一种基于昆虫细胞表达产物的检测新型鹅星状病毒抗体的ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基于昆虫细胞表达产物的检测新型鹅星状病毒抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术检测领域。

背景技术

鹅星状病毒(Goose Astrovirus,GAstV)属于星状病毒科，禽星状病毒属。GAstV是一种无囊膜、单股正链RNA病毒，直径约为35nm。GAstV全基因组长约为7.2kb，包含三个开放性阅读框(ORF1a、ORF1b和ORF2)。其中ORF2为GAstV的衣壳蛋白。近几年，鹅群流行的新型GAstV可以导致以肝脏、脾脏和肾脏等内脏器官表面以及关节腔有大量的尿酸盐沉积的鹅痛风症状，对雏鹅的致病力较强，致死率较高。由新型GAstV感染引起的鹅痛风的爆发给国内养殖业造成了巨大经济损失。然而，目前缺乏商品化的检测新型GAstV特异性抗体的血清学诊断技术。为研制具有高灵敏性与高特异性的新型GAstV血清学诊断方法，本发明拟以在昆虫细胞Sf9表达及纯化的新型GAstV的ORF2蛋白为抗原，建立了检测新型GAstV抗体的ELISA试剂盒，为新型GAstV感染诊断和免疫监控提供了技术支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于昆虫细胞表达产物的检测新型鹅星状病毒抗体的ELISA试剂盒，本发明的原理是将表达新型GAstV的ORF2重组蛋白的杆状病毒感染Sf9细胞，并以镍柱亲和层析法纯化感染细胞裂解液上清中的ORF2重组蛋白，将纯化的重组蛋白分别作为包被抗原组装检测新型GAstV抗体的间接ELISA试剂盒。研究结果表明，建立的检测新型GAstV抗体的间接ELISA试剂盒具有良好的特异性和灵敏性，在新型GAstV病毒流行病学调查中具有良好的应用价值。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于昆虫细胞表达产物的检测新型鹅星状病毒抗体的ELISA试剂盒，其特征是，该试剂盒成分包括包被有重组ORF2蛋白的ELISA酶标板，阳性和阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，稀释液，显色液及洗涤液；

其中，阳性对照为抗鹅星状病毒的鹅血清，阴性对照为SPF鹅血清，稀释液为10％Sf9细胞裂解液，显色液为TMB显色液，洗涤液为含0.05％Tween-20的PBST。

所述重组ORF2蛋白的制备方法为：

将重组杆状病毒rBacmid-GAstV-ORF2感染Sf9细胞，96h之后收集细胞用PBS重悬后用超声波破碎仪进行破碎，破碎完成后高速离心收集上清，经His标签亲和层析柱纯化后得到纯化的重组ORF2蛋白；通过SDS-PAGE分析蛋白的纯度，通过Western blot分析重组蛋白与阳性血清的反应性；

所述重组ORF2蛋白的氨基酸序列为：

MADRAVAPREKVTKKVTKVVTVKKKHPKKKPKQKVYKPQKLPMKAERKLEKEVKGLKKRVAGPPVNDKMTTTITLGQITGNSTDTLDRKHKYFTNPLMMKNQENGQTATPLSIRASQYNLWRIRKLHIRLVPLAGRANILGSVVFLDIEQEANTAGPESIDTIKARPHLELPIGSKHLWRVQPRLMQGPRQGWWNVDPGDSPTDSLGPAINMWTYLKTVNALSARAQAQQVPYTSALFLVEATVTYEFSNYGPKPGLSLMTSETLSASGKTATLVNTQDGALALTVSGALQRFLDEKEQHRRVSNAQTSGVGEVFWAVSTEVVETVASALGGWGWLLKGGWFVIRKLFGAASNSGSTYLIYSSVSDAQIDSRIYQTVPPNTPLQLAANTVKLVQLTQPNVNTTGQGTTVLSRDADYLPLPVAPMQVTPSLVYNFQGERQSTTESCSFLVFGIPQAESRSRYNAAITFNVGYRGRTSTSFTLGTHNWWAVMTLSQTGVIFAPPAVGTGVCNTLATAIQHLNPELETAVLRVNTSTTSTGGLITELRNRLNIADGDYVISMGDPQGNRSALYFRNSDQKWVWLWAGDSNPGETFQNFKMPVLINWSVSDSQEQYNARVRMVQYANAQQQILTDPEEDDDPLSDVTSLFDPTAEDETDFHLAVSLKTSDYLKEEAEYWKAKAQALLMEKALSAPQAGAVRFEKGGHE。

细胞用PBS重悬后用超声波破碎仪进行破碎时，超声波破碎仪设定的参数为：频率40Hz，破碎间隔9s，破碎时间8min；

破碎完成后高速离心收集上清时，高速离心参数为：离心转速为12000rpm，离心时间为20min。

该试剂盒检测新型鹅星状病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：

将阳性血清1：200稀释后加入A1、A2孔，将阴性血清1：200稀释后加入A3、A4孔，剩下的的孔用于检测待检样品，待检样品1：200用样品稀释液稀释，37℃反应30min，PBST洗涤3遍后，加入工作浓度的HRP标记的兔抗鸡抗体，37℃反应60min，PBST洗涤3遍后，进行显色15min，之后加入终止液终止显色；最后读取OD

