对硝基苄基酯酶突变体、编码基因及应用

(一)技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种对硝基苄基酯酶突变体、编码基因，以及其在酶催化dl-薄荷酯的手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。

(二)背景技术

l-薄荷醇是常见的用于香精香料、化妆品和食品药品等领域的物质，具有兴奋、杀菌镇痛、止痒、芳香清凉等功能并且有的独特薄荷香气和清凉效果。l-薄荷醇每年的市场需求大，全球l-薄荷醇市场预计于2025年将达到14亿美金。

目前l-薄荷醇行业领域的主要供应商有Agson Global、德之馨、南通薄荷厂、高砂香料、天银化工、Arora Aromatics、安徽丰乐香料、Swati Menthol&Allied Chem、NecLife、Bhagat Aromatics、KM Chemicals、Silverline Chemicals、安徽银丰药业、巨帮香料、翔升香料(淮安)有限公司和巴斯夫等企业。市面上的l-薄荷醇主要分为天然l-薄荷醇和合成l-薄荷醇。随着生物技术的快速发展，其绿色环保且高效低成本的生产方式逐步吸引了人们视线，其中以生物酶法催化合成l-薄荷醇的绿色合成技术也被不断探索与完善。生物酶催化效率高、选择性高、反应条件温和、能耗低、无毒害，符合绿色的发展方向，因此以高性能生物酶为基础的生物法制备工艺具有重要的应用价值。

现有一个来源枯草芽孢杆菌的对硝基苄基酯酶，在水解dl-乙酸薄荷酯手性拆分制备l-薄荷醇中具备反应速率快，底物投料量大等优点，但是其催化的立体选择性不高，且需要添加助溶剂如正丁醇等来提高酶的催化速率和催化的立体选择性。因此需要对该酯酶进行定向改造，提高其应用性能。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种催化性能优异的对硝基苄基酯酶突变体、编码基因，以及其在酶催化dl-薄荷酯的手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种对硝基苄基酯酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的对硝基苄基酯酶第109位、110位、193位、270位、273位、314位或362位中2个以上的氨基酸残基进行组合突变获得。

本发明通过在109位、110位、190位、193位、270位、273位、314位、358位、362位和362位的10个氨基酸残基位点，构建小而精的组合突变文库，即三密码子饱和突变技术，并结合多轮的迭代突变和筛选而获得的优异突变体。

本发明利用计算机辅助分析软件将野生型对硝基苄酯酶与底物乙酸l-薄荷酯和乙酸d-薄荷酯分别进行了对接分析，筛选出关键的氨基酸残基位点，结果如图2所示，即活性口袋周围的10个氨基酸残基。这些氨基酸残基与底物存在非键相互作用，同时影响着活性口袋的形状大小。通过组合突变并优化这些残基，可达优化酶与底物相互作用的空间位置和非键相互作用，使得酶对特定底物(如乙酸l-薄荷酯)识别的选择性更强，从而提高酶对底物的立体选择性。

将上述选择的10个氨基酸残基分成三组，即A组(Y109、L110、F134)、B组(A190、M193、M358)和C组(I270、L273、L362、F363)，并按照如图3所示的方案构建3个小而精的文库。其中每个位点采用3种氨基酸进行替换突变，包括缬氨酸、蛋氨酸和酪氨酸，即每个位点进行三个氨基酸密码子的饱和突变。通过混合的简并引物，应用PCR扩增方法引入随机组合的突变，从而扩增得到混合突变片段。再将混合片段与表达质粒进行接连，然后，利用热激法将重组的混合质粒转化进感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，构建了三密码子饱和突变的文库。从文库中挑取一定数量的单菌落，转接液体LB培养基并诱导蛋白表达，分别得到含不同突变酶的发酵细胞。最后，将含突变酶的细胞与底物进行反应，通过气相色谱分析底物的转化率和产物的对映体过量值(ee值)，比较分析各个菌落对应的酶活和底物立体选择性，从而筛选得到文库中的优异突变酶。通过比较最初构建的A、B、C三个文库的突变株，筛选最优突变体，进行下一轮的其他组别的迭代突变文库的构建和筛选，依次迭代后，筛选突变酶的数量达到了目标10个位点的三密码子饱和突变的>95％以上的覆盖率，从而实现了目标位点的组合优化，获得最优突变体。

