信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针及其制备与应用

技术领域

本发明属于分子生物领域。更具体地说，本发明涉及一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针及其制备与应用。

背景技术

汞不能通过生态系统的自我调节来降解，而是通过食物链等形式不断积累流传，最终进入人体，再跟着血液流动流向全身。汞对人体神经系统、肾、脑组织等具有严重的影响和危害。汞离子进入人体造成中毒后，会表现出神经衰弱、中毒性脑病、汞毒性震颤等症状。因此，找到一种简单、快速、选择性好、灵敏度高等的Hg

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)在20世纪60年代初由OsamuShimom ura首次从水母Aequorea victorea中发现并分离，后因其具有生理稳定性和新颖的荧光特性而被广泛研究。绿色荧光蛋白由238个氨基酸残基组成，分子质量约为27kDa。GFP由11条β-折叠链围成，外形呈圆柱桶状，在桶的中心穿过一条α-螺旋，在α-螺旋上有可发光的发色团被α-螺旋固定在桶的正中心。发色团包含第65、66、67位氨基酸(Ser65-Tyr66-Gly67)。GFP的最大激发光波长约486nm，最大发射光波长约506nm，当有足够能量激发时，发色团将会发出绿色荧光。增强型绿色荧光蛋白(enhanced GFP，EGFP)由GFP经过氨基酸突变而得，突变氨基酸为F64L S65T。EGFP较GFP来说，发色团成熟得更快，荧光更强。EGFP的荧光光谱具有一定的稳定性，几乎不受环境、附加分子等影响，是应用最广泛的荧光蛋白之一。

目前，利用绿色荧光蛋白检测汞离子已有大量的研究报道，如CN110241064A-一种用于汞离子检测的核酸蛋白复合物变构型微生物全细胞传感器的构建及其应用、CN101921724A-一种用于监测环境中Hg

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针，其能够利用增强型绿色荧光蛋白的203位和205位半胱氨酸残基与Hg

为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针，为下列氨基酸序列之一：

1)具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列；

2)SEQ ID No.1经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有与汞离子结合能力以及绿色荧光特性的氨基酸序列。

一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的制备方法，将增强型绿色荧光蛋白发色团附近的203位、205位氨基酸突变为能与Hg

优选的是，信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的制备方法，包括以下步骤：

1)利用引物扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列；

2)将DNA序列与质粒pET30a连接，构建EGFP-pET30a表达载体；

3)利用PCR技术对载体EGFP-pET30a进行突变扩增，扩增产物与DpnI酶反应去除模板质粒，取酶切获得的突变质粒转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆送去测序，获得正确突变的表达载体，利用正确突变的表达载体在工程菌中表达，获得信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针。

一种试剂盒，包含上述信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针。

一种信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针在汞离子检测中的应用。

一种编码信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的核苷酸序列，为下列核苷酸序列之一：

1)具有SEQ ID No.2所示核苷酸序列；

2)编码SEQ ID No.1经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有与汞离子结合能力以及绿色荧光特性蛋白的核苷酸序列。

一种编码信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤：

1)利用引物扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列；

2)将DNA序列与质粒pET30a连接，构建EGFP-pET30a表达载体；

3)利用PCR技术对载体EGFP-pET30a进行突变扩增，扩增产物与DpnI酶反应去除模板质粒，取酶切获得的突变质粒转化至大肠杆菌，筛选阳性克隆送去测序，获得正确突变的表达载体，即获得编码信号增强型检测汞离子的荧光蛋白探针的DNA。

一种表达载体，包括载体质粒和与载体质粒操作性连接的编码上述氨基酸序列的核苷酸序列或者上述核苷酸序列，所述表达载体包括原核表达载体、真核表达载体或病毒载体。

一种宿主细胞，其特征在于，包含上述的表达载体。

本发明至少包括以下有益效果：本发明通过对EGFP生色团附近的氨基酸进行突变，将EGFP改构成对Hg

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明EGFP-pET30a表达载体构建流程图；

图2为EGFPT203CS205C结合Hg

图3为片段EGFP的PCR扩增凝胶图谱；

图4为pET30a质粒和EGFP片段的限制性酶切凝胶图谱；

图5为重组质粒EGFP-pET30a的PCR鉴定图；

图6为EGFP T203C S205C诱导表达的SDS-PAGE分析图；

图7为EGFP与EGFP T203C S205C在不同浓度Hg

图8为生物传感器对不同浓度Hg

图9为改构的EGFP对单一金属的选择性试验结果图；

图10为改构的EGFP对混合金属的抗干扰能力试验结果图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明通过对EGFP生色团附近的氨基酸进行突变，将EGFP改构成对Hg

