双功能萜合酶及其突变体以及催化产物

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其是涉及双功能萜合酶及其突变体以及催化产物。

背景技术

萜合酶是萜类化合物生物合成途径中一类重要的酶，负责将萜类线性前体环化形成具有不同环系及对映立体中心的结构。萜合酶复杂精密的催化决定了萜类化合物丰富多样的结构骨架。萜类化合物是自然界数量最庞大、种类最多、结构最为丰富的次级代谢天然产物，萜类化合物结构的复杂性和多样性，使其具备了广泛的生物活性。萜类化合物中不乏许多著名药物分子，如抗疟疾的青蒿素，抗肿瘤的紫杉醇，抗肝炎药物甘草酸等。

双功能萜合酶主要来源于真菌，同时具有异戊烯基转移酶(prenyltransferase,PT)结构域和萜类环化酶(terpene cyclase,TC)结构域，因此兼具萜类合成前体二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(isopentenyldiphosphate,IPP)首尾相连和环化的双重功能。目前为止，真菌来源双功能萜合酶的催化产物均为二萜和二倍半萜，且多为三环或四环。根据催化机制可知，PT结构域决定了催化合成萜类化合物的碳链长度，而TC结构域则对产物的环系骨架和立体构型起关键作用，且随着环化反应中间体上碳正离子的迁移，产物的环系结构也将逐渐趋于复杂。然而，由于高能碳正离子中间体的存在，环化过程瞬息万变、难以捕捉，也为双功能萜合酶催化机制的研究带来困难。同时，由于双功能萜合酶双结构域及多个柔性区域的存在，蛋白质晶体结构的获取和解析也十分困难，目前为止仍未有一例双功能萜合酶全酶晶体结构，即使是截短的TC结构域晶体也仅有一例，因此，该领域中关于酶的结构和功能关系的了解较为有限。但最近David W.Christianson等人用冷冻电镜解析了双功能萜合酶PaFS的结构，为双功能萜合酶结构的解析提供了新方案。

蛋白质工程方法包括定向进化、理性设计和半理性设计。由于双功能萜合酶蛋白晶体的不足，目前仍缺乏对其空间结构和功能关系的深入认知，理性设计无从下手，且成功率较低，因此并不适用。定向进化是常用的对酶蛋白进行改造和筛选的有效手段，但其随机突变的特性往往导致突变库过于庞大，具有成本高、效率低、周期长等弊端。近年逐渐发展起来的半理性设计采用生物信息学的手段，通过同源蛋白序列比对、蛋白空间立体结构的比较，同时参考已知催化机制等信息，理性选择蛋白质的改造靶点和替代氨基酸，从而构建较为精简的突变体文库，更有针对性地改造蛋白质。其中，定点饱和突变通过理性选择某一个氨基酸位点，将此位点的氨基酸突变成其他19种氨基酸构建定点饱和突变文库，定点饱和突变文库在快速、高效地探究蛋白功能和活性中心中发挥着重要的作用。因此，根据有限的双功能萜合酶结构和催化方面的信息，设计和构建高效突变体库，对更加深入了解萜合酶结构与功能的关系，扩充萜类天然产物库，增添更多具有潜在药物价值的萜类化合物后备军具有重要意义。

发明内容

本发明的目的：提供双功能萜合酶及其突变体以及催化产物。

基于同源序列比对和蛋白模型构建，设计双功能萜合酶FoFS的突变位点，构建精简高效的突变库。通过萜合酶催化功能的改造和突变产物的获得，更加深入了解萜合酶结构与功能的关系，扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种双功能萜合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中，野生型双功能萜合酶简写为FoFS。

所述双功能萜合酶FoFS(野生型双功能萜合酶)是筛选自尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)(保藏编号：CGMCC No.21067)的双功能萜合酶。

本发明还提供一种双功能萜合酶的核苷酸(也可称之为野生型核苷酸，简写为FoFS)序列如SEQ ID NO.2所示。该野生型双功能萜合酶的核苷酸是通过提取尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(保藏编号：CGMCC No.21067)的RNA，通过反转录的方法获得cDNA，然后测序得到。