优选的，所述的突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3～6之一所示。所述的酯酶突变体包括四重突变体PNB-Y109M/L110Y/M193Y/F314Y(简称为PNB-MYYY)、五重突变体PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/F314Y(简称PNB-MYYMY)、五重突变体PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270Y/F314Y(简称PNB-MYYYY)、PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/L273V/F314Y/L362V(七重突变体,简称PNB-MYYMVYV)，对应的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示。

SEQ ID NO.2所示为野生型对硝基苄基酯酶(PNB)的氨基酸序列，其来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.17904(CN 110373366 A)。该酶可对dl-薄荷酯实现快速地手性拆分以制备l-薄荷醇。其催化反应的优点是其水解速率快，底物dl-薄荷酯投料量高等。但是，该酶催化过程中，需要有机助溶剂且酶催化的底物立体选择性偏低。本发明的技术方案是通过对野生型对硝基苄基酯酶PNB的底物结合口袋进行优化，即10个位点的组合突变优化改造，提高了酶的催化速率，同时显著提高其对底物的立体选择性，筛选得到的突变体水解dl-薄荷酯生成的l-薄荷醇的ee值>99％，表现出十分优异的立体选择性。

本发明还涉及编码所述对硝基苄基酯酶突变体的基因。

所述的酯酶突变体PNB-MYYY、PNB-MYYMY、PNB-MYYYY、PNB-MYYMVYV的编码基因，可以根据其氨基酸序列进行密码子优化后合成的基因序列，亦可从B.subtilis CGMCCNo.17904菌株基因组PCR扩增后突变改造后获得。优选的，所述编码基因核苷酸序列如SEQID NO.7～10之一所示。

本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体和基因工程菌。

本发明还涉及所述对硝基苄基酯酶突变体在酶催化dl-薄荷酯的手性拆分制备l-薄荷醇中的应用。

具体的，所述应用为：构建含有所述突变体编码基因的基因工程菌，以基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或菌体经破碎获得的含酶细胞为催化剂，对dl-薄荷酯进行水解，获得l-薄荷醇。

具体的，可将该酯酶突变体PNB-MYYY、PNB-MYYMY、PNB-MYYYY和PNB-MYYMVYV的基因克隆到表达质粒，并转化到宿主细胞中，经过诱导发酵制作成酯酶制剂后，用于催化dl-薄荷酯选择性水解制备l-薄荷醇。所述的表达质粒和宿主细胞，优选pET28a质粒和大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，即构建重组菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-PNB-MYYY、pET28a-PNB-MYYMY、pET28a-PNB-MYYYY、pET28a-PNB-MYYMVYV)。

优选的，所述dl-薄荷酯为dl-乙酸薄荷酯。本发明酯酶突变体，在无助溶剂体系下，催化水解1％～20％的dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇，其产物l-薄荷醇的ee

优选的，水解反应体系中，细胞密度为5～30OD(优选20OD)，dl-乙酸薄荷酯用量为1％～20％(w/w)(优选15％)，水解过程控制pH6.5～8.5(优选pH8.0)、温度25℃～40℃(优选30℃)。

优选的，所述水解在无溶剂条件下进行。

本发明的有益效果主要体现在：①本发明酯酶突变体无需添加助溶剂，酶催化活性维持较高水平；②在无助溶剂体系下，突变体酶催化的立体选择性较野生型显著提高，突变体酶的催化反应几乎不产生d-薄荷醇。将该突变体酶通过大肠杆菌过量表达后用于催化反应，并以10～200g/L的dl-乙酸薄荷酯为底物，进行水解拆分制备l-薄荷醇，结果表明l-乙酸薄荷酯底物转化率>95％，产物l-薄荷醇的ee