1、试验材料

1.1试验所用质粒和菌株

表1实验所用质粒与菌株

1.2试验所用引物

表2实验所用引物

1.3化学试剂

表3实验试剂

2、试剂配方

2.1液体Luria Bertina(LB)培养液(100mL)

称量：胰蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、NaCl 1g于锥形瓶中，用量筒量取100mLMilliQ H

2.2固体(LB)培养液(200mL)

称量：琼脂粉4g、胰蛋白胨2g、酵母提取物1g、NaCl 2g于试剂瓶中，用量筒量取200mL MilliQ H

2.3 40％丙烯酰胺(29：1)(300mL)

称取：C

2.4 5％堆积胶

配制10mL：40％丙烯酰胺(29：1)1.25mL、10％SDS 100μL、2mol/LTris·HCl(pH＝6.8)0.63mL、MilliQ H

配制20mL：40％丙烯酰胺(29：1)2.5mL、10％SDS 0.2μL、2mol/LTris·HC(pH＝6.8)1.26mL、MilliQ H

配制250mL：40％丙烯酰胺(29：1)31.25mL、10％SDS 2.5μL、2mol/LTris·HCl(pH＝6.8)15.75mL、MilliQ H

2.5 1％琼脂糖凝胶(200mL)

称量：琼脂糖2g，量取：50×TAE 4mL，再进行定容至200mL，在微波炉以中火进行加热，让其能够完全溶解，冷却待用。

2.6脱色液(1L)

量取：无水乙酸70mL、100％乙醇100mL，加入MilliQ H

2.7 50×TAE电泳缓冲液

称量：Tris碱242g，加入一定量MilliQ H

2.8 10×SDS电泳缓冲液(1L)

称量：SDS10g、甘氨酸188g、Tris碱32.2g，加入一定量MilliQ H

2.9 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(1L)

称量：KH

3、试验内容

3.1 EGFP-pET30a表达载体的构建

本发明利用基因工程手段，按照图1所示步骤构建EGFP-pET30a表达载体。概述如下：首先利用PCR技术，使用上游引物(EGFP EF)和下游引物(EGFP BaR)，将EGFP基因片段进行大量扩增。将得到的片段EGFP与质粒pET30a用限制性内切酶(EcoR I和BamH I)进行双酶切，然后在T4 DNA连接酶的作用下将EGFP片段和质粒pET30a进行连接，实现EGFP-pET30a表达载体的构建。

3.1.1目的基因片段EGFP的PCR扩增

通过PCR技术大量扩增目的基因片段EGFP。主要内容为：以EGFP基因片段为模板，加入上述引物、DNA聚合酶(反应体系如表4所示)，通过PCR技术三步骤即变性、退火、延伸来实现基因的扩增(反应程序如表5所示)。得到扩增产物后通过琼脂糖凝胶电泳实验对其进行鉴定，切胶回收目的条带。

表4基因EGFP的PCR反应体系

表5基因EGFP的PCR反应程序

3.1.2目的基因片段EGFP和质粒pET30a的双酶切

将目的基因片段EGFP和质粒pET30a用限制性内切酶(EcoR I和BamH I)进行双酶切(反应体系如表6所示)。将反应体系于37℃恒温反应10min，通过琼脂糖凝胶电泳实验对双酶切后的产物进行鉴定，并切胶回收得到的目的条带。

表6基因EGFP和质粒pET30a的双酶切反应体系

3.1.3目的基因片段EGFP和质粒pET30a的连接与转化

通过连接反应将目的基因片段EGFP构建至质粒pET30a中，实现EGFP-pET30a表达载体的构建(反应体系如表7所示)。然后将其于16℃恒温过夜，再取少量连接产物进行转化。然后在37℃恒温过夜培养后，利用PCR进行鉴定，将鉴定正确的单克隆放于3mL含抗性的液体LB中过夜培养，然后送去测序。用测序正确的载体EGFP-pET30a进行后续实验。

表7基因EGFP和质粒pET30a连接反应体系

3.1.2 EGFP T203C S205C-pET30a突变体的构建

利用定点突变技术，将EGFP发色团周围203、205位氨基酸定点突变为能与Hg

表8 EGFP-pET30a的突变PCR反应体系

表9 EGFP-pET30a的突变PCR反应程序

表10 EGFP-pET30a基因突变酶切反应体系

3.1.3生物工程菌的体内培养与收集

(1)用接种环从划线的固体LB培养基上挑取含有最终构建EGFP T203CS205C-pET30a表达载体的单菌落，置于含抗生素的液体LB中进行接种，将摇床温度调节为37℃，然后放入接种好的液体LB，培养12-16h。

