一种鬼臼毒素衍生物在治疗三阴性乳腺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及鬼臼毒素衍生物的制备及应用，具体涉及一种鬼臼毒素衍生物在治疗三阴性乳腺癌药物中的应用。

背景技术

鬼臼毒素是一种从鬼臼属植物的根和茎中提取到的天然芳基木脂素。早期，鬼臼毒素被用于治疗尖锐湿疣。后来，随着人们对鬼臼毒素的开发利用，发现它可用于治疗各种医学并发症，如淋病、肺结核、月经失调、银屑病、水肿、咳嗽、梅毒和性病疣等疾病。越来越多的研究表明，鬼臼毒素具有广谱、高效的抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗菌、神经毒性、免疫抑制、抗风湿、抗痉挛和降血脂活性。然而，鬼臼毒素在临床上具有胃肠毒性、神经毒性、脱发和骨髓抑制等不良副作用，因此，开发新型的毒副作用低、耐药性强的鬼臼毒素衍生物受到学术界的广泛关注。研究者在鬼臼毒素的C-4位引入糖基基团，最终开发出临床上使用的抗癌药物，即依托泊苷(Etoposide，VP-16)和替尼泊苷(Teniposide，VM-26)，这两种药物分别于1983年和1992年获得美国食品药品监督管理局批准，其中依托泊苷常用于治疗各种癌症，如小细胞肺癌、膀胱癌、乳腺癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、白血病和淋巴瘤。然而，依托泊苷和替尼泊苷在临床上仍有突出的局限性，包括毒副作用强、耐药性高和生物利用度差等缺陷，但是迄今为止，市场上除了依托泊苷、替尼泊苷和磷酸依托泊苷这三种鬼臼毒素衍生物外，仍然没有其他新的鬼臼毒素衍生物出现。因此，开发新型的鬼臼毒素衍生物仍具有很大的前景。

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，据2020年全球癌症数据统计显示，约有230万(11.7％)妇女被确诊患有乳腺癌，其中约136万(6.9％)名妇女死于乳腺癌。2013圣加伦国际乳腺癌大会中，研究者将乳腺癌分为luminal A型、luminal B型、HER2过表达型、基底样三阴性乳腺癌型及其他特殊乳腺癌亚型。三阴性乳腺癌(Triple Negative BreastCancer，TNBC)是一种特殊的乳腺癌亚型，其雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子受体2表达均为阴性，占已确诊乳腺癌的15％-20％。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC患者的生存时间较短，确诊后5年内的死亡率高达40％。TNBC具有高度转移性，据统计大约46％的TNBC确诊患者会发生远处转移，患者发生癌细胞转移后仅有约13个月的生存期。此外，TNBC还具有高复发性，患者在手术治疗后复发率高达25％，其他正常乳腺癌患者复发时间约为35-67个月，而TNBC患者仅为19-40个月，值得注意的是，患者复发后3个月内的死亡率高达75％。

TNBC患者个体差异明显，临床样本数据单薄，大多数关于TNBC的分型都是基于不同基因的mRNA水平，由于蛋白质在翻译过程中存在多种修饰和调节步骤，mRNA表达水平并不能准确反映蛋白质表达水平，这种缺陷极大的影响了患者的靶向治疗和术后预测。目前尚无有效的靶向治疗TNBC方法，可能需要多种治疗手段才能显著改善患者的预后。化疗是TNBC治疗的主要方法之一，临床上常通过药物联用的方式进行干预，紫杉烷和蒽环类药物的联合化疗是早期TNBC患者的标准治疗方法，但它在一定程度上增加了心脏死亡率、继发性白血病和骨髓增生异常综合征的风险，卡铂增加了中性粒细胞减少症和血小板减少症的发生率，而贝伐单抗会导致高血压、感染、血栓堵塞、出血和术后并发症事件。因此，开发新的治疗TNBC的药物刻不容缓。

发明内容

鉴于当前缺乏有效的TNBC治疗药物，本发明的目的是从一系列合成的鬼臼毒素类衍生物中筛选能治疗TNBC的化合物，包括能够显著抑制TNBC细胞增殖、迁移、侵袭以及诱导其凋亡。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

本发明提供一种鬼臼毒素类衍生物可用于治疗TNBC，该化合物为4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素或其药用盐，结构式为：

本发明涉及的4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素或其药用盐在治疗TNBC中的应用，具体的，4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素药用盐是指药学上可接受的盐，既包括与无机酸如磷酸、盐酸、硫酸形成的盐，也包括与有机酸如柠檬酸、洒石酸形成的盐。

本发明涉及的4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素或其药用盐在治疗TNBC中的应用，具体的，4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素或其药用盐能够抑制癌细胞增殖。