本发明还提供一种双功能萜合酶突变体，是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为谷氨酰胺(Glutamine)后而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质，也简称为FoFS-L89Q。

具体而言，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为谷氨酰胺(Glutamine)后而形成的新氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述双功能萜合酶。所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，简写为FoFS-L89Q。

SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列是通过PCR的方法将SEQ ID NO.2的265-267位碱基从CTA突变为CAG得到。

本发明还提供另外一种双功能萜合酶突变体，是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为天冬酰胺(Asparagine)后而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质，也简称为FoFS-L89N。

具体而言，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为天冬酰胺(Asparagine)后而形成的新氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述双功能萜合酶。所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，简写为FoFS-L89N。

SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列是通过PCR的方法将SEQ ID NO.2的265-267位碱基从CTA突变为AAT得到。

本发明提供的双功能萜合酶以及双功能萜合酶突变体是同时具有异戊烯基转移酶结构域以及萜类环化酶结构域的二倍半萜合酶，兼具催化萜类合成前体DMAPP和IPP首尾相连和环化的双重功能。

本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码双功能萜合酶或双功能萜合酶突变体的核酸。

本发明还提供一种重组表达转化体，所述重组表达转化体包含所述的重组表达载体。

本发明还提供双功能萜合酶或双功能萜合酶突变体在合成含二倍半萜骨架的化合物上的应用。

本发明还提供双功能萜合酶的催化产物，包括，

双功能萜合酶的催化产物1为含5/3/7/6/5五环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

双功能萜合酶的催化产物2为含5/3/7/6/5五环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

双功能萜合酶的催化产物3为含5/12/5三环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

双功能萜合酶的催化产物4为含5/4/7/6/5五环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

本发明还提供双功能萜合酶突变体的催化产物，包括，

双功能萜合酶突变体的的催化产物5为含5/8/6/5四环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

双功能萜合酶突变体的的催化产物6为含5/3/7/6/5五环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

双功能萜合酶突变体的的催化产物7为含5/12/5三环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

本发明提供了双功能萜合酶和两种双功能萜合酶突变体，两种双功能萜合酶突变体分别包含将SEQ ID NO.1的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为谷氨酰胺(Glutamine)的氨基酸序列和将SEQ ID NO.1的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为天冬酰胺(Asparagine)的氨基酸序列。其中，编码所述的SEQ ID NO.1表示的氨基酸序列的基因是筛选自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的双功能萜合酶基因。

本发明还提供目标双功能萜合酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中体内酶催化反应之后，提取、检测和鉴定突变蛋白的催化产物。

本发明通过双功能萜合酶单点饱和突变库的构建和突变产物的检测，改造了双功能萜合酶的催化功能，获得了具丰富环系结构的萜类化合物，对扩充萜类天然产物库，增添更多具潜在药物价值萜类化合物后备军具有重要意义。

本发明的改造对象双功能萜合酶FoFS同时具有异戊烯基转移酶结构域以及萜类环化酶结构域，兼具催化萜类合成前体DMAPP和IPP首尾相连和环化的双重功能。FoFS具有多个不同环系的二倍半萜产物。本发明通过改造FoFS，使突变蛋白能够催化其他复杂环系的二倍半萜化合物。

