一种鉴定工程菌Stbl3基因型的试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物信息学技术领域，特别是涉及一种鉴定工程菌Stbl3基因型的试剂盒。

背景技术

由于遗传背景清晰、繁殖迅速、安全性好、成本低廉以及易于基因工程操作等原因，能够携带外源目的基因的大肠杆菌(亦称基因工程菌)已经成为基因工程研究的重要工具，在生物化学、分子生物学以及化学基因组学研究领域的应用越来越广泛。实验室一般使用的大肠杆菌拥有4288条基因，每条基因的长度约为950bp，基因间的平均间隔为118bp。大肠杆菌基因组中包含有许多插入序列，如λ-噬菌体片段和一些其它特殊组份的片段，这些插入片段均由基因的水平转移和基因重组而形成的，由此表明了大肠杆菌基因组具有它的可塑造性。利用大肠杆菌基因组的这种特性对其进行改造，使其中的某些基因发生突变或缺失，从而给大肠杆菌带来可以观察到的变化，这种能观察到的特征叫做大肠杆菌的表现型(Phenotype)，把引起这种变化的基因构成叫做大肠杆菌的基因型(Genotype)。具有不同基因型的大肠杆菌菌株表现出不同的特性，因此在应用大肠杆菌之前，通常应对其基因型进行鉴定，以确定其是否满足进一步的科学研究需要。

目前传统工程菌基因型的鉴定方法包括全基因组测序分型和表型鉴定分型。这些方法虽然能够从不同层面对工程菌基因型进行鉴定，但都存在着一些不足之处：全基因组测序分型虽针对工程菌基因组DNA层面进行检测，但是面临着操作繁琐、价格昂贵、耗时周期长、需要完全不同于传统上用于大多数突变检测技术的DNA制备方法、对数据储存和处理有巨大的计算机需求以及由于培养过程中工程菌基因的不断突变从而导致最终测序结果与理论值结果不匹配等诸多问题；而表型鉴定分型则没有涉及到工程菌内部基因情况，仅仅从表型特征来判断其是否与相应基因型所带来的特征吻合，因此鉴定结果不具有说服性和权威性，可能存在较大误差。上述问题在一定程度上既不能节约鉴定时间和成本，又不能完全保证所得鉴定结果的准确可靠性，因此严重制约了工程菌基因型鉴定过程中的工作效率与进度。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种鉴定工程菌Stbl3基因型的试剂盒，用于解决现有技术中全基因组测序分型和表型鉴定分型操作繁琐、价格昂贵、耗时周期长、误差大的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种鉴定工程菌Stbl3基因型的试剂盒，所述试剂盒包含使用多位点序列分型法检测Stbl3管家基因的物质，所述Stbl3管家基因选自mcrB、mrr、hsdS、recA、supE、ara、galk、lacY、proA、rpsL、xyl、leu、mtl和endA的一种或多种。

优选地，所述检测Stbl3管家基因的物质为引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1-SEQ ID No.66所示。

本发明还提供前述试剂盒在制备鉴定工程菌Stbl3产品的用途。

本发明还提供一种工程菌Stbl3基因型的鉴定方法，所述鉴定方法使用前述试剂盒鉴定菌株。

如上所述，本发明的一种鉴定工程菌Stbl3基因型的试剂盒，具有以下有益效果：

1.本发明所使用的试剂盒操作简单,能快速得到鉴定结果；

2.本发明所使用的试剂盒在结果准确可靠性的同时，节约时间和成本，从而为工程菌基因型提供了一种更高效、更快速和更经济的鉴定方法。

附图说明

图1为大肠杆菌Stbl3的理论基因型图谱；

图2为本发明实施方式公开的方法对大肠杆菌Stbl3感受态细胞以及大肠杆菌Stbl3基因工程菌进行基因型鉴定的结果，其中：图2-1为管家基因mcrB/mrr/hsdS/recA电泳结果、图2-2为管家基因araA/araB/araC/araD电泳结果、图2-3为管家基因araE/araF/araG/araH电泳结果、图2-4为管家基因araJ/galK/lacY/proA电泳结果、图2-5为管家基因rpsL/xylA/xylB/xylE电泳结果、图2-6为管家基因xylF/xylG/xylH/xylR电泳结果、图2-7为管家基因leuA/leuB/leuC/leuD电泳结果、图2-8为管家基因leuE/mtlA/mtlD/mtlR电泳结果、图2-9为管家基因endA电泳结果；”-”表示大肠杆菌Stbl3感受态细胞，“+”表示大肠杆菌Stbl3基因工程菌；两侧以及中间的泳道为DNA marker，从下到上条带大小依次为：100bp，200bp，300bp，400bp，500bp，600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1200bp，1500bp，2000bp，3000bp。

