿离心管壁依次加入密度为1.62、1.55、1.48、1.41 g/mL的蔗糖溶液作为密度梯度介质，再缓缓加入步骤（4）混悬液于最上层，其中密度梯度介质与混悬液的体积比均为4:1，在水平离心机中3000 r/min密度梯度离心20min；

（6）吸取离心后的离心管中从上向下数第二条带内容物，水洗2次后离心得沉淀C，干燥沉淀C，即得纯净的干燥酵母细胞壁，图2c为所得酵母细胞壁的光学显微镜镜检结果，由图可知，几乎所有的酵母细胞被裂解，剩下完整或半完整的细胞壁。

（7）称取干燥酵母细胞壁20g，向其中加入体积为酵母细胞壁质量的70倍的水配制成悬浊液，90℃水浴保温8h；

（8）将保温后的悬浊液6000 r/min离心10min并去除上清，得沉淀D，将沉淀D离心洗涤3次，然后加入浓度为1.5%的NaOH溶液，其中沉淀D与NaOH溶液的质量体积比为1g:15mL，随后60℃水浴振荡保温2h，6000 r/min离心10min，弃去暗红色上层液，得沉淀E。

此时，以质量体积比为1g:15mL向沉淀E中加入1.5% 的NaOH溶液，然后60℃水浴振荡保温2h并6000 r/min离心10min，收集上清液，以[苯酚硫酸法]检测该上清液，结果为无紫外吸收，说明该上清液中不含糖，表明水溶性酵母β-葡聚糖已被完全去除，沉淀E中不含有水溶性酵母β-葡聚糖。

（9）将沉淀E水洗至中性，然后加入1000 U/g木瓜蛋白酶和900 U/g菠萝蛋白酶50℃水浴保温6h，随后加热灭酶，将处理物水洗并冷冻干燥，备用；

（10）取50 mg干燥后的处理物，向其中加入10 mL体积分数为50%的二甲基亚砜，70℃加热溶解2h，然后8000 r/min高速离心10min，弃去灰褐色杂质沉淀，收集上层清液；对该上清液进行冷冻干燥，即可得到如图3b所示的不溶性酵母β-葡聚糖。

（11）向上层清液中加入浓度为60%的乙醇，乙醇的体积为上层清液体积的5倍，静置36h，然后6000 r/min离心，弃去上层乙醇溶液，得沉淀F；

（12）再将沉淀F加入蒸馏水溶解，随后进行减压浓缩，收集浓缩液；

（13）将浓缩液在-72℃、7Pa条件下进行冷冻干燥，即得如图3所示的高纯度水溶性酵母β-葡聚糖，由图4可知，该酵母β-葡聚糖的外观呈洁白丝状。

①酵母细胞壁产率测定

采用细胞计数法对酵母细胞裂解后得到的酵母细胞壁进行测定：

酵母细胞壁产率=1-(处理后菌体个数/处理前菌体个数)=99.5%。

②二甲基亚砜纯化效果测定：

图3a为二甲基亚砜处理前的干燥样品(即步骤（3）中干燥后的处理物)，图3b为二甲基亚砜处理后的干燥样品(即步骤（4）中上层清液经冷冻干燥所得的不溶性酵母β-葡聚糖)，图3c为二甲基亚砜处理中所去除的杂质，对比图3a-c可知，二甲基亚砜明显去除了样品中大部分有色杂质，使得样品的颜色更加白净。

进一步测定本方法中二甲基亚砜去除杂质的效果，具体为：称量二甲基亚砜处理中所去除的杂质的质量，并利用刚果红法检测二甲基亚砜处理前的干燥样品(即步骤（3）中干燥后的处理物)中杂质的含量，各重复测定三次后取平均值，对应记为M