附图说明

图1为本发明实施例提供的双功能萜合酶原产物(1–4)和突变产物(化合物5–10)的化学结构图和GC-MS色谱图

图2为本发明实施例提供的化合物5的HR-EI-MS图

图3为本发明实施例提供的化合物5在Benzene-d

图4为本发明实施例提供的化合物5在Benzene-d

图5为本发明实施例提供的化合物5在Benzene-d

图6为本发明实施例提供的化合物5在Benzene-d

图7为本发明实施例提供的化合物5在Benzene-d

图8为本发明实施例提供的化合物5在Benzene-d

图9为本发明实施例提供的化合物5的相对构型以及关键二维NMR相关。

图10为本发明实施例提供的化合物6的HR-EI-MS图

图11为本发明实施例提供的化合物6在Benzene-d

图12为本发明实施例提供的化合物6在Benzene-d

图13为本发明实施例提供的化合物6在Benzene-d

图14为本发明实施例提供的化合物6在Benzene-d

图15为本发明实施例提供的化合物6在Benzene-d

图16为本发明实施例提供的化合物6在Benzene-d

图17为本发明实施例提供的化合物6的相对构型以及关键二维NMR相关。

图18为本发明实施例提供的化合物7的HR-EI-MS图

图19为本发明实施例提供的化合物7在Benzene-d

图20为本发明实施例提供的化合物7在Benzene-d

图21为本发明实施例提供的化合物7在Benzene-d

图22为本发明实施例提供的化合物7在Benzene-d

图23为本发明实施例提供的化合物7在Benzene-d

图24为本发明实施例提供的化合物7在Benzene-d

图25为本发明实施例提供的化合物7的相对构型以及关键二维NMR相关。

图26为本发明实施例提供的化合物8的HR-EI-MS图

图27为本发明实施例提供的化合物8在Benzene-d

图28为本发明实施例提供的化合物9在甲醇中的HR-EI-MS图

图29为本发明实施例提供的化合物9在Benzene-d

图30为本发明实施例提供的化合物10的HR-EI-MS图

图31为本发明实施例提供的化合物10在Benzene-d

图32为本发明实施例提供的化合物5–7的关键NOE相关图

图33为本发明实施例提供的化合物5的实际测定CD及计算ECD示意图

图34为本发明实施例提供的化合物6的实际测定CD及计算ECD示意图

图35为本发明实施例提供的化合物7的实际测定CD及计算ECD示意图

图36为一种双功能萜合酶野生型产物1–4以及第89位氨基酸突变为谷氨酰胺和天冬酰胺后催化的新产物5–10的示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例中，野生型双功能萜合酶是筛选自尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)F.oxysporum 14005的双功能萜合酶，野生型双功能萜合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明中，野生型双功能萜合酶简写为FoFS。

其中，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)F.oxysporum 14005保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21067，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年12月31号。关于尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)F.oxysporum 14005的保藏信息已经在专利CN113046332A中公开。

该野生型双功能萜合酶的核苷酸(也可称之为野生型核苷酸，简写为FoFS)序列如SEQ ID NO.2所示。该野生型双功能萜合酶的核苷酸是通过提取尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)(保藏编号：CGMCC No.21067)的RNA，通过反转录的方法获得cDNA，然后测序得到。

本实施例提供一种双功能萜合酶突变体，是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为谷氨酰胺(Glutamine)后而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质，也简称为FoFS-L89Q。

具体而言，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为谷氨酰胺(Glutamine)后而形成的新氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本实施例还提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述双功能萜合酶突变体。所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，简写为FoFS-L89Q。

SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列是通过PCR的方法将SEQ ID NO.2的265-267位碱基从CTA突变为CAG得到。

本实施例还提供另外一种双功能萜合酶突变体，是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为天冬酰胺(Asparagine)后而形成的新氨基酸序列组成的蛋白质，也简称为FoFS-L89N。

具体而言，将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位置的亮氨酸(Leucine)突变为天冬酰胺(Asparagine)后而形成的新氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本实施例还提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述双功能萜合酶突变体。所述分离的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，简写为FoFS-L89N。

SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列是通过PCR的方法将SEQ ID NO.2的265-267位碱基从CTA突变为AAT得到。

本实施例提供的两种不同的双功能萜合酶是同时具有异戊烯基转移酶结构域和萜类环化酶结构域的二倍半萜合酶。

本实施例进一步提供一种双功能萜合酶的制备方法，包括以下步骤：

从尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)F.oxysporum 14005的双功能萜合酶基因中调取FoFS编码基因的核苷酸序列和蛋白质序列，导入BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中，并在PDB(http://www.rcsb.org/)数据库中进行检索，得到相似度为45％的真菌来源首例双功能萜合酶PaFS晶体结构，以此作为模板，应用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在线服务器，对FoFS的TC结构域进行蛋白模型的构建。

