一种从千里光中提取化合物的方法及其应用

技术领域

本发明涉及有机物质提取技术领域，特别涉及一种从千里光中提取化合物的方法及其应用。

背景技术

由烟草花叶病毒(Tobacco mosa i c v i rus，TMV)引起的花叶病是烟草生产上分布最广、发生最为普遍的一类病害，除烟草之外，TMV还可以侵染番茄、辣椒、马铃薯等多种茄科植物，其寄主范围广，65科超过885种植物均可受其侵染，烟草及其他农作物感染TMV后，叶片叶绿素被破坏，光合作用减弱，生长受抑制，造成植株生长延缓，畸形、矮化，甚至死亡。目前在实践中只有少数抗病毒药物可用，几乎没有任何药剂可以完全有效的控制TMV。

而化学农药的滥用会导致及生态环境恶化和生物多样性水平降低等一系列问题，同时危害着人类的健康，而传统农艺措施对植物病毒病的防治效果甚微，投入也较高。因此开发高效、低毒的新型抗TMV药剂迫在眉睫。植物是活性化合物的宝库，其产生的次生代谢物超过40万种，其中不乏植物长期进化对抗外界病原物侵染的防御物质。从植物宝库中发掘高效、具有不同作用机制的抗TMV化学防御物质，是一条可行的开发植物病毒抑制剂的研究路线。

发明内容

本发明的目的是提供一种从千里光中提取化合物的方法及其应用，从千里光中分离出生物碱类化合物3-吲哚甲醛和单萜类化合物香茅醇的制备方法和在抗烟草花叶病毒药物应用，解决缺少高效、低毒的新型抗TMV药剂的问题。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种从千里光中提取化合物的方法，从千里光中提取化合物3-吲哚甲醛和香茅醇。

进一步的，包括如下步骤:

步骤一、以千里光地上部分为原料,干燥后粉碎，采用95％乙醇回流提取3次，减压浓缩至浸膏状；

步骤二、将乙醇提取物用蒸馏水溶解后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次得到萃取物，乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离；

步骤三、以石油醚～乙酸乙酯在体积比为50:1-1:1的范围内进行梯度洗脱，得到七个流份Fr1～Fr7；

步骤四、选取Fr6经硅胶柱层析，以石油醚～乙酸乙酯在体积比为30:1～2:1的范围内进行梯度洗脱，得到Fr6.1～Fr6.19；

步骤五、选取Fr6.17采用葡聚糖凝胶色谱划段，通过半制备液相色谱分析后用葡聚糖凝胶色谱纯化得到3-吲哚甲醛；

步骤六、选取Fr5采用MCI小孔树脂除色素，以甲醇～水在体积比为20％～100％的范围内进行梯度洗脱，90％部分采用葡聚糖凝胶色谱划段，经硅胶柱层析，以石油醚～乙酸乙酯在体积比为100:1～5:1的范围内进行梯度洗脱，得到香茅醇。

进一步的，步骤二中的硅胶粒度为100-200目。

进一步的，步骤五中，划段时所使用的葡聚糖凝胶色谱为体积比为1:1的氯仿～甲醇，纯化时所使用的葡聚糖凝胶色谱为甲醇。

进一步的，步骤六中所使用的葡聚糖凝胶色谱为甲醇。

本发明所述的化合物在制备抗烟草花叶病毒药物中应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明提出了从千里光中分离出生物碱类化合物3-吲哚甲醛和单萜类化合物香茅醇的制备方法和在抗烟草花叶病毒药物应用，经活性测试表明,3-吲哚甲醛对烟草花叶病毒初侵染的保护作用最强，香茅醇对感染TMV的心叶烟治疗作用最强，均高于阳性对照组宁南霉素的抑制率。3-吲哚甲醛和香茅醇结构简单,且具有较好的抗毒活性，提取分离和后续的人工合成容易实现可作为抗烟草花叶病毒的先导化合物，用于抗烟草花叶病毒药物制剂研发。

附图说明

图1是两种化合物心叶烟活体半叶枯斑法实验结果，左图为3-吲哚甲醛的保护作用，右图为香茅醇的治疗作用；

图2为间接EL I SA检测结果OD405值比较，阴性对照代表健康烟叶，阳性对照代表带毒烟叶。

具体实施方式

实施例，一种从千里光中提取化合物的方法，从千里光中提取化合物3-吲哚甲醛和香茅醇。

包括如下步骤:

