一种HCV抗原包被预处理剂、抗原包被方法及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体为一种HCV抗原包被预处理剂、抗原包被方法及检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种以肝损害为主的主要经血液传播的一组全身性传染病疾病，据估计全球约1.7亿人感染HCV，约70％转化为慢性，其中又有约20％～30％在10～30年发展为肝硬化，其1％～5％进而可导致肝细胞癌，丙型肝炎的感染已经成为了一个严重的全球公共卫生问题。

目前，HCV特异性抗体检测常用方法有酶联免疫吸附实验，化学发光和胶体金法快速试验等检测丙型肝炎病毒最常用的方法是免疫检测，此方法以抗原-抗体的特异性识别为基础。

化学发光免疫分析技术是目前世界公认的先进的免疫诊断技术，广泛应用于肿瘤标记物、传染病、内分泌功能、激素等方面的诊断。

化学发光免疫分析包含免疫反应和化学发光两个部分。化学发光是指化学发光物质经催化剂的催化或氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时会释放等能级的光子，出现发光现象，化学发光免疫分析过程是首先将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，抗原抗体特异性结合后，加入氧化剂或发光底物，经氧化或与底物发生反应后，发生发光现象，由于化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量，按抗原或抗体包被方法不同，化学发光分为微孔板式和微粒式，微粒式分为磁微粒式和非磁微粒式，其中磁微粒式是最先进的化学发光技术。

磁性微球表面的功能基团，在一定的环境下，与抗原或者抗体等蛋白上的基团(氨基/羧基等)反应形成共价键或非共价键，从而使目的蛋白偶联上磁性微球，由于HCV抗原结构的特殊性--小分子、疏水性，目前普通得抗原包被效率普遍不高，这样导致相HCV检测试剂盒检测方法灵敏度低，信噪比低、生产成本高等问题。

发明内容

本发明目的是提供一种HCV抗原包被预处理剂、抗原包被方法及检测试剂盒，以解决上述技术问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种HCV抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

优选的，所述非离子型表面活性剂包括吐温、曲拉通以及四乙烯五胺。

优选的，所述吐温的种类为吐温-20、吐温-60和吐温-80中的一种，所述曲拉通的种类为曲拉通-100。

优选的，所述HCV抗原包被预处理剂中，吐温的质量百分比含量为0.01％-10％，曲拉通的质量百分比含量为0.001％-10％，四乙烯五胺的质量百分比含量为0.0005％-1％。

优选的，所述抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液中的一种。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上。

优选的，所述步骤(1)中HCV抗原预处理时长0.5-5h。

优选的，所述HCV抗原包被的固相载体为羧基磁珠、氨基磁珠和甲苯黄酰基磁珠中的一种。

一种HCV包被抗原试剂，由上述方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，所述HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和吖啶酯类中的一种。

本发明至少具备以下有益效果：

本发明提供了一种HCV抗原包被预处理剂、抗原包被方法及检测试剂盒，该抗原预处理剂中含有吐温和曲拉通以及四乙烯五胺，与现有技术相比，使用本发明提供的抗原包被预处理剂和抗原包被制备方法可以显著提高抗原包被效率，从而有效提高检测试剂的灵敏度，获得更高的信噪比，有利于减少检测的误差。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0。

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100以及四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-20的质量百分比为0.1％，曲拉通-100的质量百分比为0.01％、四乙烯五胺的质量百分比为0.001％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长2h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例2

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0；

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100以及四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-20的质量百分比为0.5％，曲拉通-100的质量百分比为0.1％、四乙烯五胺的质量百分比为0.005％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长2h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例3

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0；

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100以及四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-20的质量百分比为1％，曲拉通-100的质量百分比为0.05％、四乙烯五胺的质量百分比为0.01％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长2h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例4

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0；

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100以及四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-20的质量百分比为3％，曲拉通-100的质量百分比为1％、四乙烯五胺的质量百分比为0.05％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长2h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例5

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0；

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100以及四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-20的质量百分比为5％，曲拉通-100的质量百分比为2％、四乙烯五胺的质量百分比为0.1％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长2h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例6

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0；

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100以及四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-20的质量百分比为8％，曲拉通-100的质量百分比为5％、四乙烯五胺的质量百分比为0.5％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长2h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例7

