金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台及其制备和应用。

背景技术

癌症对人类健康构成重大威胁。在过去的几年里，许多治疗方法被批准用于癌症的治疗，然而，许多方法只能提供有限的生存益处。癌症的治疗仍然具有挑战性，因为针对关键致病因素的药物很少。科学家提出，联合疗法可以帮助弥补治疗缺陷，提高对药物的反应。因此，迫切需要有效的药物组合来提高肝癌的治疗效果。然而，传统的药物组合疗法往往会受到每种药物各自的药代动力学特征的影响，其生物分布不同，导致治疗效率低下。

核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)是控制核质转运的蛋白质的核心特征。Exportin 1(XPO1)是一种真核细胞核细胞质转运蛋白，它直接与含有NES的蛋白质结合，并将其转位到细胞质。XPO1在多种癌症中过度表达，是一种有效的药物靶点。然而，由于肿瘤的异质性和对靶向治疗的快速适应，肿瘤复发和转移经常发生在患者身上。Akira Inoue等人证明，肿瘤细胞对XPO1抑制剂诱导的DNA损伤的反应可以恢复，因为细胞周期阻滞有助于DNA损伤修复。因此，XPO1抑制剂与其他靶向细胞周期的DNA损伤应答药物联合应用，可以提高肝癌的治疗效果。由鸡贫血病毒(CAV)VP3基因编码的Apoptin可以选择性地引起细胞凋亡。Apoptin96-110含有核输出信号(NES)，使其能够与XPO1竞争，与含有NES的蛋白质结合并抑制其转运，是XPO1抑制剂。DNA损伤反应(DDR)信号通路依赖于共济失调-毛细血管扩张突变(ATM)和共济失调毛细血管扩张及Rad3相关(ATR)的激活，这对DNA损伤修复至关重要。因此，抑制ATM或ATR是一种很有前途的癌症治疗策略。最近，细胞周期检查点抑制剂，尤其是ATR抑制剂的联合治疗正在临床上研究许多癌症。理想情况下，抑制ATR将取消同源重组(HR)修复。因此，将Apoptin96-110与ATR抑制剂联用，很可能取得不错的肿瘤治疗效果。

为了打破联合治疗的限制，纳米技术战略已经出现，为药物组合鸡尾酒提供了新的机会，使用纳米颗粒作为佐剂，从而实现载药的统一药代动力学。金因其对许多疾病的治疗作用，一直被纳米医学用作佐剂和载体。根据之前的研究结果，基于金纳米粒子的纳米药物可以降低毒性，增强免疫原性，并广泛用于癌症治疗，因为它通过松动肿瘤细胞外基质显示出深层肿瘤穿透能力，并提供储存稳定性。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台，该平台可以阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞DNA损伤、抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞凋亡，从而提高肿瘤治疗敏感性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台，其通式为[AA@G]，其中，第一个A为XPO1抑制剂，其为多肽Apoptin的96-110功能片段，并在首尾修饰了Ac和NH2，为了修饰NH2，尾部还添加了氨基酸C，由此最终氨基酸序列为Ac-RVSELKESLITTTPSC-NH2，第二个A为ATR抑制剂，@G为金佐剂，金佐剂作为纳米载体，承载所述XPO1抑制剂和ATR抑制剂。

在一个实施例中，所述Apoptin的96-110功能片段，具有NES序列，能够抑制XPO1对NES相关蛋白的转运，从而抑制XPO1的作用。

在一个实施例中，所述ATR抑制剂，能够抑制ATR的DNA损伤修复功能。

在一个实施例中，所述金佐剂，具有组织、细胞穿透能力，能够携带XPO1抑制剂和ATR抑制剂共同进入细胞内部发挥作用。

本发明还提供了该金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，将TCEP添加到人血清白蛋白溶液中，然后添加ATR抑制剂，合成HAS-ATR抑制剂；

步骤2，将氯金酸溶液添加到HEPES缓冲液中，在加热条件下搅拌，直到溶液变为紫红色，合成纳米金佐剂；

步骤3，将AP、NH

步骤4，将HAS-ATR抑制剂、AP@G与纳米金佐剂混合形成AA@G。

在一个实施例中，所述步骤1，TCEP与HAS的质量体积比为1:1-1:5，HSA和ATR抑制剂的摩尔比为1:1-1:5。所述步骤2，氯金酸和HEPES的摩尔比为1:1-1:5。所述步骤3，AP、NH

