一种基于叶绿体基因组微卫星的分子标记及鉴定核桃种质及其亲缘关系的方法

技术领域

本发明属于SSR分子标记技术领域，具体涉及一种基于叶绿体基因组微卫星的SSR分子标记、试剂盒及基于所述SSR指纹图谱鉴定核桃属种间杂交种质及其亲缘关系的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

核桃20世纪30年代开始我国陆续引入心形核桃(Juglans cordiformis)、吉宝核桃(Juglans sieboldiana)以及核桃属黑核桃组的东部黑核桃(Juglans nigra)、魁核桃(Juglans najor)、北加州黑核桃(Juglans hindsii)、小果黑核桃(Juglans microcapa)等。我国科研工作者利用丰富的核桃种质资源深入开展核桃属种间和种内杂交育种，在早实、丰产、速生和抗病核桃良种选育方面取得了显著成效。黑核桃，具有极高经济价值，重要的用材型和果材兼用型树种，也是城乡绿化树种之一，具有耐寒、耐旱、抗盐碱、抗病虫害等特性。黑核桃作为果材兼用的优势树种之一，其木材结构极为紧密，耐压及抗震能力极强，力学强度极高，色泽光鲜亮丽、纹理清晰美观，是现代高档家具、建筑装饰和工艺雕刻的理想型选材之一。

杂交所得到的的杂种一代往往比它的双亲表现更强大的生长速率和代谢功能，从而导致器官发达、体型增大、产量提高，或者表现在抗病、抗虫、抗逆性、成活力、生殖力、生存力等的提高。种间杂交属于远缘杂交，但交配不易成功。黑核桃种间杂交后代表现优异，分析其遗传背景和亲缘关系有助于进一步提高育种效率。

核桃属植物为异花授粉植物，长期的人工选择杂交以及同域分布导致的自然杂交导致核桃属植物的遗传背景比较复杂，仅通过形态学分类方法难以确定其真实的生物学特性。因此，有必要探索更有效的方法来进行识别。SSR(简单重复序列标记)分子标记根据高度保守序列设计引物，进一步合成荧光引物，进行PCR扩增，毛细管电泳等方式实现规模化检测，该标记属于共显性标记，呈孟德尔遗传，技术重复性好，易于操作，准确可靠。

叶绿体基因组包含丰富的遗传信息，但结构、大小非常保守，遗传稳定性高，基于此叶绿体基因组结构和序列的信息在揭示物种起源、进化演变和亲缘关系等方面具有重要价值。

核桃属种内品种的鉴定在AFLP、SSR等分子标记在普通核桃种内应用较多，而黑核桃组各种间的鉴定和黑核桃杂交种的鉴定较少有报道。高玉娜(2011)等以黑核桃、核桃楸、普通核桃为试验材料，发现黑核桃微卫星在核桃近缘种中能得到有效扩增，可以用于近缘种遗传多样性分析和核桃属种间关系研究。陈玲娜(2011)利用SSR方法构建了35个普通核桃主栽品种的指纹图谱，周于波也利用SSR分子标记构建了29个四川核桃良种的指纹图谱。随着种间杂交技术的进步，核桃种间杂交种质越来越多，但研究相对较少，上述SSR引物尚未应用于黑核桃与普通核桃杂交种和亲缘关系的鉴定。

发明内容

基于上述技术背景，本发明目的在于提供一种可用于黑核桃与普通核桃杂交种和亲缘关系的鉴定的SSR分子标记。基于该目的，本发明以植物组织叶绿体基因组作为筛选对象，获得了具有良好鉴别效果的SSR分子标记。

本发明第一方面，提供一种基于叶绿体基因组微卫星的SSR分子标记，所述核桃品种为东部黑核桃(Juglans nigra)、魁核桃(Juglans major)、北加州黑核桃(Juglanshindsii)、小果黑核桃(Juglans microcapa)和核桃(Juglans regia)，所述SSR分子标记包括SSR-P8和SSR-P9，其中，SSR-P8通过SEQ ID NO:1-2所示序列的引物扩增得到，SSR-P9通过SEQ ID NO:3-4所示序列的引物扩增得到，所述扩增对象为叶绿体基因组。