本发明涉及的4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素或其药用盐在治疗TNBC中的应用，具体的，4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素或其药用盐能够诱导癌细胞凋亡。

本发明涉及的4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素或其药用盐在治疗TNBC中的应用，具体的，4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素或其药用盐能够抑制癌细胞迁移。

本发明的有益效果：

本发明所述的化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素是从合成的一系列鬼臼毒素衍生物中筛选出的活性最高的化合物，且该化合物在TNBC中的活性从未有报道。

本发明所述的化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素能明显抑制乳腺癌细胞的增殖，且能诱导乳腺癌细胞发生显著的凋亡；划痕实验显示此化合物能抑制具有高迁移能力TNBC细胞的迁移。上述结果表明，本发明所述4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素具备较好的抗TNBC活性，在今后TNBC的治疗方面具备潜在的应用价值

本发明所述的化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素，制备容易，具有潜在的药物开发前景。

本发明所述的化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素可作为TNBC药物开发的先导化合物，有可能通过进一步结构改造开发出活性更高的抗乳腺癌药物，并且可能应用于其他癌症的治疗。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是Hoechst 33258染色法检测化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素对TNBC细胞核形态的影响示意图。

图2是化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素的激活凋亡相关蛋白的变化示意图。

图3是化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素对TNBC细胞MDA-MB-231迁移的影响示意图(比例尺：250μm，***p<0.001vs Con)。

图4是化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素对TNBC细胞MDA-MB-468迁移的影响示意图(比例尺：250μm，*p<0.05，***p<0.001vs Con)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：MTT法测定4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素对癌细胞的生长抑制作用

(1)接种细胞

取生长状态良好汇合度达到90％的细胞进行细胞传代，收集细胞沉淀，配制成单细胞悬液，细胞计数后按照合适的细胞密度(1000-10000个/孔)将细胞接种到96孔板中，每孔加入100μL单细胞悬液，每组设置3个复孔，镜下观察细胞状态后放入CO

(2)加药处理

细胞贴壁24h后，根据细胞对不同药物的敏感程度，设置合适的药物浓度梯度，根据药物配方配置不同浓度的药物培养基，取出96孔板，弃上清，按顺序加入不同浓度的药物培养基，每组设置3个复孔，并设置空白对照，镜下观察观察细胞状态后继续放在CO

(3)MTT检测

待药物孵育70h后，每孔加入10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，镜下观察观察细胞状态后继续放在CO

(4)数据分析

根据公式：抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100计算不同药物浓度下细胞生长的抑制率，用GraphPad Prism 8软件计算药物在细胞中的半抑制浓度(IC50)。

利用MTT方法对4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素进行筛选，结果如表1所示。4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素具有较好的抗癌活性，能在nM水平显著抑制乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231、肺癌细胞A549以及肝癌细胞HepG2的生长，且该化合物对TNBC细胞MDA-MB-231的半数抑制浓度最小。为进一步验证4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素对TNBC细胞的生长抑制作用，我们采用MTT方法检测了该化合物对另一株TNBC细胞MDA-MB-468的影响，结果显示4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素同样能在nM水平显著抑制MDA-MB-468细胞的生长，IC50值为0.07±0.01μM，上述结果说明4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素可明显抑制TNBC细胞的增殖。

表1 4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素对不同癌细胞的IC50值(μM±SD)

实施例2：化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素对TNBC细胞凋亡的影响

癌症的发生大多都是由于细胞凋亡受阻引起的，因此促进癌细胞凋亡有助于癌症的治疗。为了进一步探究4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素的抗肿瘤机制，我们首先采用Hoechst 33258染色法检测该化合物是否能够诱导TNBC细胞发生凋亡。

(1)接种细胞

取洁净的盖玻片于无水乙醇中浸泡5min，用镊子将盖玻片取出，小心过火以控干盖玻片上残留的无水乙醇，将灭过菌的盖玻片放置6孔板中。取生长状态良好的细胞进行细胞传代，胰酶消化后收集细胞沉淀，配制成单细胞悬液(MDA-MB-231：2.5×10

(2)加药处理

待TNBC细胞贴壁24h后，用化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素(MDA-MB-231：0nM、20nM、40nM、60nM；MDA-MB-468：0nM、30nM、60nM、90nM)处理细胞24h。

(3)Hoechst染色

加药24h后，取出6孔板，观察给药后的细胞状态。弃去旧培养基，用PBS洗涤3次，每次3min；加入500μL固定液，固定15min；弃去固定液，用PBS洗涤3次，每次3min；加入500μL染色液，避光染色5min；弃去染色液，用PBS洗涤3次，每次3min，所有步骤均在慢速摇床上进行。