公式为S/P＝(样品OD

S/P比值大于临界值0.39判为阳性，S/P比值小于或等于临界值0.39判为阴性。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益技术效果：

基于昆虫杆状病毒表达系统优于原核表达系统的优点，表达外源蛋白时具有完备的翻译后加工修饰能力，在昆虫细胞上表达的重组ORF2蛋白具有天然构象，具有较好的模拟新型GAstV的免疫原作用；

(2)利用杆状病毒表达系统制备的重组ORF2蛋白在Sf9昆虫细胞中实现高效易溶性表达。

(3)本发明所建立的蛋白纯化方法经过条件优化，在保证ORF2不失去天然构象的前提下，可有效去除Sf9昆虫细胞中杂蛋白，保证目的蛋白的纯度。

(4)本发明建立的基于重组ORF2蛋白的检测新型鹅星状病毒抗体的间接ELISA试剂盒能特异地、有效地检测出感染新型GAstV或免疫新型GAstV疫苗的鸡群中抗GAstV抗体，能用于新型GAstV感染及免疫状况流行病学调查。

综上，本发明公开了一种基于昆虫细胞表达产物的检测新型鹅星状病毒抗体的ELISA试剂盒，包括分别包被有重组蛋白ORF2的ELISA酶标板，阳性和阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。本发明建立的GAstV-ORF2抗体的间接ELISA试剂盒能特异性的检测出GAstV-ORF2抗体，而与呼肠孤病毒(REO)、鹅细小病毒(GPV)、禽腺病毒(FADV)、H9亚型禽流感病毒(AIV-H9)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)、新城疫病毒(NDV)、鸭腺病毒(DADV)的阳性血清以及SPF鹅血清不反应。采用本发明提供的试剂盒能够准确地检测禽类是否产生抗新型GAstV抗体。因此，该试剂盒具有良好新型GAstV的特异性，能用于新型GAstV感染及免疫状况流行病学调查。

附图说明

图1为ORF2纯化蛋白的SDS-PAGE；

泳道M：蛋白Marker；泳道1：纯化后的ORF2蛋白。

图2为ORF2纯化蛋白的Western blot鉴定；

泳道M：蛋白Marker；泳道1：细胞裂解上清液；泳道2：纯化后的ORF2蛋白。

图3为基于ORF2蛋白的间接ELISA试剂盒特异性检测。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例：

1、杆状病毒表达载体构建：

重组杆状病毒rBacmid-GAstV-ORF2的构建及鉴定见中国专利《一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法》申请公布号为CN114457115A。

2、重组杆状病毒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：

将重组杆状病毒rBacmid-GAstV-ORF2感染Sf9细胞，96h之后收集细胞用PBS重悬后用超声波破碎仪(40Hz，间隔9s，共计8min)进行破碎，破碎完成后高速离心(12000rpm，20min)收集上清。在试验的前期研究中，发明人已系统地研究了蛋白纯化反应体系中的各种因素的影响，包括纯化试剂的选择、裂解液与细胞沉淀的比例、裂解液与Ni

3、检测新型鹅星状病毒抗体的间接ELISA试剂盒的组装：该试剂盒成分包括包被有重组ORF2蛋白的ELISA酶标板，阳性和阴性对照(阳性对照为抗鹅星状病毒的鹅血清，阴性对照为SPF鹅血清)，HRP标记的兔抗鸡二抗(购买所得)，样品稀释液(10％Sf9细胞裂解液)，显色液(TMB显色液)及洗涤液(含0.05％Tween-20的PBST)。

4、检测新型鹅星状病毒抗体的间接ELISA方法的特异性分析：相同条件下，对GAstV阳性血清，REO、GPV、FADV、AIV-H9、ALV-J、NDV、DADV的阳性血清以及SPF鹅血清进行检测。结果表明，该试剂盒只与新型GAstV阳性血清反应，而与所检测的其它病毒阳性血清及SPF鹅血清均没有反应。说明该ELISA方法均具有很好的特异性(见图3)。

5、检测新型鹅星状病毒抗体的间接ELISA方法的灵敏度性分析：取2份不同的抗新型GAstV阳性血清按照梯度进行稀释(1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600)后按照已经建立好的方法进行ELISA检测，同时将0.1MOI的新型GAstV病毒感染LMH细胞，在72h后固定细胞，以IFA方法进行同步检测。比较两种方法的检测效果，评估ELISA方法的灵敏度。结果显示，本建立ELISA方法敏感性最高均为1：3200(表1)，高于IFA方法的敏感性(1：400)，表明该ELISA方法具有较高的灵敏度。

表1基于ORF2蛋白的间接ELISA试剂盒灵敏度检测；

注：*ORF2-ELISA(S/P≥0.39，GAstV抗体阳性；S/P＜0.39，GAstV抗体阴性)；

IFA(+为ORF2抗体阳性；－为ORF2抗体阴性)。/>