本发明第二方面，提供含有SEQ ID NO:1-4所述引物的试剂盒。

优选的，所述试剂盒中还包括PCR扩增体系，至少包括缓冲液、dNTP、DNA聚合酶及ddH

本发明第三方面，提供SEQ ID NO:1-4所述序列的引物、第一方面所述SSR分子标记、第二方面所述试剂盒在以下任意一个方面的应用：

(1)用于核桃种质资源遗传多样性分析或种子质量的鉴别；

(2)用于核桃品种鉴定、亲缘关系分析或母系溯源中的应用；

(3)用于核桃遗传图谱或指纹图谱的建立。

本发明第四方面，提供一种黑核桃和普通核桃种的SSR指纹图谱构建方法，所述黑核桃为东部黑核桃(Juglans nigra)、魁核桃(Juglans major)、北加州黑核桃(Juglanshindsii)、小果黑核桃(Juglans microcapa)，所述指纹图谱构建方法包括以下步骤：

提取待鉴别核桃的叶绿体基因组，采用SEQ ID NO:1-4所述引物或上述第二方面所述试剂盒进行PCR扩增，将PCR扩增产物通过电泳分离并检测，构建上述核桃品种的SSR指纹图谱。

本发明基于上述SSR-P8和SSR-P9构建的SSR指纹图谱如下表所示：

优选的，所述叶绿体基因组的提取方法可基于本领域常规方式实现，例如通过市售试剂盒进行提取，本发明验证的一种实施方式中，所述叶绿体基因组采用改良CTAB法进行提取。

优选的，所述PCR扩增程序如下：92～96℃预变性3～6min；92～96℃变性30s，50～55℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，70～74℃延伸40S，共30～35个循环；最终70～74℃延伸3min。

优选的，所述电泳分离方式包括但不限于琼脂糖凝胶电泳检测、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳。

本发明第五方面，提供一种黑核桃和普通核桃的品种鉴别方法，所述鉴别方法包括按照第四方面所述方法建立待鉴别核桃品种的SSR指纹图谱，并依据SSR-P8和SSR-P9两种DNA片段信息对核桃品种进行鉴别。

本发明第六方面，提供一种黑核桃、普通核桃杂交后代的亲缘关系鉴定方法，所述鉴定方法包括按照第四方面所述方法建立待鉴别品种的SSR指纹图谱，所述杂交种的SSR指纹图谱与母本一致。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

1、本发明提供的SSR分子标记基于植物的叶绿体基因组进行扩增得到，由于叶绿体基因组属于保守度较高的序列，本发明提供的SSR分子标记相应的也具有良好的鉴别效果。

2、针对东部黑核桃(Juglans nigra)、魁核桃(Juglans major)、北加州黑核桃(Juglans hindsii)、小果黑核桃(Juglans microcapa)和核桃(Juglans regia)核桃属5个种及种间杂交种的鉴别，本发明提供了两组SSR分子标记，结合上述两组SSR分子标记同时进行鉴别即可对上述核桃属5个种进行区分，扩增成本更低，检测速度更快。

3、针对种间杂交获得的杂交种质亲缘关系不明问题，本发明提供黑核桃、普通核桃杂交后代的亲缘关系鉴定方法，可鉴别出杂交种质母本，鉴定结果高效，准确。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为东部黑核桃(Juglans nigra)、魁核桃(Juglans major)、北加州黑核桃(Juglans hindsii)、小果黑核桃(Juglans microcapa)和核桃(Juglans regia)对应的峰值。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1引物获得方法

以父母本明确的黑核桃和普通核桃远缘杂交的杂交种为材料提取叶绿体基因组：

1、植物组织总DNA提取

采用改良CTAB法进行叶绿体基因组DNA提取。

2、基因组DNA质量和浓度检测

提取后通过1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，Qubit 3.0(Thermo FisherScientific,USA)荧光定量仪检测浓度。