使用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对FoFS与前期研究过的双功能萜合酶BsPS进行序列比对。发现FoFS存在与BsPS相似的影响催化产物环系的“三联体”位点：F61、W69、L89。鉴于前期对BsPS的研究表明第89位氨基酸对催化有重要作用，因此对FoFS的第89位置的亮氨酸进行饱和突变。

将野生型双功能萜合酶的编码基因与线性化质粒pET28a片段重组，再将重组产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。之后将突变位点设计在引物中，进行全质粒PCR，使用DpnI消化PCR产物以除去质粒模板，取2μL消化产物转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，使用抗性平板筛选后，挑取单克隆进行测序，选择测序正确的序列进行后续在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达，分离即可得到野生型双功能萜合酶。

本实施例中提供一些双功能萜合酶催化产物二倍半萜类化合物，包括：

所述的双功能萜合酶的催化产物1为含5/3/7/6/5五环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

所述的双功能萜合酶的催化产物5为含5/8/6/5四环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

所述的双功能萜合酶的催化产物9、10为含5/15双环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

双功能萜合酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中异源表达

一种双功能萜合酶催化产物二倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)：以含双功能萜合酶编码基因工程菌经发酵培养获得菌体体内的双功能萜合酶为催化剂，直接从菌体内提取萜类产物，并通过GC-MS检测。

湿菌体为含双功能萜合酶编码基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，发酵培养方法为含双功能萜合酶编码基因的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)接种于添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基(酵母提取物(Yeast Extract)0.5％(w/v)，胰蛋白胨(Tryptone)1％(w/v)，氯化钠1％(w/v)，琼脂粉(agar)2％(w/v))中，37℃、220rpm震荡培养8–10h，以2％的接种量转接至添加50μg/mL卡那霉素的自诱导培养基，于37℃、220rpm震荡培养，当OD

自诱导培养基：酵母提取物0.5％(w/v)，胰蛋白胨1％(w/v)，20×无机盐缓冲液5％(v/v)，20×碳源5％(v/v)，500×MgSO

20×无机盐缓冲液：Na

20×碳源：无水葡萄糖2％(w/v)，丙三醇10％(w/v)，α-乳糖20％(w/v)。

500×MgSO

丙酮超声(130W,30min)裂解萃取大肠杆菌发酵湿菌体30min，离心后取上清，重复裂解萃取3次，将3次丙酮合并，使用等体积乙酸乙酯萃取3次，获得发酵培养的菌体粗提物。

发酵培养的菌体粗提物使用硅胶柱层析和半制备型液相色谱(HPLC)纯化和制备，包括以下步骤：

从发酵培养的200g E.coli BL21(DE3)/pET28a-FoFS-L89Q菌体萃取的0.23g粗提物使用硅胶柱层析进行样品初步分离。正己烷作为硅胶柱层析的洗脱流动相，通过TLC监测，获得含有化合物5和6的组分。然后换用二氯甲烷作为硅胶柱层析的洗脱流动相，通过TLC监测，获得含有化合物8的组分。

另一批从发酵培养的313g E.coli BL21(DE3)/pET28a-FoFS-L89Q菌体萃取的0.97g粗提物使用硅胶柱层析进行样品初步分离。正己烷作为硅胶柱层析的洗脱流动相，通过TLC监测，获得含有化合物7的组分。