本发明金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台可用于制备阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞DNA损伤、抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞凋亡、提高肿瘤治疗敏感性的药物。

与现有技术相比，本发明所获得的纳米平台阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞DNA损伤、抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞凋亡、提高肿瘤治疗敏感性。本发明的制备方法所制备的纳米平台具有优秀的药物负载能力及统一药代动力学的优势。

附图说明

图1是AA@G的合成示意图。

图2是AA@G的制备和表征。其中：

A为AA@G的透射电子显微图像(TEM)；

B为AA@G的元素分析结果；

C为AA@G的照片；

D为AA@G的粒径

E、F为AA@G合成过程中的Zeta电位的变化；

G为UV-Vis吸收光谱；

H为FT-IR吸收光谱；

I为AA@G的流体动力学直径分布；

J为AA@G的药物释放能力。

图3为AA@G的性能检测。其中：

A为AA@G靶向性荧光显微镜检测；

B为AA@G靶向性流式细胞仪检测；

C为AA@G的组织穿透能力检测；

D、E为AA@G的体内代谢检测。

图4为AA@G体外治疗效果。其中：

A为CCK8结果；

B、C为药物协同作用效果分析；

D为细胞凋亡检测结果；

E为细胞周期结果分析；

F、G为D、E的统计分析结果；

H为AA@G在3D肿瘤组织模型中的治疗效果检测。

图5为AA@G的作用机制分析。其中：

A为AA@G的作用机制示意图；

B为WB结果；

C为免疫荧光结果。

图6为AA@G的体内作用效果。其中：

A为AA@G的体内实验流程图

B为不同治疗组处理后，小鼠肿瘤体积统计；

C为不同治疗组处理后，小鼠体重统计；

D为不同治疗组处理后，小鼠肿瘤重量统计；

E为不同治疗组处理后，小鼠肿瘤体积；

F为不同治疗组处理后，肿瘤组织HE染色和Tunel染色；

G为不同治疗组处理后，免疫组化验证蛋白表达量变化情况。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。

纳米技术为药物组合鸡尾酒提供了新的机会，使用纳米颗粒作为佐剂，从而实现载药的统一药代动力学。金因其对许多疾病的治疗作用，一直被纳米医学用作佐剂和载体。根据之前的研究结果，基于金纳米粒子的纳米药物可以降低毒性，增强免疫原性，并广泛用于癌症治疗，因为它通过松动肿瘤细胞外基质显示出深层肿瘤穿透能力，并提供储存稳定性。

核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)是控制核质转运的蛋白质的核心特征。Exportin 1(XPO1)是一种真核细胞核细胞质转运蛋白，它直接与含有NES的蛋白质结合，并将其转位到细胞质。XPO1在多种癌症中过度表达，是一种有效的药物靶点。然而，由于肿瘤的异质性和对靶向治疗的快速适应，肿瘤复发和转移经常发生在患者身上。Akira Inoue等人证明，肿瘤细胞对XPO1抑制剂诱导的DNA损伤的反应可以恢复，因为细胞周期阻滞有助于DNA损伤修复。因此，XPO1抑制剂与其他靶向细胞周期的DNA损伤应答药物联合应用，可以提高肝癌的治疗效果。由鸡贫血病毒(CAV)VP3基因编码的Apoptin可以选择性地引起细胞凋亡。Apoptin96-110含有核输出信号(NES)，使其能够与XPO1竞争，与含有NES的蛋白质结合并抑制其转运，是XPO1抑制剂。DNA损伤反应(DDR)信号通路依赖于共济失调-毛细血管扩张突变(ATM)和共济失调毛细血管扩张及Rad3相关(ATR)的激活，这对DNA损伤修复至关重要。因此，抑制ATM或ATR是一种很有前途的癌症治疗策略。最近，细胞周期检查点抑制剂，尤其是ATR抑制剂的联合治疗正在临床上研究许多癌症。理想情况下，抑制ATR将取消同源重组(HR)修复。因此，将Apoptin96-110与ATR抑制剂联用，很可能取得不错的肿瘤治疗效果。