(四)附图说明

图1为野生型对硝基苄基酯酶的结构示意图。

图2为野生型酯酶PNB底物结合口袋周围的10个氨基酸残基位点示意图。

图3为三密码子饱和突变的小而精文库分组构建示意图。

图4为dl-乙酸薄荷酯、dl-薄荷醇标准样品的GC色谱图。

图5为酯酶突变体PNB-MYYY催化dl-乙酸薄荷酯水解拆分制备l-薄荷醇的催化反应液的GC色谱图。

图6为酯酶突变体PNB-MYYMY催化dl-乙酸薄荷酯水解拆分制备l-薄荷醇的催化反应液的GC色谱图。

图7为酯酶突变体PNB-MYYYY催化dl-乙酸薄荷酯水解拆分制备l-薄荷醇的催化反应液的GC色谱图。

图8为酯酶突变体PNB-MYYMVYV催化dl-乙酸薄荷酯水解拆分制备l-薄荷醇的催化反应液的GC色谱图。

图9为第一代文库中A组突变体库的初筛结果示意图。

图10为第一代文库中B组突变体库的初筛结果示意图。

图11为第一代文库中C组突变体库的初筛结果示意图。

图12为第二代文库中B-A组突变体库的初筛结果示意图。

图13为第二代文库中B-C组突变体库的初筛结果示意图。

图14为第三代突变库B-A-C的初筛结果示意图

(五)具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

LB培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L，溶剂为蒸馏水。

发酵培养基：酵母粉12.0g/L、蛋白胨15.0g/L、Na

pH 8.0磷酸缓冲溶液(200mmol/L)：Na

实施例1：酯酶PNB基因的诱导表达

酯酶PNB的诱导表达。将含有重组质粒的pET28a-pnbA的重组菌株E.coli IEF-PNB(参考CN113201516A)从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。按照0.5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，调整培养温度24℃，继续发酵8h，得到过量表达酯酶PNB的菌剂。

实施例2：酯酶PNB突变位点的设计和小而精突变文库的构建

为了提高酯酶PNB在无助溶剂体系下的底物立体选择性，采用计算机辅助设计的方法，选择PNB的关键突变位点。根据已报道枯草芽孢杆菌来源的酯酶晶体结构(PDB ID：1QE3)，对菌株B.subtilis CGMCC No.17904来源的酯酶PNB进行同源建模。利用蛋白质三维结构分析软件和分子对接软件，进行模拟分析。综合考虑酯酶与底物对接结果、酶的底物结合口袋特点、酶识辨底物立体选择的结构特点、酶的催化机制，最终确定10个氨基酸残基位点，分别为氨基酸序列SEQ ID NO:2的第109、110、190、193、270、273、314、358、362、363等10个位点。具体位置如图2所示(不同颜色表示不同的分组，绿色：A组；蓝色：B组；黄色：C组)，并将其分为A组(Y109、L110、F134)、B组A190、M193、M358)和C组(I270、L273、L362、F363)。

根据SEQ ID NO.1所示的野生型酯酶PNB的基因序列，分别设计A、B、C三组的三密码子饱和突变引物，见表1所示。三密码子对应的三个氨基酸分别是缬氨酸、蛋氨酸和酪氨酸。以载体pET28a-pnbA为模板，先进行包含突变位点的片段PCR扩增，随机引入突变；再以PCR产物作为引物之一，进一步扩增整个质粒，经过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小正确的扩增条带，即突变片段已融合到表达质粒中。用限制性内切酶DpnI酶消化处理已PCR融合的产物后，将该PCR产物进行一步克隆法进行连接反应，随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，涂布具有50μg/mL的卡那霉素的LB平板上，从而获得突变文库。

表1：用于三密码子饱和突变的引物

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实施例3：A、B、C组三个小而精突变体文库的筛选

将实施例2中获得的平板上的转化子转移到含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，摇床培养至对数生长中期。再按1％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，控制发酵温度24℃，继续发酵8h，得到诱导表达后的菌剂。

取培养好的含酯酶突变体的菌剂2mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于1mL的pH8.0的200mmol/L磷酸缓冲液中；加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化反应液用于GC分析。

文库libA、文库libB和文库libC中的突变体的酶活和底物立体选择性的筛选结果分别如图9、图10、图11所示。

通过比较底物立体选择性与酶的催化速率，挑选优秀突变株进行测序分析，结果得到突变株PNB-Y109V/L110V、突变株PNB-Y109M/L110M和突变株PNB-M193Y为第一代优选突变体。

实施例4：第一代优选突变体催化水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇的活性分析

分别按实施例1所述的方法，制备的含酯酶突变体PNB-Y109V/L110V、PNB-Y109M/L110M、PNB-M193Y的菌剂。每个菌剂12mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于6mL的pH8.0的200mmol/L磷酸缓冲液中。将重悬液分装6管，每管加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化6h，催化液用于GC分析。

第一代优选突变体的酶活和立体选择性的分析结果如表2所示，其中突变株PNB-M193Y对底物dl-乙酸薄荷酯的立体选择性最好，鉴定为第一代最优突变体，将其作为第二代文库迭代组合突变的模板酯酶。