除杂率=(M

由上式结果可知，本实施例利用二甲基亚砜辅助纯化去除了样品中94.60%的杂质。

使用凯氏定氮法检测杂质成分，结果显示杂质中87.3%为蛋白质，余下12.7%可能为脂质或者灰质。

③物质鉴定及理化性质分析：

采用傅里叶红外光谱对本实施例制得的高纯度水溶性酵母β-葡聚糖进行物质鉴定，结果如图5所示。图5中，在3392.96cm

利用薄层色谱法测定该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖产品的单糖组成，结果如图6所示，图中a为葡萄糖标准品，b为甘露糖标准品，c为本产品，可见该产品的单糖组成为葡萄糖，进一步判定该产品为由葡萄糖单糖聚合而成的葡聚糖。

对该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的物理性质进行分析，结果如表1所示。

表1 物理性质分析

注：“+”代表可溶，“-”代表不可溶。

由表1可知，该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖在常温下可溶于水、酸和碱等常用溶剂。

④纯度及溶解率测定：

利用刚果红法测定该酵母β-葡聚糖的纯度，具体为：称取一定量本实施例制备的酵母β-葡聚糖作为样品，用pH 7.5的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液溶解后与0.01%的刚果红溶液进行反应，然后测定吸光度；以不加样品作为对照，测定吸光度，求得标准方程。将所得吸光值代入标准方程，求得样品中酵母β-葡聚糖的含量，代入如下公式，求得酵母β-葡聚糖的纯度：

酵母β-葡聚糖的纯度=(含量值/称量值)×100%=99.5%。

运用半常量元素分析仪进行元素分析，测得该酵母β-葡聚糖产品中N元素的含量为0.41%；采用苯酚硫酸法测得该酵母β-葡聚糖的水溶性溶解度(即转化率)为42.86%，使用公式如下：

溶解度=(测定值/称量值)×100%。

⑤重均分子量

使用高效液相色谱仪（排阻色谱柱、示差检测器）对该低酵母β-葡聚糖进行分子量排布测定，结果如图7所示。由图7可知，该酵母β-葡聚糖中存在有重均分子量分别为31622Da和9549Da的酵母β-葡聚糖分子。

⑥抗炎症活性：

将处于对数生长期的RAW264.7细胞(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)消化，离心后用DMEM完全培养基(含10%血清和1%双抗)重悬，以1×10

⑦试剂回收：

将步骤（10）离心后的上层清液进行冷冻干燥，使得二甲基亚砜经过物理状态变化暂留于冻干机中，冻干结束后，二甲基亚砜即可从排液口放出，收集放出的二甲基亚砜，即可继续重复利用。

实施例3

一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）对新鲜废酵母泥进行水洗至不含啤酒味，过80目筛，得到较干净的酵母细胞；

（2）称取湿重4g步骤（1）的酵母细胞加入到10mL含0.04M EDTA和0.14M 2-巯基乙醇的混合溶液中，30℃保温15min，然后3000 r/min离心10min，得到沉淀A。

（3）取4g沉淀A加入到16mL含有120mg蜗牛酶和1M山梨醇的0.02M柠檬酸-磷酸缓冲液(pH=5.8)中，在30℃保温40min；

（4）将步骤（3）保温后的溶液6000 r/min离心10min，得沉淀B，将沉淀B以质量体积比1g:1mL加水混匀，得到混悬液；

（5）沿离心管壁依次加入密度为1.62、1.55、1.48、1.41 g/mL的氯化钠溶液作为密度梯度介质，再缓缓加入步骤（4）混悬液于最上层，其中密度梯度介质与混悬液的体积比均为4:1，在水平离心机中3000 r/min密度梯度离心20min；

（6）吸取离心后的离心管中从上向下数第二条带内容物，水洗2次后离心得沉淀C，干燥沉淀C，即得纯净的干燥酵母细胞壁；

（7）称取干燥酵母细胞壁20g，向其中加入体积为酵母细胞壁质量的60倍的水配制成悬浊液，50℃水浴保温4h；

（8）将保温后的悬浊液6000 r/min离心10min并去除上清，得沉淀D，将沉淀D离心洗涤3次，然后加入浓度为1.5%的NaOH溶液，其中沉淀D与NaOH溶液的质量体积比为1g:15mL，随后60℃水浴振荡保温2h，6000 r/min离心10min，弃去暗红色上层液，得沉淀E；