步骤一、以千里光地上部分为原料,干燥后粉碎，采用95％乙醇回流提取3次，减压浓缩至浸膏状。

步骤二、将乙醇提取物用蒸馏水溶解后用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取三次得到萃取物，乙酸乙酯萃取物经硅胶柱色谱分离，硅胶粒度为100-200目。

步骤三、以石油醚～乙酸乙酯在体积比为50:1-1:1的范围内进行梯度洗脱，得到七个流份Fr1～Fr7。

步骤四、选取Fr6经硅胶柱层析，以石油醚～乙酸乙酯在体积比为30:1～2:1的范围内进行梯度洗脱，得到Fr6.1～Fr6.19。

步骤五、选取Fr6.17采用葡聚糖凝胶色谱划段，所使用的葡聚糖凝胶色谱为体积比为1:1的氯仿～甲醇，通过半制备液相色谱分析后用葡聚糖凝胶色谱纯化得到3-吲哚甲醛，所使用的葡聚糖凝胶色谱为甲醇。

步骤六、选取Fr5采用MCI小孔树脂除色素，以甲醇～水在体积比为20％～100％的范围内进行梯度洗脱，90％部分采用葡聚糖凝胶色谱划段，所使用的葡聚糖凝胶色谱为甲醇，经硅胶柱层析，以石油醚～乙酸乙酯在体积比为100:1～5:1的范围内进行梯度洗脱，得到香茅醇。

实验一：

1、实验方法

采用活体、离体半叶枯斑法、叶圆片法及间接EL I SA检测法测定化合物的抗TMV病毒活性，采取先施药、后施药和混合施药三种施药方式测定化合物的对TMV的保护作用、治疗作用和钝化作用。

(1)保护作用测定

将化合物稀释成50μg/ml，备用。挑选健康长势一致的心叶烟，每株挑选叶龄和叶片大小相似的3片上部叶片，用毛笔在所挑选叶片左半叶均匀摩擦施用供试化合物作为处理，右半叶摩擦施用相应浓度的DMSO溶液作为对照，并打孔做标记，以左半叶摩擦施用50μg/ml阳性药宁南霉素，右半叶摩擦施用相应浓度的DMSO溶液的处理作为阳性对照；6h后整片叶片用200-400目金刚砂摩擦接种TMV400倍稀释液。待叶片表面药液挥发后，用蒸馏水将叶片上残留的金刚砂冲洗干净，然后放在无虫温室培养，2-3天后，待枯斑症状明显时统计枯斑数，并按下列抑制率计算公式计算抑制率：

(2)治疗作用测定

挑选生长良好的心叶烟，挑3片中上部叶片。所挑选的叶片用200-400目金刚砂摩擦接种TMV400倍稀释液，间隔6h，接种过病毒的叶片左半叶均匀摩擦施用相应浓度的供试化合物作为处理，右半叶摩擦施用相应浓度的DMSO溶液作为对照，并打孔做标记；以叶片的一半摩擦施用相应浓度的宁南霉素，另一半摩擦施用相应浓度的DMSO溶液的处理作为阳性药对照，然后打孔作标记。待叶片表面的药剂干后，用蒸馏水将叶片表面的金刚砂冲洗干净，放回温室培养，待枯斑症状明显时统计枯斑数。按上述抑制率计算公式计算抑制率。

(3)钝化作用测定

供试化合物与TMV400倍稀释液充分混合，静置30mi n。期间挑选健康、叶片大小一致的心叶烟，挑3片中上部叶片。每片叶片均匀撒上200-400目的金刚砂，左半叶摩擦施用化合物与TMV400倍稀释液所混合成的溶液作为处理，右半叶摩擦施用相应浓度的DMSO与TMV400倍稀释液所混合成的溶液作为对照，然后打孔作标记；以左半叶摩擦施用阳性药宁南霉素与TMV稀释液的混合液，右半叶摩擦施用相应浓度的DMSO与TMV稀释液所混合成的溶液为阳性对照，并打孔作标记。待叶片表面的药剂挥干后，用蒸馏水将叶片表面残留的金刚砂冲洗干净，放在温室培养，2-3天后枯斑症状明显时统计枯斑数。按上述公式计算抑制率。