3、基因测序

质检合格后，利用Illumina HiSeq X Ten平台进行双端测序，测序读长为150bp，测序深度5G。

4、叶绿体基因组序列组装和注释

获得测序原始数据(Raw Data)后，利用Trimmomatic.软件过滤掉原始数据中的低质量序列，获得有效数据(Clean Data)。以NCBI公布的核桃叶绿体基因组为参照(NC_028617)，从获得Clean Data中提取叶绿体基因组的序列，通过ABySS v2.1.5软件进行组装，Kmer Size设置为127；组装完成的叶绿体基因组使用Plann 1.1.2软件，基于参考基因组进行基因注释，注释结果使用Apollo v2.3.1软件进行和随和手工校正。利用OGDRAW工具，标注清楚叶绿体基因组的IR(InvertedRepeat Region)、LSC(Large Single Copy-Region)和SSC(Small Single Copy-Region)的位置，生成注释完整的环状叶绿体基因组物理图谱。

5、叶绿体基因组重复序列结构分析

通过REPuter软件进行散在重复序列的分析，鉴定基因组中的正向、反向、互补和回文重复序，设定参数：Hamming distance＝3(序列的一致性≥90％)，重复碱基单元n≥30bp；使用MISA软件极性简单重复序列(Simple Sequence Repeats，SSR)的预测，其参数设置：最小SSR序列长度为10bp，单核苷酸到六核苷酸的最小重复次数阈值依次设定为10、5、4、3、3和3。

6、设计引物并合成。

基于上述步骤5初选出SSR序列，并利用Primer3软件设计引物并合成，PCR扩增之后产物经1％琼脂糖电泳检测扩增情况，扩增良好的产物进行后续实验。

7、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

基于上述步骤6扩增良好的产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，筛选多态性明显的引物并初步统计扩增片段的大小，以便于进行下一步毛细管电泳荧光引物组合。

8、荧光毛细管电泳检测

通过凝胶电泳验证，步骤7中设计引物中有两对引物多态性较好，进行毛细管电泳。将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取15uL加入上样板中，再加入1uL稀释10倍的PCR产物，然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，获得样品的指纹图谱。两对引物组合之后可精确区分东部黑核桃(Juglans nigra)、魁核桃(Juglans major)、北加州黑核桃(Juglans hindsii)、小果黑核桃(Juglans microcapa)和核桃(Juglans regia)5个种，引物序列如下表1所示：

表1

本实施例基于表1中引物建立了东部黑核桃(Juglans nigra)、魁核桃(Juglansmajor)、北加州黑核桃(Juglans hindsii)、小果黑核桃(Juglans microcapa)和核桃(Juglans regia)5个种的指纹图谱：

表2

根据上述引物构建的指纹图谱中，杂交种指纹图谱与母本一致，可根据上述指纹图谱的多态性结果对黑核桃的杂交后代进行亲缘关系鉴定。

实施例2

分别选择东部黑核桃、北加州黑核桃、魁核桃、小果黑核桃种质各3份，杂交种(J.nigra×J.regia)和杂交种(J.major×J.regia)种质各50份，杂交种质样本母本明确，利用P8、P9引物对112份种质进行毛细管电泳，具体步骤如下：

1、DNA提取

采用改良CTAB法对收集的112份核桃属种质叶片提取基因组DNA。

1)在65℃水浴锅中预热CTAB提取液；

2)在液氮中迅速研磨样品，将粉末状材料转入2mL离心管中，加入预热的CTAB提取液(每克样品加入3～5ml的提取液)，65℃保温30–60min，每隔10min轻轻颠倒混匀；

