一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒

技术领域：

本发明属于微生物分子生态学检测领域，涉及一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法及检测试剂盒，用于环境古菌及复杂样本如珊瑚、海绵、海葵、海藻等生物共附生古菌多样性研究。

背景技术：

古菌作为最早的生命形式之一，广泛分布于各种环境或在生物体内共附生。古菌门类众多、多样性极其丰富，古菌在生物地球化学过程中至关重要，是地球上元素、物质和能量的重要驱动者。古菌是当前生物地球化学研究特点之一，其相关研究对阐明生命活动规律、揭示生命起源和物种进化、生物与生物或生境相互作用等具有重要意义。然而，由于古菌代谢机制和生长条件仍不完全清楚，迄今分离和纯培养的古菌种类并不多，相关研究受限制。纯培养古菌可以通过基因组、转录组、蛋白组、脂质组和代谢组等组学技术全面研究，对于非纯培养古菌DNA相关研究主要集中在宏基因组、基因文库(高通量测序文库、克隆文库等)、指纹图谱技术如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、实时PCR(Real-time PCR)、功能基因、原位研究和基于数据库的生物信息学分析等方面。虽然分子生物学技术的进步和大型数据库的建立为古菌研究提供了很多基础数据，但古菌研究仍存在诸多缺陷，如提取基因组DNA的质量、设计引物的局限会漏掉某些关键门类(即使是通用引物也存在片面性)，探针的特异性，PCR产物长度和区域、克隆效率等问题。

珊瑚礁是地球上生物多样性和初级生产力最高的生态系统之一，造礁石珊瑚是珊瑚礁生态系统中的“框架”生物，对于维持珊瑚礁生态系统的健康稳定以及物质循环和能量流通具有决定性作用。古菌在珊瑚礁生态系统的碳、氮及硫等生物地球化学过程中具有重要生态功能(

目前，古菌多样性研究主要在16S rDNA高通量测序，已报道文库构建的引物虽多但是通用性不强，无法扩增目前大型数据库(如GenBank、Silva、Greengene、RDP(ribosomalRNA data base project)等)中所有门类古菌。古菌具有特殊的性质，古菌在遗传信息传递上与真核生物相似，在代谢过程如产能等方面则与原核生物相近。因此，在复杂样本中古菌多样性研究除了缺乏通用性强引物扩增大多数古菌外，还易受其他生物特别是真核生物基因组干扰；而常规可扩增细菌和古菌的通用引物研究珊瑚这种复杂样本最终古菌序列占比远低与细菌，无法获得真实的古菌信息。基于上述问题，需要一种特异性强且灵敏高效地检测珊瑚等复杂样本中古菌多样性的方法，以获得更高古菌覆盖率和更真实的古菌多样性信息。

发明内容：

本发明的目的是针对现有16S rDNA高通量测序研究古菌多样性存在的问题，提供了一种引物通用性强且古菌信息覆盖率高的古菌多样性研究方法及快速检测试剂盒。

本发明提供了以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种快速检测古菌多样性的引物组，所述引物组包括Seq F1、Seq F2,Seq R1、Seq R2，具体如下所示：

Seq F1：5’-GCMCTAYGGKGYGCASCAGK-3’；如SEQ ID NO.1所示。

Seq F2：5’-XXXXXXGYMGCCRCGGKAAHAS-3’；

Seq R1：5’-TTCGGRSCRTRCNGACCTRCCG-3’；如SEQ ID NO.2所示。

Seq R2：5’-XXXXXXNYRTACTYCCCARGYRG-3’。

其中，简并引物代码分别是N(A,T,C,G)，M(A,C)，Y(C,T)，K(G,T)，S(G,C)，R(A,G)，W(A,T)，H(A,T,C)，B(G,T,C)。

优选，外围引物组包括上游引物Seq F1或Seq F2，下游引物Seq R1；内围引物组包括上游引物Seq F2和下游引物为Seq R2。

进一步，所述引物是通过化学合成的核苷酸片段。Index序列由6个碱基组成“XXXXXX”，用于识别各样本16S rDNA序列；同时满足以下条件：每组引物组Seq F2和Seq R2的Index序列不能相同、各组引物组Index序列可存在一端相同、各组引物组不能出现2个Index一致仅顺序不一致的情况。

本发明的第二个目的是提供一种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法，提取样本基因组总DNA，以上述引物组进行PCR反应，所述PCR反应包含2轮PCR反应的Nested PCR(巢氏PCR)或Semi-nested PCR(半巢氏PCR)。

优选，第一轮PCR时选取外围引物组为Seq F1和Seq R1，则第二轮Nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；或第一轮PCR外围引物组为Seq F2和Seq R1时第二轮Semi-nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；由于内围引物组相同，第二轮Nest PCR和Semi-nested PCR扩增产物一致。