图3为本发明实施方式公开的方法对大肠杆菌Stbl3感受态细胞与理论型大肠杆菌Stbl3进行DNA双序列比对的结果，其中：图3-1为管家基因araA比对结果、图3-2为管家基因araB比对结果、图3-3为管家基因araC比对结果、图3-4为管家基因araD比对结果、图3-5为管家基因araE比对结果、图3-6为管家基因araF比对结果、图3-7为管家基因araG比对结果、图3-8为管家基因araH比对结果、图3-9为管家基因araJ比对结果、图3-10为管家基因endA比对结果、图3-11为管家基因galK比对结果、图3-12为管家基因leuA比对结果、图3-13为管家基因leuB比对结果、图3-14为管家基因leuC比对结果、图3-15为管家基因leuD比对结果、图3-16为管家基因leuE比对结果、图3-17为管家基因mtlA比对结果、图3-18为管家基因mtlD比对结果、图3-19为管家基因mtlR比对结果、图3-20为管家基因recA比对结果、图3-21为管家基因rpsL比对结果、图3-22为管家基因xylA比对结果、图3-23为管家基因xylB比对结果、图3-24为管家基因xylE比对结果、图3-25为管家基因xylF比对结果、图3-26为管家基因xylG比对结果、图3-27为管家基因xylH比对结果、图3-28为管家基因xylR比对结果。

图4为本发明实施方式公开的方法对大肠杆菌Stbl3基因工程菌与理论型大肠杆菌Stbl3进行DNA双序列比对的结果，其中：图4-1为管家基因araA比对结果、图4-2为管家基因araB比对结果、图4-3为管家基因araC比对结果、图4-4为管家基因araD比对结果、图4-5为管家基因araE比对结果、图4-6为管家基因araF比对结果、图4-7为管家基因araG比对结果、图4-8为管家基因araH比对结果、图4-9为管家基因araJ比对结果、图4-10为管家基因endA比对结果、图4-11为管家基因galK比对结果、图4-12为管家基因leuA比对结果、图4-13为管家基因leuB比对结果、图4-14为管家基因leuC比对结果、图4-15为管家基因leuD比对结果、图4-16为管家基因leuE比对结果、图4-17为管家基因mtlA比对结果、图4-18为管家基因mtlD比对结果、图4-19为管家基因mtlR比对结果、图4-20为管家基因recA比对结果、图4-21为管家基因rpsL比对结果、图4-22为管家基因xylA比对结果、图4-23为管家基因xylB比对结果、图4-24为管家基因xylE比对结果、图4-25为管家基因xylF比对结果、图4-26为管家基因xylG比对结果、图4-27为管家基因xylH比对结果、图4-28为管家基因xylR比对结果。

图5为工程菌Stbl3表型鉴定分型的结果。

具体实施方式

本发明提供一种鉴定工程菌Stbl3基因型的试剂盒，所述试剂盒包含使用多位点序列分型法检测Stbl3管家基因的物质，所述Stbl3管家基因选自mcrB、mrr、hsdS、recA、supE、ara、galk、lacY、proA、rpsL、xyl、leu、mtl和endA的一种或多种。