本发明试图在合成稳定尺径纳米金佐剂颗粒基础上，利用其强大的载药能力，承载XPO1抑制剂与ATR抑制剂，最终构建出一个复合纳米颗粒，为下一步肿瘤治疗增敏研究提供实验材料。

具体而言，本发明提供了一种金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台，其通式为[AA@G]，A的序列为RVSELKESLITTTPSC。其中，第一个A为XPO1抑制剂，其为多肽Apoptin的96-110功能片段，并在首尾修饰了Ac和NH2，为了修饰NH2，尾部还添加了氨基酸C，由此其最终的氨基酸序列为Ac-RVSELKESLITTTPSC-NH2，第二个A为ATR抑制剂，@G为金佐剂，金佐剂作为纳米载体，承载所述XPO1抑制剂和ATR抑制剂。

本发明中，一体式，是指金佐剂承载XPO1抑制剂与ATR抑制剂的构成了统一整体。此处承载，是指金佐剂作为一个纳米载体，可以承载XPO1抑制剂与ATR抑制剂及其他药物。

本发明同时公开了其一种具体的制备工艺，步骤为：首先将1mg TCEP添加到0.5mL人血清白蛋白(HSA，10mg/mL)溶液中。然后，向上述HSA溶液中添加ATR抑制剂(1mM)。最后，使用5mL超纯水为稀释溶液进行稀释，合成HAS-ATR抑制剂。再将0.5mL氯金酸溶液(10mM)添加到4.5mL 50mM HEPES缓冲液中，在加热条件下搅拌，直到溶液变为紫红色，合成纳米金佐剂。然后将2.5mg AP、2mg NH2-PEG2000-SH和4.5mL HEPES(50mM)充分混合后，添加0.5mL氯金酸溶液(10mM)并持续搅拌，直到溶液变为淡黄色至无色，合成AP@G。最后，将2mL HAS-ATR抑制剂溶液，2mLAP@G溶液与4mL纳米金佐剂溶液混合10分钟形成AA@G，如图1所示。

该金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台的应用，通过阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞DNA损伤、抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞凋亡、提高肿瘤治疗敏感性。下面对AA@G进行验证试验：

1.AA@G的合成

1)HAS-ART抑制剂

(1)配置10mg/mL的HAS溶液0.5mL，并加入1mg TECP，超声5min.

(2)向上述HAS溶液中加入ATR抑制剂，使其终浓度为1mM。

(3)将上述溶液稀释至5mL(稀释10倍)，超声10min。

2)纳米金佐剂溶液制备

(1)向4.5mL 50mM的HEPES溶液中加入0.5mL 10mM的氯金酸溶液，加热搅拌，直至溶液变成紫红色，表示金核制备成功

3)AP@G的制备

(1)向4.5mL 50mM的HEPES中加入2.5mg的CEM1和2mg的NH2-PEG2000-SH，混匀后，加入0.5mL 10mM的氯金酸溶液，加入搅拌，直至溶液有淡黄色变为无色，标志AP@G的形成

4)AA@G的制备

(1)向4mLAP@G溶液中加入HAS-ART抑制剂2mL、金-肽聚合物2mL，加入搅拌10min，AA@G制备完成。(ATR抑制剂终浓度200uM，多肽浓度0.2mg/mL)