优选，包括以下步骤：

步骤1，提取样本基因组总DNA；

步骤2，以样本基因组DNA为模板，第一轮PCR时选取外围引物组为Seq F1和SeqR1，第一轮PCR产物(稀释10～20倍)为模板进行第二轮PCR，第二轮Nested PCR使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；或以样本基因组DNA为模板，第一轮PCR外围引物组为Seq F2和SeqR1，第一轮PCR产物(稀释10～20倍)为模板进行第二轮Semi-nested PCR，使用内围引物组为Seq F2和Seq R2；

步骤3，第二轮PCR扩增产物切胶纯化、构建文库及测序；

步骤4，生物信息学及统计学分析。

进一步，所述步骤1提取样本基因组总DNA采用常规CTAB法或底泥DNA提取试剂盒。

进一步，第二轮Nested PCR或Semi-nested PCR扩增产物经纯化后可直接用于文库构建及测序。

进一步，所述的第一轮PCR反应体系包括：1×Ex Taq Buffer(Mg

进一步，所述的第一轮PCR程序为94℃-98℃5min；(94℃-98℃30s,65-68℃15-30s,72℃1min)×10-15cys；72℃5min。

进一步，所述的第二轮Nested PCR或Semi-nested PCR反应体系：1×Ex TaqBuffer(Mg

进一步，所述第二轮Nested PCR或Semi-nested PCR反应程序：94℃-98℃5min；(94℃-98℃30s,59-64℃15-30s,72℃30s)×20-25cys；72℃5min。

当第一轮PCR循环次数在10-15，第二轮PCR循环次数20-25，获得更高、更真实的古菌信息覆盖率，便于测序结果的生物信息学及统计学分析，确定珊瑚共附生古菌的群落结构和丰度、Alpha多样性和Beta多样性。

本发明的第三个目的是提供一种珊瑚共附生古菌多样性研究的试剂盒，包括上述引物组Seq F1、Seq F2,Seq R1、Seq R2，上述2轮PCR反应体系(DNA模板除外)及对应的程序。

本发明提供所述引物组和研究方法或试剂盒用于古菌多样性检测的用途，用于环境古菌及复杂样本如珊瑚、海绵、海葵、海藻等生物共附生古菌多样性研究。

与现有技术相比本发明具有以下优点：本发明既可同时检测到各门类古菌，又可有效屏蔽包括珊瑚、虫黄藻和各类真核生物、病毒和大部分细菌等影响，获得珊瑚共附生古菌门类显著增加；可用于底泥、水体等环境和各类生物样本，尤其适用于珊瑚、海绵、海葵、钙藻等生物共附生古菌研究。本发明能全面、准确、快速地研究古菌多样性，特异性强、灵敏度高、重复性好，且操作简单、样品保真性高、适用性广。

附图说明：

图1是三亚湾2种珊瑚共附生古菌和海水古菌16S rDNA第二轮Nest-PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果。M:Marker DL2000,PD1、PD2、PD3为鹿角杯形珊瑚春季样本，PD4、PD5、PD6为鹿角杯形珊瑚夏季样本，GF7、GF8、GF9是丛生盔形是春季样本，GF10、GF11、GF12为丛生盔形夏季样本，SW1、SW2、SW3为水体环境春季样本，SW4、SW5、SW6代表水体环境夏季样本。

图2是三亚湾2种珊瑚共附生古菌及海水古菌多样性组成柱形图。

图3是不同底泥样本基于16S rDNA的古菌群落结构及丰度柱形图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明进一步说明，而不是对本发明的限制。若未特别指出，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：

三亚湾不同季节2种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法。包括以下步骤：

1.通过化学合成用于古菌快速检测的2套引物组。引物分别为Seq F1,Seq F2,SeqR1,Seq R2所示序列。引物设计涵盖Silva和GenBank文库中古菌的科以内各分类单元代表性16S rDNA序列；设计既考虑引物通用性又考虑屏蔽珊瑚、虫黄藻等真核生物基因组及原核生物基因组影响。

Seq F1：5’-GCMCTAYGGKGYGCASCAGK-3’；

Seq F2：5’-XXXXXXGYMGCCRCGGKAAHAS-3’；

Seq R1：5’-TTCGGRSCRTRCNGACCTRCCG-3’；

Seq R2：5’-XXXXXXNYRTACTYCCCARGYRG-3’。

2.第一轮PCR时选取外围引物组为Seq F1(5’-GCMCTAYGGKGYGCASCAGK-3’)和SeqR1(5’-TTCGGRSCRTRCNGACCTRCCG-3’),或Seq F2(5’-XXXXXXGYMGCCRCGGKAAHAS-3’)和SeqR1(5’-TTCGGRSCRTRCNGACCTRCCG-3’)。第二轮Nested PCR或Semi-nested PCR选取内围引物组Seq F2和Seq R2(5’-XXXXXX NYRTACTYCCCARGYRG-3’)；其中，简并引物代码分别是N(A,T,C,G)，M(A,C)，Y(C,T)，K(G,T)，S(G,C)，R(A,G)，W(A,T)，H(A,T,C)，B(G,T,C)。