(4)心叶烟离体半叶枯斑法

采用心叶烟离体半叶枯斑法，测定化合物的抑制TMV增殖活性。挑选叶龄和叶片大小适中的3片中上部叶片，全叶摩擦接种TMV稀释液，接种病毒后间隔6h，将叶片剪下，减去叶片两端，并沿中脉将叶片剪成2个半叶，左半叶浸入盛有50ug/ml的单体化合物溶液的培养皿中作为处理，右半叶浸入盛有相应浓度的DMSO溶液的培养皿中作为对照。以左半叶浸入盛有宁南霉素的培养皿，右半叶浸入盛有相同浓度DMSO的培养皿的处理作为阳性对照；每个处理进行3次重复，放在恒温培养箱中培养，48h后，统计叶片表面的枯斑数量，按上述抑制率计算公式计算抑制率。

2.实验结果

由表1和图1可以看出3-吲哚甲醛对烟草花叶病毒初侵染的保护作用最强，香茅醇对其治愈作用最强，均高于阳性对照组宁南霉素的抑制率。EL I SA法检测结果显示，3-吲哚甲醛与香茅醇均有抑制烟草花叶病毒增殖的活性。

表1两种化合物的抗TMV活性结果

注：化合物浓度为50μg/mL；数据为3次重复取平均值；“-”表示无抑制作用，不同小写字母表示差异显著。

实验二：

1、实验方法

普通烟叶圆片法：将化合物用蒸馏水稀释到50ug/ml后，装入小型喷壶备用；挑选健康且生长良好的普通烟，整株烟苗的所有叶片均匀施药200uL；24h后，每株选取叶龄和叶片重量大小相似的上部烟叶1片，使用金刚砂摩擦接种50ug/ml TMV 200uL作为处理；阳性对照组整株烟不施药，接种50ug/ml TMV病毒的烟苗，阴性对照组烟苗接种50ug/mL DMSO溶液:10mi n后，用蒸馏水冲洗烟叶上的残留金刚砂，并置于无虫害温室中培育；3d、5d和7d后用打孔器分别取直径为1cm的叶圆片，每株每次取10个叶圆片放入离心管中，保存在-80°℃冰箱里备用，每个化合物做三次重复。

间接EL I SA检测法：

TMV多克隆抗体，由云南省农科院生物研究所提供。

①包被抗原:取叶圆片，加入Coat i ng buffer缓冲液2ml，充分研磨，12000r离心1mi n，取上清液，每孔加100uL，放置于37℃恒温箱中孵育2h。

②洗板:倒尽板上的溶液，用PBST洗板3-4次，每次3mi n。

③封闭:每孔加封闭液200uL(2％的牛血清蛋白)，于37℃恒温箱中30mi n。

④加抗体:倒尽封闭液，将稀释好TMV多克隆抗体(1/8000)加入EL I SA板中，每孔100uL，置于37℃恒温箱中孵育2h。倒尽板上的溶液，用PBST洗板3-4次，每次3mi n。

⑤加酶标抗体:每孔加入100uL稀释的酶标抗体(Ant i-rabb it，ab97048,1/5000),置于37C恒温箱中孵育2h。倒尽板上的溶液，用PBST洗板3-4次，每次3mi n。

⑥显色:将底物(4-N itrophny l phosphate d i sod i um sa lthexahydrate)溶于10％的底物缓冲液(D i ethano l ami ne)中，浓度为1mg/m l,每孔加100uL，室温避光显色15-30mi n,在波长405nm下读取OD值。

2.实验结果

由表2和图2可以看出，两个化合物的OD405值均大于阴性对照(健康烟叶)，且小于阳性对照(带毒烟叶)，因此两个化合物均可以抑制TMV增殖，且两个化合物的OD405值与宁南霉素相比无显著差异，说明两个化合物对TMV增殖的抑制活性与宁南霉素相当。化合物3-吲哚甲醛经鉴定为生物碱类化合物，化合物香茅醇为单萜类化合物，综上所述生物碱类化合物和萜类化合物为千里光中抗TMV的主要成分，两种化合物具有较好的抗毒活性，可作为抗烟草花叶病毒的先导化合物用于抗烟草花叶病毒药物制剂研发，在制备抗烟草花叶病毒药物中应用。

表2两种化合物间接ELISA法检测结果

注：阴性对照代表健康烟叶，阳性对照代表带毒烟叶。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。