2.AA@G的表征

1)电子显微镜样品制备

(1)取1个1.5mLEP管，取1mL制备的AA@G溶液放置在离心管中，用涡旋仪或超声使AA@G分散均匀；

(2)取另1个1.5mLEP管，加入100μL乙醇溶液，再注入1μL原溶液，超声分散3分钟，使AA@G分散均匀；

(3)样品镊取出碳膜铜网，放在实验台，正面朝上；

(4)使用10μL移液器取分散好的纳米颗粒溶液滴在碳膜铜网上，在空气中干燥，重复4-5次，使用透射电子显微镜观察，加速电压为200KV，测试温度为23+2℃；

(5)观察之后可对样品进行EDS分析，检测纳米颗粒所含化学元素。

2)粒径、分散性和Zeta电位的测定

(1)粒径和分散性测定：

a)取1个1.5mLEP管，加入1mL乙醇溶液，再注入1μL制备的AA@G溶液放置在离心管中，超声使AA@G分散均匀；

b)准备比色皿，打开仪器预热，用1mL移液器将准备好的样品移至比色皿中，上机测试，注意比色皿三角部位朝前放置；

(2)电位测定：

a)取1个1.5mLEP管，加入1mL乙醇溶液，再注入5μL制备的AA@G溶液放置在离心管中，超声使纳米颗粒分散均匀；

b)准备可抛弃折叠毛细管样品池，用2mL注射器将样品加入池中，注意过程中不能产生气泡，同时使液体高度超过样品池导电处；

c)打开仪器预热，将样品池有马尔文logo部位超前放置，开始测试。

3)紫外吸收光谱检测

(1)打开紫外可见光谱仪预热半小时；

(2)准备好PBS，用于基线扫描和及时清理比色皿；

(3)取1个5mLEP管，加入3mLPBS溶液，再注入10μL制备的AA@G溶液放置在离心管中；

(4)用1mL移液器将准备好的样品移至比色皿中，置于紫外一可见分光光度计中，以缓冲溶液作为空白溶液，对250-800nm波长范围内的吸收光谱进行扫描。

4)红外光谱分析

(1)打开紫外可见光谱仪预热半小时；

(2)将制备好的AA@G粒溶液真空冷冻干燥，待样品成为干燥的粉末后，用称量纸包裹，用载玻片轻轻按压，使样品更加均匀；

(3)上样后扫描。

5)高效液相色谱分析

(1)仪器准备：

a)根据分析对象选择色谱柱和流动相，使用C18柱(Nova-Pak 3.9×250mm，Waters，Milford，MA)；流动相包括水和乙腈，体积比例为1:9。

b)过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜，过滤后的流动相进行超声脱气30min；

c)连接好流动相管道，打开HPLC工作站(包括计算机软件和色谱仪)，连接检测系统；

d)冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不超过10mL/min；

e)设计走样方法，点击file，选取select users and methods，点击new method，选取需要的配件(进样阀，泵，检测器等)。一个完整的走样方法需要包括：

(a)进样前的稳流，一般2-5分钟；

(b)基线归零；

(c)进样阀的loading-inject转换；

(d)走样时间，随不同的样品而不同。

(2)样品准备：

a)准备2mL注射器，0.45um滤器，样品瓶；

b)将注射器针头去掉，吸入样品，注入滤器过滤至样品瓶中，样品量在200μL左右；

c)观察样品瓶，一定不能有气泡，若有气泡，则甩动样品瓶至气泡排出

(3)进样

a)选定走样方法，点击start，开始进样；

b)先进单纯的溶剂，作为基线，再开始进检测样品，全部样品检测完，再用同样的方法走一段基线，清洗系统。

(4)关机

先关闭计算机，再关闭液相色谱。

3.AA@G的体内应用

选取5周龄体重约18g的健康C57小鼠，在层流室内培养1周后，无菌条件下于裸鼠右后肢根部皮下注射PBS(磷酸盐缓冲液)稀释的Hep1-6细胞(2×10

1)分组：Control、@G、AP@G、AT@G、AA@G；

2)腹腔脉注射各组纳米药物

(1)固定小鼠，露出小鼠腹部；准备好1毫升的注射器；

(2)用PBS溶解各组纳米药物，将其用0.22滤膜过滤；

(3)右手持注射器，吸取适量的药物溶液，于右下腹部进针，将溶液推进腹部；

(4)拔出注射器，用纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血；

结果与讨论：

如图2中A所示，合成的AA@G呈球形，尺寸均一，分散性良好，配合能量色散光谱仪对AA@G进行EDS分析结果显示AA@G中主要含有Au、S、O、N元素，而且均匀分布，恰好与AA@G的形状相吻合，表明Au-S键形成(图2中B)。图2中C显示了AA@G合成过程中的颜色变化。粒径分析表明AA@G的大小分布在22.3nm左右(图2中D)。对纳米复合物制备过程中表面电位的变化情况进行检测，结果发现：@G带负电荷，约在-8.95±6.80mV，AA@G带负电荷，约在21.60±4.45mV(图2中E、F)。