(4)倒置荧光显微镜观察拍照

在避光条件下，滴一滴抗荧光衰减封片剂于载玻片上，用镊子小心取出6孔板中的盖玻片，将盖玻片贴壁细胞一面倒扣在载玻片上，让细胞充分接触抗荧光衰减封片剂，在此过程中避免产生气泡，随后在倒置荧光显微镜下观察细胞核变化情况并拍照记录(20×)。

结果发现(如图1所示)，在TNBC细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468中，随着化合物浓度的增加，细胞数目呈剂量依赖性减少，同时细胞核发生形态学变化，与对照组相比，加药组的细胞核逐渐皱缩，碎裂，亮蓝色光明显增多，表现出细胞凋亡过程中典型的核变化特征。上述实验结果表明，化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素能有效地诱导三阴性乳腺癌细胞发生凋亡。

在此基础上，我们进一步通过免疫印迹技术从分子水平验证4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素的凋亡诱导作用。具体步骤如下：

MDA-MB-231细胞经不同浓度的化合物处理24h后，用SDS裂解液提取细胞中的总蛋白，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白进行分离，然后通过转膜过将胶中蛋白印迹到硝酸纤维素膜上，用5％脱脂牛奶室温封闭1h后，将膜进行一抗4℃孵育过夜，随后，用含1‰的吐温-20的TBS(TBS-T)溶液洗涤3次，每次5min，接着进行二抗孵育，室温2h，TBS-T洗涤3-5次后，最后通过高灵敏度化学发光检测试剂盒进行显影从而得到目的蛋白条带。

结果如图2所示，化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素处理MDA-MB-231细胞后可激活经典的凋亡相关分子PARP、caspase-3、caspase-8和caspase-9蛋白，表现为PARP、caspase-8和caspase-9蛋白表达量下调，而相应切割条带cleaved PARP、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8和cleaved caspase-9蛋白表达量呈剂量依赖性递增，结合Hoechst 33258染色结果，进一步证明4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素引起TNBC细胞发生凋亡，且其凋亡诱导作用与caspase激活有关。

实施例3：划痕实验法检测化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素对TNBC细胞迁移的影响

(1)接种细胞

提前用记号笔在6孔板底部画三条水平横线以确保后续拍照位置相同。取对数生长期细胞进行细胞传代，收集细胞沉淀，配制成单细胞悬液，细胞计数后按照合适的细胞密度(MDA-MB-231：5.0×10

(2)划线

次日，镜下观察到细胞铺满整个皿底(融合度为100％的单层细胞为宜)，取200μL规格的移液器枪头准备划线，划线轨迹保持垂直于三条水平横线，沿着灭菌的直尺由一端划向另一端，呈“|”型，此时可在细胞表面观察到清晰的划痕印迹，弃去旧培养基，用PBS洗涤多次以除去划痕时脱落的细胞，镜下观察细胞状态并拍照保存，作为0h对照组，记录拍摄区域(划线与定位线相交点上方或下方区域)以便下次观察。注意：使用移液器枪头划线时需始终保持垂直于细胞表面且为同一个枪头。

(3)加药处理

为了减少细胞增殖引起的假阳性结果，降低细胞增殖对实验结果的影响，用低血清培养基(2％ FBS)配置相应浓度药物(MDA-MB-231：0nM、20nM、40nM、60nM；MDA-MB-468：0nM、30nM、60nM、90nM)，48h后观察处理组和对照组迁移能力差异并拍照。

(4)光学显微镜观察拍照

48h后观察划痕愈合情况，弃去旧培养基，用PBS清洗3次，找到0h对照组标记位置并拍照记录，保存图片为Tif格式。

(5)数据分析

用Image J软件计算划痕面积，细胞迁移率(％)＝(对照组面积-实验组面积/对照组面积)×100，每组实验独立重复3次，结果用GraphPad Prism 8软件作图并进行统计学分析。

如图3和图4所示，对照组的划痕宽度随着时间的延长逐渐变窄，而在48h的条件下，加药组随着浓度的递增显著抑制了划痕的愈合，呈剂量依赖性。定量分析结果表示，MDA-MB-231细胞在60nM时，相对迁移率为19.84％，而MDA-MB-468细胞在60nM时，相对迁移率为34.37％，90nM时，相对迁移率为15.82％，且与对照组相比具有显著的统计学差异(***p<0.001vs Con)。以上实验结果表明，化合物4α-(呋喃-2-甲酰基哌嗪基)-4-脱氧-鬼臼毒素能够显著抑制TNBC细胞的迁移。

以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。