（9）将沉淀E水洗至中性，然后加入1000 U/g木瓜蛋白酶和900 U/g菠萝蛋白酶50℃水浴保温6h，随后加热灭酶，将处理物水洗并冷冻干燥，备用；

（10）取50 mg干燥后的处理物，向其中加入10 mL体积分数为50%的二甲基亚砜，80℃加热溶解2h，然后8000 r/min高速离心10min，弃去灰褐色杂质沉淀，收集上层清液；

（11）向上层清液中加入浓度为100%的乙醇，乙醇的体积为上层清液体积的5倍，静置12 h，然后6000 r/min离心，弃去上层乙醇溶液，得沉淀F；

（12）再将沉淀F加入蒸馏水溶解，随后进行减压浓缩，收集浓缩液；

（13）将浓缩液在-72℃、7Pa条件下进行冷冻干燥，即得高纯度水溶性酵母β-葡聚糖。

以血球计数法检测细胞壁提取效果，测得本实施例中酵母细胞壁的提取率为97.8%；采用苯酚硫酸法测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的溶解度 (即转化率)为39.84%；利用事先配制好的刚果红试剂测得该水溶性酵母β-葡聚糖的纯度为92.58%；另外，测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的重均分子量为60963Da和20264Da。

实施例4

一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）对新鲜废酵母泥进行水洗至不含啤酒味，过80目筛，得到较干净的酵母细胞；

（2）称取湿重4 g步骤（1）的酵母细胞加入到10 mL含0.04M EDTA和0.14M 2-巯基乙醇的混合溶液中，30℃保温15min，然后3000 r/min离心10min，得到沉淀A。

（3）取4g沉淀A加入到16mL含有120mg蜗牛酶和1M山梨醇的0.02M柠檬酸-磷酸缓冲液(pH=5.8)中，在30℃保温50min；

（4）将步骤（3）保温后的溶液6000 r/min离心10min，得沉淀B，将沉淀B以质量体积比1g:1mL加水混匀，得到混悬液；

（5）沿离心管壁依次加入密度为1.62、1.55、1.48、1.41 g/mL的氯化铯溶液作为密度梯度介质，再缓缓加入步骤（4）混悬液于最上层，其中密度梯度介质与混悬液的体积比均为4:1，在水平离心机中3000 r/min密度梯度离心20min；

（6）吸取离心后的离心管中从上向下数第二条带内容物，水洗2次后离心得沉淀C，干燥沉淀C，即得纯净的干燥酵母细胞壁；

（7）取干燥酵母细胞壁20g，向其中加入体积为酵母细胞壁质量的80倍的水配制成悬浊液，70℃水浴保温6 h；

（8）将保温后的悬浊液6000 r/min离心10min并去除上清，得沉淀D，将沉淀D离心洗涤3次，然后加入浓度为1%的NaOH溶液，其中沉淀D与NaOH溶液的质量体积比为1g:10mL，随后60℃水浴振荡保温2h，6000 r/min离心10min，弃去暗红色上层液，得沉淀E；

（9）将沉淀E水洗至中性，然后加入1000 U/g木瓜蛋白酶和900 U/g菠萝蛋白酶50℃水浴保温6h，随后加热灭酶，将处理物水洗并冷冻干燥，备用；

（10）取50 mg干燥后的处理物，向其中加入10 mL体积分数为50%的二甲基亚砜，60℃加热溶解2h，然后8000 r/min高速离心10min，弃去灰褐色杂质沉淀，收集上层清液；

（11）向上层清液中加入浓度为40%的乙醇，乙醇的体积为上层清液体积的5倍，静置36h后，6000 r/min离心，弃去上层乙醇溶液，得沉淀F；

（12）再将沉淀F加入蒸馏水溶解，随后进行减压浓缩，收集浓缩液；

（13）将浓缩液在-72℃、7Pa条件下进行冷冻干燥，即得高纯度水溶性酵母β-葡聚糖。

以血球计数法检测细胞壁提取效果，测得细胞壁提取率为96.5%；采用苯酚硫酸法测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的溶解度 (即转化率)为41.73%；利用刚果红法测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的纯度为94.36%；另外，测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的重均分子量为40369Da。