在一些具体实施方式中，所述ara基因选自araA、araB、araC、araD、araE、araF、araG、araH和araJ的一种或多种；

在一些具体实施方式中，xyl基因系列选自xylA、xylB、xylE、xylF、xylG、xylH和xylR的一种或多种。

在一些具体实施方式中，leu基因系列选自：leuA、leuB、leuC、leuD和leuE的一种或多种。

在一些具体实施方式中，mtl基因系列选自：mtlA、mtlD和mtlR的一种或多种。

优选地，所述检测Stbl3管家基因的物质为引物。

在一些具体实施方式中，所述引物的核苷酸序列如下：

mcrB-F 5'-ATTTCCTGTAAATAACCCCATGC-3'SEQ ID No.1、

mcrB-R 5'-ACCGGGAGCCTTCCACTGAC-3'SEQ ID No.2、

mrr-F 5'-TACCTTTCCGGGCAATGACCAC-3'SEQ ID No.3、

mrr-R 5'-CTGCTGTTCCAGGGCGTCCA-3'SEQ ID No.4、

hsdS-F 5'-AAATAATAAAAAGCGCACCGGAA-3'SEQ ID No.5、

hsdS-R 5'-GGCCGATTTGCAGCGTCA-3'SEQ ID No.6、

recA-F 5'-GATTCTGTCATGGCATATCCTT-3'SEQ ID No.7、

recA-R 5'-ATGAGCATACAGTATAATTGCTT-3'SEQ ID No.8、

araA-F 5'-AAAATCGCAGCGTGTAGGCCAG-3'SEQ ID No.9、

araA-R 5'-CGATGAGCGCCGAACAACACT-3'SEQ ID No.10、

araB-F 5'-TTTCCGGGCCATACAGATGCT-3'SEQ ID No.11、

araB-R 5'-AATCACGGCAGAAAAGTCCACA-3'SEQ ID No.12、

araC-F 5'-ACGGCAATGTCTGATGCAAT-3'SEQ ID No.13、

araC-R 5'-CAAACCCTATGCTACTCCGTCA-3'SEQ ID No.14、

araD-F 5'-CTTGAGTATAGCCTGGTTTCGTTT-3'SEQ ID No.15、

araD-R 5'-CGCGTCTTATCAGGCCTACAC-3'SEQ ID No.16、

araE-F 5'-CTCATTCCTCCCAGCAAACCAA-3'SEQ ID No.17、

araE-R 5'-TGCTGTTTCCGACCTGACACC-3'SEQ ID No.18、

araF-F 5'-AACTAATATCCGTCAGCGCCTT-3'SEQ ID No.19、

araF-R 5'-TTTGCCCTACACAAAACGACAC-3'SEQ ID No.20、

araG-F 5'-TGATCCCAGATACGCCCGAA-3'SEQ ID No.21、

araG-R 5'-TGAACCGCCAAAATTTACCGAA-3'SEQ ID No.22、

araH-F 5'-TCGGTTAACGGTTCTGTCACCC-3'SEQ ID No.23、araH-R 5'-CACTGAGCCTTGCGATGCCTA-3'SEQ ID No.24、araJ-F 5'-CAAAATGTGCCAGAACCGCGTA-3'SEQID No.25、araJ-R 5'-CGAATTATCTCTTGGCCTTGCT-3'SEQ ID No.26、galK-F 5'-TCAGCGTGACTACCATCCCT-3'SEQ ID No.27、galK-R 5'-TGCACGCGCACTTTTATCCG-3'SEQ IDNo.28、lacY-F 5'-CCTGCTCTTATTCTTTCGGTCA-3'SEQ ID No.29、lacY-R 5'-CGGTCGCTACCATTACCAG-3'SEQ ID No.30、proA-F 5'-TTGCCGTTCACCGTGATGACA-3'SEQ IDNo.31、proA-R 5'-ACGAATGCGCTGCTCTACCAAC-3'SEQ ID No.32、rpsL-F 5'-CCGGCAGAATTTTACGCTGACC-3'SEQ ID No.33、rpsL-R 5'-ATTCGGCGTCCTCATATTGTGT-3'SEQID No.34、xylA-F 5'-AATAACTTTTACGCCCGAGGTG-3'SEQ ID No.35、xylA-R 5'-TCTCTTCGAGGAATTACCCAGT-3'SEQ ID No.36、xylB-F 5'-TCTACCAGCGATACATTACGAG-3'SEQID No.37、xylB-R 5'-TCTGTTCGACAAATAACGGCTA-3'SEQ ID No.38、xylE-F 5'-CATTGTGCGCTTGATCATCGTC-3'SEQ ID No.39、xylE-R 5'-ACAATTCCAACATCAATGCACT-3'SEQID No.40、xylF-F 5'-ATTGTTTTCCCCTGTTTAGTTGC-3'SEQ ID No.41、xylF-R 5'-GCAGACGTTATCAATCGCCTT-3'SEQ ID No.42、xylG-F 5'-CTCCCGCCTCCTGACACC-3'SEQ IDNo.43、xylG-R 5'-AGCTGCAATCATCACGAAGACC-3'SEQ ID No.44、xylH-F 5'-CTTCCGAATTACCTGAAGTGCTC-3'SEQ ID No.45、xylH-R 5'-TACCTGCCGGTCATAGGCTT-3'SEQID No.46、xylR-F 5'-ACCTTCTGGCAGTATATCGTT-3'SEQ ID No.47、xylR-R 5'-GCCGCATCCGACAACCAC-3'SEQ ID No.48、leuA-F 5'-CGCCTGGGTCATCACTTCCG-3'SEQ IDNo.49、leuA-R 5'-CATTAAGCCAGCACGCAGT-3'SEQ ID No.50、leuB-F 5'-TACACAACGTGAGCGTCGAAC-3'SEQ ID No.51、leuB-R 5'-AACGCAAAGCTCAACACAACGA-3'SEQID No.52、leuC-F 5'-TTCATCCAGAAAACGCCAGT-3'SEQ ID No.53、