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0；

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100以及四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-20的质量百分比为10％，曲拉通-100的质量百分比为6％、四乙烯五胺的质量百分比为1％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长2h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例8

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0。

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100；非离子型去垢为四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-60的质量百分比为0.01％，曲拉通-100的质量百分比为0.0001％、四乙烯五胺的质量百分比为0.0005％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长0.5h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例9

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0。

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100；非离子型去垢为四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-60的质量百分比为0.01％，曲拉通-100的质量百分比为0.0001％、四乙烯五胺的质量百分比为0.005％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长5h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为羧基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例10

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为硼酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0。

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100；非离子型去垢为四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-80的质量百分比为5％，曲拉通-100的质量百分比为0.01％、四乙烯五胺的质量百分比为1％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长5h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为羧基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为辣根过氧化物酶。

实施例11

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型表面活性剂、非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为硼酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0。

其中，非离子型表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100；非离子型去垢为四乙烯五胺。

其中，HCV抗原包被预处理剂中，吐温-80的质量百分比为5％，曲拉通-100的质量百分比为10％、四乙烯五胺的质量百分比为1％。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长1h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为氨基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为吖啶酯类。

对比例1

本实施例提供了一种抗原包被预处理剂，包括非离子型去垢剂、抗原包被缓冲液、纯化水。

其中，抗原包被缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M，pH为8.0。

一种HCV抗原包被方法，包括以下步骤：

步骤(1)，先用HCV抗原预处理剂进行HCV抗原预处理，预处理时长2h；

步骤(2)，将经过预处理的HCV抗原结合在固相载体上，HCV抗原包被的固相载体为甲苯黄酰基磁珠。

一种HCV包被抗原试剂，由以上方法制得。

一种HCV检测试剂盒，包括HCV标记抗原试剂以及HCV包被抗原试剂，其中，HCV标记抗原试剂为碱性磷酸酶。

实施例1-11与对比例1各参数如下表1所示：

表1实施例1-11与对比例1参数对比

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对比例1和实施例1-11进行平行对比试验，实验时，每组试剂同时检测阴性质控、阳性质控(质控样本均为符合国内标准的物质)，比较灵敏度和信噪比，下面对制备检测HCV抗体试剂方法进行具体说明，具体试验方案如下：