表2：第一代优选突变体的复筛结果

催化液取样的GC分析方法：

1)样品的前处理：500μL催化反应液，加入到同等比例的乙酸乙酯混合萃取；12000×g离心1min，取上清有机相用于色谱分析。

2)气相色谱检测条件。色谱柱：安捷伦CYCLODEX-B 60m×0.250mm。升温程序：100℃，保持3min；2.5℃/min升温至145℃，保持1min；1℃/min升温至160℃，保持1min。检测器：FID检测器。产物l-薄荷醇出峰时间约33min，底物薄荷酯出峰时间约35min，dl-乙酸薄荷酯、dl-薄荷醇标准品的GC色谱图如图4所示，从左到右分别为d-薄荷醇、l-薄荷醇、l-乙酸薄荷酯、d-乙酸薄荷酯。

实施例5：第二代突变文库的设计和突变体的构建与筛选

为了进一步提高酯酶突变体PNB-M193Y的底物立体选择性，将其作为模板，继续进行第二代的迭代突变。PNB-M193Y筛选至一代文库B中，所以将以此为模板分别进行了A组和C组迭代文库的构建。文库构建方法如实施例3，从获得第二代迭代文库lib B-A和lib B-C。

分别将文库lib B-A和lib B-C的平板上的转化子转移到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，摇床培养至对数生长中期。再按1％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，控制发酵温度24℃，继续发酵8h，得到诱导表达后的菌剂。取培养好的含酯酶突变体的菌剂2mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于1mL的pH8.0的200mmol/L磷酸缓冲液中；加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化2h，催化液用于GC分析。

文库libB-A、文库libB-C的突变体的酶活和底物立体选择性的筛选结果分别如图12、图13所示。

通过比较各个菌落的底物立体选择性与酶的催化速率，挑选优秀突变株进行测序分析，结果得到突变株PNB-M193Y/F314Y、突变株PNB-M193Y/F314V、突变株PNB-L110Y/M193Y、突变株PNB-Y109V/L110V/M193Y、突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y和突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/F314Y为第二代优选突变体。

实施例6：第二代优选突变体催化水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇的活性分析

分别按实施例1所述的方法，制备的酯酶突变体PNB-M193Y/F314Y、PNB-M193Y/F314V、PNB-L110Y/M193Y、PNB-Y109V/L110V/M193Y、PNB-Y109M/L110Y/M193Y和PNB-Y109M/L110Y/M193Y/F314Y的菌剂。取各个菌剂12mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于6mL的pH8.0的200mmol/L磷酸缓冲液中；将重悬液分装6管，每管加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化6h，催化液用于GC分析。

第二代优选突变体的酶活和立体选择性的结果如表3所示，其中突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/F314Y对底物dl-乙酸薄荷酯的立体选择性最好，鉴定为第二代最优突变体，且用于第三代文库迭代组合突变的模板酯酶。

表3：第二代优选突变体的复筛结果

实施例7：第三代突变文库的设计和突变体的构建与筛选

为了进一步提高酯酶突变体PNB-Y109M/L110Y/M193Y/F314Y的水解活性，将其作为模板，继续进行第三代的迭代突变。PNB-Y109M/L110Y/M193Y/F314Y筛选至二代文库B-A中，所以将以此为模板进行了C组迭代文库的构建。文库构建方法如实施例3，从获得第三代迭代文库lib B-A-C。

将文库lib B-A-C的平板上的转化子转移到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，摇床培养至对数生长中期。再按1％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，37℃，培养2h；加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，控制发酵温度24℃，继续发酵8h，得到诱导表达后的菌剂。取培养好的含酯酶突变体的菌剂2mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于1mL的pH8.0的200mmol/L磷酸缓冲液中；加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化6h，催化液用于GC分析。

文库libB-A-C的突变体的酶活和底物立体选择性的筛选结果如图14所示。

通过比较底物选择性与酶的催化速率，挑选优秀突变株进行测序分析，结果得到突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/F314Y、突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270Y/F314Y、突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/L273M/F314Y和突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/L273V/F314Y/L362V为第三代优选突变体。

实施例8：第三代优选突变体催化水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇的活性分析

分别按实施例1所述的方法，制备的酯酶突变体

PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/F314Y、PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270Y/F314Y、PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/L273M/F314Y和

PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/L273V/F314Y/L362V的菌剂。分别取各个菌剂12mL，10000×g，5min离心收集细胞，将细胞重新悬浮于6mL的pH8.0的200mmol/L磷酸缓冲液中；将重悬液分装6管，每管加入20μL的dl-乙酸薄荷酯，在30℃、1200rpm条件下金属浴振荡催化10h，催化液用于GC分析。

第三代优选突变体的酶活和立体选择性的结果如表4所示，其中突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270Y/F314Y、突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/F314Y和突变株PNB-Y109M/L110Y/M193Y/I270M/L273V/F314Y/L362V突变体转化效率较高且对底物的对映体选择性一直在99％以上。

表4：第三代优选突变体的复筛结果

实施例9：PNB-MYYY突变株在水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇中的应用

酯酶突变株的诱导表达。将菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-PNB-MYYY)从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。将种子液按2％的接种量接入到含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的发酵培养基中，于37℃，200rpm摇床中培养4～6h后按5％的接种量接入到2.5L发酵罐中，在37℃进行发酵培养，当OD

离心收集菌体后，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液配置成细胞密度OD

表5：突变株PNB-MYYY在不同反应时长下的催化结果

实施例10：PNB-MYYMY突变株在水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇中的应用

酯酶突变株的诱导表达。将菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-PNB-MYYMY)从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。将种子液按2％的接种量接入到含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的发酵培养基中，于37℃，200rpm摇床中培养4-6h后按5％的接种量接入到2.5L发酵罐中，在37℃进行发酵培养，当OD

离心收集菌体后，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液配置成OD为20的全细胞催化体系160mL，倒入圆底烧瓶，于恒温水浴锅30℃条件下先孵育10min；加入40mL dl-乙酸薄荷酯。立即开启磁力搅拌混合均匀，记录反应开始并计时。在催化反应过程中，用2mol/L NaOH溶液调控反应pH8.0。反应液用于气相色谱分析，如图6所示，从左到右分别为d-薄荷醇、l-薄荷醇、l-乙酸薄荷酯、d-乙酸薄荷酯。不同反应时间下催化反应结果如表6所示，产物l-乙酸薄荷酯的ee

表6：突变株PNB-MYYMY在不同反应时长下的催化结果

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实施例11：PNB-MYYYY突变株在水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇中的应用

将菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-PNB-MYYYY)从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。将种子液按2％的接种量接入到含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的发酵培养基中，于37℃，200rpm摇床中培养4-6h后按5％的接种量接入到2.5L发酵罐中，在37℃进行发酵培养，当OD

离心收集菌体后，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液配置成OD为20的全细胞催化体系160mL，倒入圆底烧瓶，于30℃恒温水浴锅中先孵育10min，加入40mL dl-乙酸薄荷酯。立即开启磁力搅拌混合均匀，记录反应开始并计时。在催化反应过程中，用2mol/L NaOH溶液调控反应pH8.0。反应液用于气相色谱分析，如图7所示，从左到右分别为d-薄荷醇、l-薄荷醇、l-乙酸薄荷酯、d-乙酸薄荷酯。不同反应时间下催化反应结果如表7所示，产物l-乙酸薄荷酯的ee

表7：突变株PNB-MYYYY在不同反应时长下的催化结果

实施例12：PNB-MYYMVYV突变株在水解dl-乙酸薄荷酯制备l-薄荷醇中的应用

将菌株E.coli BL21(DE3)(pET28a-PNB-MYYMVYV)从保藏的甘油管中划线培养过夜后，取单菌落接种到含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm过夜培养。将种子液按2％的接种量接入到含有硫酸卡那霉素(50μg/mL)的发酵培养基中，于37℃，200rpm摇床中培养4-6h后按5％的接种量接入到2.5L发酵罐中，在37℃进行发酵培养，当OD

离心收集菌体后，加入pH8.0的磷酸盐缓冲液配置成OD为20的全细胞催化体系160mL，再倒入圆底烧瓶，于30℃恒温水浴锅中先孵育10min，再加入40mL dl-乙酸薄荷酯。立即开启磁力搅拌混合均匀，记录反应开始并计时。在催化反应过程中，用2mol/L NaOH溶液调控反应pH8.0。反应液用于气相色谱分析，如图8所示，从左到右分别为d-薄荷醇、l-薄荷醇、l-乙酸薄荷酯、d-乙酸薄荷酯。不同反应时间下催化反应结果如表8所示，产物l-乙酸薄荷酯的ee

表8：突变株PNB-MYYMVYV在不同反应时长下的催化结果

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