硅胶柱洗脱下来含有目标化合物5、6、7、8的组分再经过液相色谱柱进行分离纯化。含有化合物5和化合物6的组分，先使用液相色谱柱ACE Excel 5 C18-AR(Φ4.6×250mm)，100％乙腈，流速1mL/min等度洗脱制备，化合物6的保留时间为29min，化合物5的保留时间为27min。接着，含化合物5的组分再使用色谱柱COSMOSIL Cholester(Φ4.6×250mm)，100％甲醇，流速1mL/min等度洗脱纯化，化合物5的保留时间为51min。含有化合物7的组分，先使用半制备液相色谱柱Phenomenex C18(Φ10×250mm)，体积比为98：2的甲醇和水，流速4mL/min等度洗脱，化合物7的保留时间为37min。接着，使用色谱柱ACE C18-PFP(Φ4.6×250mm)，100％乙腈，流速1mL/min等度洗脱纯化，化合物7的保留时间为19min。含有化合物8的组分，使用半制备液相色谱柱ACE Excel 5 C18-AR(Φ10×250mm)，积比为95：5的乙腈和水，流速4mL/min等度洗脱，化合物8的保留时间为11.9min。

从发酵培养的64g E.coli BL21(DE3)/pET28a-FoFS-L89N菌体萃取的0.25g粗提物使用硅胶柱层析和半制备型液相色谱(HPLC)纯化和制备，包括以下步骤：

发酵培养的E.coli BL21(DE3)/pET28a-FoFS-L89N菌体粗提物0.25g使用硅胶柱层析进行样品初步分离。正己烷作为硅胶柱层析的洗脱流动相，通过TLC监测，获得含有化合物9和10的组分。

硅胶柱洗脱下来含有目标化合物9、10的组分再经过液相色谱柱进行分离纯化。含有化合物9和化合物10的组分，先使用半制备液相色谱柱ACE Excel 5 C18-AR(Φ10×250mm)，100％乙腈，流速4mL/min等度洗脱制备，化合物9和化合物10的保留时间均为17min。接着，再使用色谱柱COSMOSIL Cholester(Φ4.6×250mm)，100％甲醇，流速1mL/min等度洗脱纯化，化合物9的保留时间为17min，化合物10的保留时间为18min。

制备得到的化合物5–10使用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测，检测条件为：高压分流模式进样，进样口压力为110kPa，分流比为50，柱流量为1.77mL/min。起始温度60℃，之后以25℃/min的速率升至280℃，再以10℃/min的速率升至310℃。化合物5的保留时间为9.750min，m/z 340；化合物6的保留时间为10.117min，m/z 340；化合物7的保留时间为10.250min，m/z 340；化合物8的保留时间为11.342min，m/z 358；化合物9的保留时间为10.517min，m/z 340；化合物10的保留时间为10.583min，m/z 340。

双功能萜合酶FoFS突变催化产物和GC-MS色谱图如图1所示。与野生型相比，FoFS-L89A/L89C/L89Q/L89N/L89S/L89T/L89G(FoFS-L89A是指将FoFS的如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第89位的L氨基酸替换为A氨基酸，其他做相同的解释)的突变产物中均获得了化合物8，化合物8为含5-15双环二倍半萜骨架的化合物，其分子式为C

化合物5为白色粉状，

化合物6为白色粉状，

化合物7为白色粉状，

化合物8为白色粉状，将化合物8的MS和NMR数据与文献中报道的数据进行比较，确定了其结构。HR-EI-MS测得其准分子离子峰为m/z 358.3233[M

化合物9为白色粉状，将化合物9的MS和NMR数据与文献中报道的数据进行比较，确定了其结构。HR-EI-MS测得其准分子离子峰为m/z 340.3128[M

化合物10为白色粉状，将化合物10的MS和NMR数据与文献中报道的数据进行比较，确定了其结构。HR-EI-MS测得其准分子离子峰为m/z 340.3133[M

本发明实施例提供的化合物5–7的关键NOE相关图如图32所示；本发明实施例提供的化合物5、6、7的实际测定CD及计算ECD示意图如图33、34、35所示。

双功能萜合酶野生型产物1–4以及第89位氨基酸突变为谷氨酰胺和天冬酰胺后催化的新产物5–10的示意图如图36所示。

表1化合物5的1D and 2D NMR数据表

表2化合物6的1D and 2D NMR数据表

表3化合物7的1D and 2D NMR数据表

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。