leuC-R 5'-CGATATCATTGCCCGCTA-3'SEQ ID No.54、

leuD-F 5'-CGGTTATTTCTGTTGTCGCATT-3'SEQ ID No.55、

leuD-R 5'-CCTCCACCAGCAACCGTA-3'SEQ ID No.56、

leuE-F 5'-GGTACGCCTGATAATTTGCAT-3'SEQ ID No.57、

leuE-R 5'-CCGCTACAGATTGGTTAGCAT-3'SEQ ID No.58、

mtlA-F 5'-CGCAGTATCTACAAGGTCCGGCTA-3'SEQ ID No.59、

mtlA-R 5'-TCCGGCCTACAAGAACGTGCAA-3'SEQ ID No.60、

mtlD-F 5'-CCTCACCCCAGCCCTCTCG-3'SEQ ID No.61、

mtlD-R 5'-TTGCGGAATACCTGAAGCACCA-3'SEQ ID No.62、

mtlR-F 5'-GATTTCCGGTCTTGATGCCAAC-3'SEQ ID No.63、

mtlR-R 5'-AGCGTGCCGTTATATCTACAAC-3'SEQ ID No.64、

endA-F 5'-CCGTCTATCGCTGTGTTCACT-3'SEQ ID No.65、

endA-R 5'-AAAATCCGCGTCGTCTCCC-3'SEQ ID No.66。

优选地，所述试剂盒还包含DNA聚合酶。前述聚合酶选自Taq酶或LTaq酶。优选地，所述Taq酶来源于TIAN Det PCR Kit。

优选地，所述试剂盒还包含聚合反应的缓冲液。优选地，所述缓冲液来源于TIANDet PCR Kit。

在一些具体实施方式中，所述试剂盒还包含特异性结合前述管家基因的探针。

本发明还提供一种工程菌Stbl3基因型的鉴定方法，所述鉴定方法使用前述试剂盒鉴定菌株。

在一些具体实施方式中，所述鉴定方法包括如下步骤：

1)单一菌落的菌株培养；

2)待测核苷酸片段扩增；

3)待测核苷酸片段测序；

4)测序结果比对。

前述鉴定方法中扩增参数如下：

I)预变性：94℃、3min、1cycle；

II)PCR反应：94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，35cycles；

III)彻底延伸：72℃、5min。

优选地，前述鉴定方法扩增的待测核苷酸片段用双脱氧法测序获得核苷酸序列。

在一些具体实施方式中，前述核苷酸序列与NCBI查询所得Stbl3管家基因对比，根据比对结果确定基因是否发生突变/变异，并以此为参照来快速鉴定工程菌基因型是否为Stbl3。

本发明还提供上述试剂盒在制备鉴定工程菌Stbl3产品的用途。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1多位点序列分型法鉴定大肠杆菌Stbl3基因工程菌的基因型流程

采用多位点序列分型法鉴定大肠杆菌Stbl3基因工程菌的基因型包括如下步骤：

(1)于超净工作台中酒精灯旁，全程无菌操作，用移液枪吸取50μl大肠杆菌Stbl3感受态细胞或大肠杆菌Stbl3基因工程菌转移到含有25μg/ml氯霉素的LB固体平板上；