实施例5

一种高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的制备方法，包括以下步骤：

（1）对新鲜废酵母泥进行水洗至不含啤酒味，过80目筛，得到较干净的酵母细胞；

（2）称取湿重4 g步骤（1）的酵母细胞加入到10 mL含0.04M EDTA和0.14M 2-巯基乙醇的混合溶液中，30℃保温15min，然后3000r/min离心10min，得到沉淀A。

（3）取4g沉淀A加入到16mL含有120mg蜗牛酶和1M山梨醇的0.02M柠檬酸-磷酸缓冲液(pH=5.8)中，在30℃保温60min；

（4）将步骤（3）保温后的溶液6000 r/min离心10min，得沉淀B，将沉淀B以质量体积比1g:1mL加水混匀，得到混悬液；

（5）沿离心管壁依次加入密度为1.62、1.55、1.48、1.41 g/mL的氯化铯溶液作为密度梯度介质，再缓缓加入步骤（4）混悬液于最上层，其中密度梯度介质与混悬液的体积比均为4:1，在水平离心机中3000 r/min密度梯度离心20min；

（6）吸取离心后的离心管中从上向下数第二条带内容物，水洗2次后离心得沉淀C，干燥沉淀C，即得纯净的干燥酵母细胞壁；

（7）取干燥酵母细胞壁20g，向其中加入体积为酵母细胞壁质量的80倍的水配制成悬浊液，70℃水浴保温6 h；

（8）将保温后的悬浊液6000 r/min离心10min并去除上清，得沉淀D，将沉淀D离心洗涤3次，然后加入浓度为2%的NaOH溶液，其中沉淀D与NaOH溶液的质量体积比为1g:30mL，随后60℃水浴振荡保温2h，6000 r/min离心10min，弃去暗红色上层液，得沉淀E；

（9）将沉淀E水洗至中性，然后加入1000 U/g木瓜蛋白酶和900 U/g菠萝蛋白酶50℃水浴保温6h，随后加热灭酶，将处理物水洗并冷冻干燥，备用；

（10）取50 mg干燥后的处理物，向其中加入10 mL体积分数为50%的二甲基亚砜，60℃加热溶解2h，然后8000 r/min高速离心10min，弃去灰褐色杂质沉淀，收集上层清液；

（11）向上层清液中加入浓度为80%的乙醇，乙醇的体积为上层清液体积的5倍，静置24h后，6000 r/min离心，弃去上层乙醇溶液，得沉淀F；

（12）再将沉淀F加入蒸馏水溶解，随后进行减压浓缩，收集浓缩液；

（13）将浓缩液在-72℃、7Pa条件下进行冷冻干燥，即得高纯度水溶性酵母β-葡聚糖。

以血球计数法检测细胞壁提取效果，测得细胞壁提取率为97.4%；采用苯酚硫酸法测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的溶解度 (即转化率)为40.52%；利用刚果红法测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的纯度为95.23%；另外，测得该高纯度水溶性酵母β-葡聚糖的重均分子量为53108Da。

对于实施例1-5制备的高纯度水溶性酵母β-葡聚糖，其溶解度与重均分子量的对应关系如表2所示，重均分子量大小对溶解度的影响如图9所示。

表2 溶解度与重均分子量的对应关系

由表2及图9可知，随着本发明酵母β-葡聚糖产品的重均分子量逐渐增大，其溶解度呈降低趋势。说明酵母β-葡聚糖的溶解度可能与重均分子量大小存在一定的关系。这也与文献[酵母β-葡聚糖溶解性与乳化性改善及应用研究]报道的一致。而本发明制备的酵母β-葡聚糖的重均分子量普遍较小且均一度较高，不仅提高了酵母β-葡聚糖的利用率，一定程度上也促进了酵母β-葡聚糖溶解度的提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。