3)11000rpm条件下离心5min，取上清转入新离心管；

4)加入等体积酚/氯仿(1∶1)，充分混匀，11000rpm离心10min，取上清转入新离心管；

5)加入等体积氯仿，充分混匀，11000rpm离心10min，取上清转入新离心管；

6)重复步骤4，5；

7)加入2/3体积的异丙醇混匀，室温放置，沉淀15min；

8)11000rpm条件下离心6min，弃上清；

9)将沉淀用70％的乙醇漂洗一次，室温条件下11000rpm离心2min，弃上清，重复洗一次；

10)往沉淀中加入40ul 1xTE溶液(已灭菌的)，先混匀，再静置30min，中间过程颠倒混匀1-2次。

11)提取产物取2-3μL用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测，其余置于-20℃保存备用。

2、利用筛选出的2对引物cpSSR-P8，cpSSR-P9对供试样品进行PCR扩增

1)PCR反应体系：

SSR引物体系(共20ul)：ddH

2)PCR反应采用如下循环参数：

SSR PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30S，54℃(退火温度在54℃上下波动)复性35s，72℃延伸40S，共35个循环；最终72℃延伸3min。

3、琼脂糖凝胶电泳检测

取PCR产物3μl在1％琼脂糖凝胶电泳中检测，选取扩增效果好的进行后续PAGE检测。

4、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

1)组装玻璃板

用洗洁精充分洗净玻璃板并沥干。将短玻璃板擦两遍亲和硅烷，长玻璃板上擦一遍剥离硅烷，玻璃板两边放上边条，将二块玻璃板叠放整齐，下缘平齐，用夹子夹好两边后固定在底座上。插入配套梳子，在梳子下缘1～2厘米处划线，指示灌胶位置。拔去梳子。

2)配制、灌制分离胶和浓缩胶

取75ml 5％丙烯酰胺凝胶在30℃温水中孵育，加入80μl TEMED，160μl过硫酸氨，搅匀，注入两块玻璃板内，检查是否有气泡，插入梳子，夹上夹子，放一个小时以上，至胶凝固。

3)样品处理

将初步挑选出来的PCR产物取4μl，加入4×loading buffer，混匀。95℃或沸水浴5min变性，后立即放到冰里备用。

4)组装电泳槽、预电泳

玻璃板取下后，垂直靠在电泳槽里的电源架上，使凝胶板的凹沿面靠向电源架，将凝胶板与电源架按要求固定于电源槽内。加入1×TBE电泳缓冲液，两块凝胶板中间电源架内(上槽)需加满电泳液，上槽的电泳缓冲液与加入在电泳槽(下槽)中的电泳缓冲液互不相通。轻轻地拔去凝胶板内的梳子。启动电源(电压调至3000v，电流调到200mA，功率调至90W,其实是以恒功率电泳)，预电泳半小时左右。

5)点样

插入红色梳子，取处理后的样品液及20bp marker，缓缓加入玻璃板中的梳子孔，注意不要冲散样品。

6)电泳

接通电源，开始电泳，约一个小时左右，观察凝胶板上的样品溴酚蓝的色条带走至接近底端时，停止电泳，关闭电源，取出玻璃板。

7)染色

用铁铲将两块玻璃板轻轻撬开，取下红色边条。将附着凝胶的玻璃板放入清水中浸泡3分钟左右(摇晃)，再放入硝酸银溶液中的摇晃3分钟，取出放入清水中冲一下，放入显影液中直到条带染出，之后立即取出用清水冲洗。

8)扫描

待玻璃板上凝胶干透后，用扫描仪扫描凝胶电泳结果，观测引物多态性是否明显并初步统计扩增片段的大小，以便于进行下一步毛细管电泳荧光引物组合。

6、毛细管电泳

将甲酰胺与分子量内标按100:1的体积比混匀后，取15uL加入上样板中，再加入1uL稀释10倍的PCR产物，然后使用3730XL测序仪进行毛细管电泳，获得样品的指纹图谱。

结果显示：所选引物能够对东部黑核桃、北加州黑核桃、魁核桃、小果黑核桃四个种可以精确鉴定，且50份杂交种质(J.nigra×J.regia)、50份杂交种(J.major×J.regia)均与其母本种一致。

表3

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。