(2)往液体LB中加入一定量的抗生素，再将过夜培养好的菌液和含有抗生素的液体LB按一定的比例(1：100)混合后放入摇床，在37℃、250rpm条件下扩大培养1h 40min，直至OD

(3)向上述扩大培养好的菌液中加入25μL 0.1mmol/L的IPTG后于20℃、225rpm恒温培养8h，诱导蛋白表达。

(4)将所得菌液用液体LB调节OD

(5)分别将10mL 10mmol/L的PBS加入离心得到的细菌中，然后再次进行离心(9000rpm，4℃，4min)，然后去掉上清液，重复一次此操作。

3.1.4生物传感器的SDS-PAGE鉴定

用0.25mmol/L的IPTG对蛋白分别诱导0，0.5，1，2，4，6小时后，取样进行SDS-PAGE分析。

3.1.5生物传感器检测Hg

分别对未突变的EGFP与突变后的EGFP T203C S205C做表征实验，即将不同浓度的Hg

3.1.5.1检测Hg

为检测对Hg

3.1.5.2检测Hg

在细菌培养液中分别加入Hg

3.1.5.3检测Hg

为了检测生物传感器对Hg

4、实验分析

4.1生物传感器的设计

如图2所示，绿色荧光蛋白(GFP)呈圆柱桶状，在桶的中心穿过一条α-螺旋，在α-螺旋上有可发光的发色团被α-螺旋固定在桶的正中心。发色团包含第65、66、67位氨基酸(Ser65-Tyr66-Gly67)。当有足够的能量激发时，发色团将会发出绿色荧光。以GFP为基础，通过突变第64、65位氨基酸可得到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，EGFP较GFP来说，有着荧光更强、更稳定的特点。可说明EGFP比GFP更有开发成生物传感器的潜力。

本发明中，将EGFP发色团周围的氨基酸进行突变，突变为为能与Hg

4.2荧光蛋白表达载体的鉴定

4.2.1目的基因片段EGFP的PCR扩增结果

利用PCR扩增技术将目的基因片段EGFP进行扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图3，可在此电泳图的泳道1中看到，有一条明显的条带位于750bp附近，与EGFP(717bp)的基因片段大小基本相符，说明PCR扩增成功。

4.2.2目的基因片段EGFP和质粒pET30a的双酶切结果

将目的基因扩增产物切胶回收后与质粒pET30a在限制性内切酶(EcoR I和BamHI)作用下进行双酶切，再进行琼脂糖凝胶电泳实验鉴定。如图4所示，可看到泳道1、2分别在5000bp、750bp附近有明显的单条带，与质粒pET30a(5400bp)、EGFP(717bp)基本相符，说明质粒pET30a与EGFP片段酶切成功。

4.2.3载体EGFP-pET30a的构建结果

切胶回收酶切片段EGFP和质粒pET30a后，在T4 DNA连接酶的作用下，将片段EGFP与质粒载体pET30a进行连接。利用PCR去鉴定连接后得到的产物，如图5所示，结果表明EGFP片段成功构建到pET30a载体EcoR I和BamH I的酶切位点间。且经测序证明，EGFP片段成功构建到pET30a载体EcoR I和BamH I的酶切位点间，构建过程未发生突变。

4.3生物传感器的SDS-PAGE鉴定

用0.25mmol/L IPTG对蛋白分别诱导0，0.5，1，2，4，6小时后，取样对EGFP T203CS205C突变体进行SDS-PAGE鉴定分析。如图6显示，加入IPTG后，可以观察到EGFP T203CS205C突变体的表达条带，随着时间增加表达量也有明显增加，且在SDS-PAGE凝胶上接近理论值(计算出的蛋白分子量＝26.8kDa)，表明IPTG可成功诱导EGFP T203C S205C突变体的表达。

4.4生物传感器检测Hg

将未突变的EGFP与突变后的EGFP T203C S205C分别与不同浓度的Hg

4.4.1检测Hg

将不同浓度的Hg

此外，如图8b所示，在3-10μM范围内，荧光信号与Hg

4.4.2检测Hg

将Hg

4.4.3检测Hg

将Hg

<实施例1>

一种试剂盒，包含如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白。

<实施例2>

一种表达载体，包括载体质粒和与载体质粒操作性连接的编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列或者如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列，所述表达载体包括原核表达载体、真核表达载体或病毒载体。

<实施例3>

一种宿主细胞，其特征在于，包含实施例2的表达载体。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。