HCV抗原包被甲苯黄酰基磁珠制备：

(1)取HCV抗原，加入上述抗原预处理剂，37℃孵育2h；

(2)取甲苯黄酰基磁珠(Toysl)，用磷酸盐缓冲液清洗1遍；

(3)磁分离器分离，去除上清；

(4)往清洗好的磁珠中加入(1)中预处理好的抗原；

(5)混匀后，加入催化剂，37℃反应24h；

(6)加入1％BSA，37℃封闭6h；

(7)清洗液清洗4遍，2-8℃存储。

(8)使用时，将步骤(7)得到的磁珠，用TRIS缓冲液稀释成0.1mg/mL。

HCV抗原包被羧基磁珠制备：

(1)取HCV抗原，加入上述抗原预处理剂，37℃孵育5h；

(2)取羧基磁珠，用磷酸盐缓冲液清洗3遍；

(3)磁分离器分离，去除上清；

(4)往清洗好的磁珠中加入(1)中预处理好的抗原；

(5)混匀后，加入活化试剂NHS，室温反应3h；

(6)加入1％BSA，室温封闭2h；

(7)清洗液清洗4遍，2-8℃存储。

(8)使用时，将步骤(7)得到的磁珠，用TRIS缓冲液稀释成0.1mg/mL。

HCV抗原包被氨基磁珠制备：

(1)取HCV抗原，加入上述抗原预处理剂，37℃孵育1h；

(2)取氨基磁珠，用磷酸盐缓冲液清洗3遍；

(3)磁分离器分离，去除上清；

(4)往清洗好的磁珠中加入(1)中预处理好的抗原；

(5)混匀后，加入活化试剂戊二醛，室温反应2h；

(6)加入2％BSA，室温封闭1h；

(7)清洗液清洗4遍，2-8℃存储。

(8)使用时，将步骤(7)得到的磁珠，用TRIS缓冲液稀释成0.1mg/mL。

HCV抗原标记碱性磷酸酶的制备：

(1)取碱性磷酸酶(ALP)10mg，加入磷酸盐缓冲液稀释ALP至10mg/mL；

(2)加入Trut's试剂(2mg/mL)混匀,室温反应30mins；

(3)超滤管除去未反应的Trut's试剂；

(4)收集反应完成的ALP。

(5)取抗原10mg，用磷酸盐缓冲液稀释成10mg/mL,加入交联剂SMCC，小心混匀；

(6)室温反应30mins；

(7)超滤管除去未反应的交联剂SMCC；

(8)收集反应完成的抗原。

(9)将步骤(4)与步骤(8)得到的产物体积比1：1混合；

(10)室温反应1h；

(11)加入50％甘油保存。

(12)使用时，将步骤(11)得到的标记抗原，用TRIS缓冲液稀释成0.1ug/mL；

HCV抗原标记辣根过氧化物酶的制备：

(1)取辣根过氧化物酶(HRP)10mg，加入磷酸盐缓冲液稀释至10mg/mL；

(2)加入NaIO4溶液，混匀,4℃反应30mins；

(3)加入乙二醇水溶液，混匀，静置30mins；

(4)加入抗原，装入透析袋，4℃透析过夜；

(5)加入NaBH4溶液，4℃静置2h；

(6)加入等体积饱和硫酸铵，4℃静置1h；

(7)离心，去上清，硫酸铵重悬沉淀；

(8)将(7)中的溶液，装入透析袋中，透析过夜；

(9)离心，取上清即为酶结合物。

(10)加入50％甘油保存。

(11)使用时，将步骤(10)得到的标记抗原，用TRIS缓冲液稀释成0.1ug/mL

HCV抗原标记吖啶酯的制备：

(1)取吖啶酯(AE)10mg，加入DMSO溶解至5mg/mL；

(2)取抗原，加入磷酸盐缓冲液，混匀；

(3)加入吖啶酯(AE)混匀，室温避光反应30mins；

(4)超滤管除去未反应的吖啶酯(AE)；

(5)产物即为AE标记物；

(6)使用时，将步骤(5)得到的标记抗原，用TRIS缓冲液稀释成0.1ug/mL。

检测程序：

取待测物50uL，HCV包被磁珠的抗原试剂50uL混匀，37℃反应20mins，清洗4次，再加入碱性磷酸酶标记的抗原50uL，37℃反应20mins，清洗4次，然后加入底物，进行发光反应，记录各个待测物相对应的发光值。

试验结果

检测结果如表2、表3和表4所示。

表2各实施例检测阴/阳性质控结果

表3各实施例阳性质控的信噪比

表4临床样本测试结果

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其中：

P/N：待测样本RLU/阴性样本RLU；

RLU1/P/N1：为本发明测试结果；

RLU2/P/N2：为国内知名上市产品测试结果。

本实验共检测了108例阴性临床样本，本发明检测结果全部为阴性，特异性为100％，符合率100％；而国内知名上市产品，检测108例阴性样本中，有3例出现假阳性，出现假阳性概率为2.8％，特异性/符合率为97.2％。

实验结果显示，使用该抗原包被预处理剂包被磁珠等固相载体，包被效率明显增高，试剂灵敏度和信噪比均显著升高。

现有技术中抗原与磁珠的包被效率都很低，包被后抗原活性受损，同时需要浪费大量的抗原，增加生产成本，本发明通过大量的实验优化抗原包被方法，在抗原与磁珠包被前，增加抗原预处理阶段，增加此过程有利于抗原蛋白结构伸展，更好的暴露出抗原蛋白上的功能基团：如-NH2/-COOH等，更有助于抗原与磁珠相应基团发生化学反应，同时保持了抗原二级结构的稳定。

目前现有的抗原包被流程中(如公开文献CN105954510A/CN202010469073)均未涉及抗原预处理过程，而是直接将抗原与磁珠混合反应，本发明提供的抗原包被制备方法的包被效率比现有技术包被效率提高10倍以上，同时很好地维持了抗原活性，从而提供检测试剂的灵敏度和检出率。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。