3.发明人于2020年5月和8月分别采集鹿角杯形珊瑚[Pocillopora damicornis(Linnaeus,1758)]和丛生盔形珊瑚[Galaxea fascicularis(Linnaeus,1758)]样本及水体环境样本，水体环境样本使用0.22μm滤膜过滤海水并收集滤膜获得，样本用酒精保存。样本编号分别为：PD1、PD2、PD3为鹿角杯形珊瑚春季样本，PD4、PD5、PD6为鹿角杯形珊瑚夏季样本，GF7、GF8、GF9是丛生盔形是春季样本，GF10、GF11、GF12为丛生盔形夏季样本，SW1、SW2、SW3为水体环境春季样本，SW4、SW5、SW6代表水体环境夏季样本。

4.常规的CTAB法提取样本基因组总DNA并用Nanodrop 2000分光光度计测定浓度。

5.第一轮PCR反应体系(50μL):10×Ex Taq Buffer(Mg

6.第二轮Nested PCR反应体系(50μL)：10×Ex Taq Buffer(Mg

7.1.2％琼脂糖凝胶电泳检测Nested PCR产物(4μL)，如图1目的条带单一，约400bp。剩余PCR产物(～2.0μg)用于目的条带纯化回收、文库构建(TruSeq DNA PCR-FreeSample Preparation Kit,Illumina,USA)及高通量测序(Illumina NoveSeq platform)，双端拼接序列质控后检索Silva数据库获得古菌OTUs物种注释，并做生物信息学分析。

8.结果表明检测出珊瑚共附生古菌含量丰富且多样性高。总序列包含古菌和细菌16S rDNA，本发明有效屏蔽了包括珊瑚、虫黄藻和原生动物等在内的真核生物及病毒的影响，获得古菌OTUs高达2316个。鹿角杯形珊瑚夏季古菌序列含量平均44.21％(PD4,PD5,PD6)较春季平均31.91％(PD1,PD2,PD3)显著增加；而丛生盔形珊瑚共附生古菌结构稳定、丰度相近(春季36.53％，夏季37.85％)；水体环境中古菌丰度在春季(27.08％)和夏季(49.07％)显著变化(表1)。多样性方面对比常规方法结果(2-3个古菌门)，本发明如图2所示获得珊瑚共附生古菌门类显著增加(除了初古菌的13个门，高达76个属)；鹿角杯形珊瑚和丛生盔形珊瑚的共附生古菌群落组成类似，优势古菌均为氨氧化古菌亚硝基菌纲(Nitrososphaeria)(63％以上)，但是鹿角杯形珊瑚相对于丛生盔形珊瑚共附生古菌群落结构可变性更强，与环境的水平转移更活跃。

表1珊瑚共附生古菌及水体环境古菌16S rDNA文库获得古菌序列占比情况

实施例2：

底泥古菌多样性研究方法。具体步骤如下：

1.采集不同环境底泥样本。底泥样本如下：ZJ1，ZJ2，ZJ3：2022年1月采集珠江口底泥样本(常温保存3个月)；ZJ4，ZJ5，ZJ6：上述珠江口新鲜底泥样本；D2，D3，D4：三亚湾珊瑚礁区底泥样本(-20℃保存2年)；D7，D8，D9：三亚湾珊瑚礁区底泥样本(-4℃保存3个月)；HF1，HF2，HF3，KRR，DZ：南海底泥样本(常温保存8个月)；L23：龙门山断层泥(常温保存18个月)。

2.使用MP

3.用引物组Seq F2和Seq R1对16S rDNA V3-V5区进行第一轮PCR扩增。以上述底泥基因组总DNA为模板，反应体系和程序参照实施例1“三亚湾不同季节2种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法”。

4.以第一轮PCR产物为模板，用引物组Seq F2和Seq R2对底泥古菌16S rDNA进行第二轮Semi-nested PCR扩增，获得产物纯化回收、文库构建、高通量测序、拼接序列的OTUs古菌物种注释及生物信息学分析均参照实施例1“三亚湾不同季节2种珊瑚共附生古菌多样性的研究方法”。

5.结果如表2所示，真实准确地反映古菌多样性信息。不同保存方式及保存时间的样本中检测到的古菌16S rDNA序列含量不同(18.20％-95.31％)，样品保真性高，所有底泥样本总共获得OTUs高达3012个。如图3所示引物通用性强且古菌信息覆盖率高，不同底泥样本含有丰富的古菌共13个门76个属水平分类单元，灵敏度高(含3条序列OTUs代表的属)；目前Silva大型数据库中古菌包含14个门；未检测的初古菌门(Korarchaeota)主要存在于极端热液区。

表2底泥样本古菌16S rDNA V3-V5区文库测序古菌占比情况

以上内容是结合优选技术方案对本发明所做的进一步详细说明，不能认定发明的具体实施仅限于上述说明。对于本领域普通技术人员来说，在不脱离本发明原理和构思的基础上，所获得的所有其他实施例或做出若干变型和改进等，都属于本发明的保护范围。