(2)使用一次性无菌涂布棒将菌液均匀涂布于LB固体平板上；

(3)等LB固体平板上菌液完全吸收后，将其转移到37℃生化恒温培养箱中倒置培养14小时以长出单菌落；

(4)于超净工作台中酒精灯旁，全程无菌操作，用无菌牙签挑取LB固体平板上生长状态良好的单菌落，接种到含有25μg/ml氯霉素的LB液体培养基中；

(5)接种后将其置于37℃振荡摇床中160rpm培养14小时以使菌体充分生长繁殖；

(6)离心收集培养结束后的大肠杆菌Stbl3，离心机参数设置为4℃、4000rpm、15min；

(7)采用TIAN DNA Lyse Kit快速DNA提取试剂盒提取大肠杆菌Stbl3的基因组DNA；

(8)NCBI查询大肠杆菌Stbl3菌株的基因型为：F-mcrB mrr hsdS20(rB-,mB-)recA13supE44 ara-14galK2 lacY1 proA2 rpsL20(StrR)xyl-5λ-leu mtl-1endA1+；

(9)根据大肠杆菌Stbl3菌株基因型中各管家基因名称查询对应基因序列，其中ara基因系列包括araA/araB/araC/araD/araE/araF/araG/araH/araJ；xyl基因系列包括xylA/xylB/xylE/xylF/xylG/xylH/xylR；leu基因系列包括：leuA/leuB/leuC/leuD/leuE；mtl基因系列包括：mtlA/mtlD/mtlR；

(10)将管家基因全序列作为模板中心，以理论型大肠杆菌Stbl3基因组DNA作为参照，分别将管家基因序列上下游各延长200bp；

(11)采用TIAN Det PCR Kit快速DNA检测试剂盒PCR扩增管家基因内部片段序列，其中引物如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.66所示；

(12)提取的DNA模板用于PCR反应时的条件：

1)PCR反应液组成为：

2)PCR反应条件：

Step1：预变性：94℃、3min、1cycle；

Step2：PCR反应：94℃、30sec，55℃、30sec，72℃、1min，35cycles；

Step3：彻底延伸：72℃、5min。

(13)PCR扩增反应结束后，取10μl反应产物，琼脂糖凝胶电泳检测，电泳参数设置为120V、30min；

(14)电泳结束后，于凝胶成像仪中观察显带；

(15)采用TIANquick Mini Purification Kit超薄DNA产物纯化试剂盒纯化回收PCR产物；

(16)纯化所得的DNA溶液可用紫外分光光度计检测浓度与纯度；

(17)DNA应该在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA；

(18)OD260/OD280比值应为1.7-1.9；

(19)使用一代测序仪对纯化所得DNA进行双脱氧法测序，从上下游引物结合的目的DNA片段两端处分别向中间读取相应序列；

(20)使用ContigExpress软件，将带有重叠序列的两条测序序列拼接在一起形成最终完整的整体测序序列；

(21)进入NCBI官网BLAST在线比对系统，将拼接后完整的整体测序序列和NCBI查询所得理论基因序列进行DNA的双序列比对操作，根据比对结果确定基因是否发生突变/变异，以此为参照来快速鉴定工程菌基因型。比对结果如图3-1～3-28和图4-1～图4-28所示，大肠杆菌Stbl3感受态细胞及大肠杆菌Stbl3基因工程菌与理论型大肠杆菌Stbl3的基因型完全一致。

实施例2工程菌stbl3表型鉴定分型的结果

采用表型鉴定大肠杆菌Stbl3基因工程菌的基因型包括如下步骤：

(1)于超净工作台中酒精灯旁，全程无菌操作，用移液枪吸取50μl大肠杆菌Stbl3感受态细胞或大肠杆菌Stbl4感受态细胞转移到含有25μg/ml氯霉素的LB固体平板上；

(2)使用一次性无菌涂布棒将菌液均匀涂布于LB固体平板上；

(3)等LB固体平板上菌液完全吸收后，将其转移到37℃生化恒温培养箱中倒置培养14小时，观察生长情况。

对于抗性表型分型，不同种类的大肠杆菌依然能够具备相同的抗生素抗性。如图5所示，大肠杆菌Stbl3和大肠杆菌Stbl4均能够在含有氯霉素的固体LB平板培养基上生长，因此无法通过抗性分辨其种类。由此可得，通过抗性筛选来进行表型鉴定可能会存在误差，不具备权威性。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。