紫外可见吸收光谱显示AP的紫外可见吸收峰λmax位于220nm附近；ATR抑制剂的紫外可见吸收峰λmax位于330nm、520nm附近；而@G不具备紫外可见吸收峰；当@G包载AP和ATR抑制剂后，紫外可见吸收峰λmax出现红移，最大吸收峰分别位于230nm和530nm附近(图2中G)。说明了@G具有良好的载药性能，能成功负载AP和ATR抑制剂。红外光谱分析结果显示：@G包载完AP和VP后的AA@G有吸收峰的改变，提示有新官能团的产生。进一步证明了AA@G能成功负载AP和ATR抑制剂(图2中H)。图2中I提示了AA@G在血清中能稳定存在，而在高谷胱甘肽浓度的肿瘤组织中，则分解。图2中J提示了AA@G在谷胱甘肽环境下能成功释放药物。

为了验证AA@G的细胞穿透能力，本发明将AA@G与癌细胞共同孵育孵育。结果显示，AA@G能顺利进入细胞(图3中A、B)。本发明还构建了3D肿瘤组织模型，观察AA@G在组织中的穿透能力，结果表明AA@G能到达组织内部，具有强大的组织穿透能力(图3中C)。为了进一步观察AA@G的体内代谢情况，本发明将AA@G注射进荷瘤小鼠体内，采用ICP-MS检测各个脏器中AA@G的分布情况，可以发现，AA@G在肿瘤组织中聚集，而在正常脏器中，虽然有一过性增高，但最终都回归正常水平，说明AA@G能从生物体内顺利代谢。CCK8结果、流式细胞凋亡结果显、死活细胞染色结果示AA@G能有效促进细胞凋亡，提高的敏感性(图4中A至H)。

图5中A示出了AA@G的作用机制，图5中B的WB实验结果显示，与对照组和@G组相比，AA@G治疗组中γ-H2AX、的表达水平增加，而Rad51、p-chk1、CyclinD1的表达水平减少。这些结果表明AA@G促进DNA损伤、抑制DSB后的HR修复。免疫荧光(IF)结果与WB结果一致，如图5中C所示。

为了确定AA@G在体内的作用效果，本发明将Hep1-6荷瘤小鼠随机分为六组：对照组、@G、AP@G、AT@G及AA@G组。如图6中A所示，对小鼠进行治疗。每2天记录各组的体重和肿瘤生长，以评估治疗效果。体重测量表明，各组的小鼠都有相似的生长曲线(图6中C)；肿瘤生长测量结果显示，AA@G治疗组与其他治疗组相比，肿瘤生长明显较慢(图6中B、E)；肿瘤重量结果显示AA@G治疗组肿瘤重量最低(图6中D)。如图6中F、G，肿瘤切片的HE组织染色结果显示AA@G治疗组与其他组相比，肿瘤组织中的坏死更多。TUNEL荧光染色结果显示AA@G处理组的肿瘤切片细胞绿点更多，提示其凋亡率明显提高，肿瘤杀伤作用更明显。免疫组织化(IHC)染色来评估γ-H2AX、Ki67、p-ATM/ATR、CyclinD1的表达水平来进一步研究AA@G在体内提高治疗敏感性上的作用。免疫组织化染色结果显示AA@G组中γ-H2AX的表达水平最高，Ki67、p-ATM/ATR和CyclinD1表达水平最低。

综上所述，本发明提出的金佐剂联合XPO1抑制剂和ATR抑制剂的一体式纳米平台的应用，通过阻滞细胞周期、促进肿瘤细胞DNA损伤、抑制肿瘤细胞DNA损伤修复、促进肿瘤细胞凋亡、提高肿瘤治疗敏感性，本发明纳米平台也可以承载其他药物，实现多种治疗效果。本发明的制备方法所制备的纳米平台具有优秀的药物负载能力及统一药代动力学的优势。

/>

/>