抗间皮素纳米抗体及其用途

技术领域

本发明涉及特异性结合MSLN的纳米抗体或其抗原结合片段，含有所述纳米抗体或其抗原结合片段的组合物，编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。此外，此发明涉及这些抗体或其抗原结合片段的治疗和诊断用途。

背景技术

间皮素(Mesothelin，MSLN)是一种40kDa的细胞表面糖蛋白，在胰腺癌、卵巢癌、间皮瘤和其他一些癌症中高度表达。由于MSLN还可以分泌形式sMSLN存在于少数患者的血液中，因而血液中MSLN的测定可能对诊断和跟踪患者病情有用。MSLN基因可编码一种分子量为69kDa的前体蛋白，该蛋白被加工成一个40kDa的膜结合蛋白(称为MSLN)和一个31kDa的脱落片段，称为巨核细胞增强因子(megakaryocyte-potentiating factor，MPF)，该片段从细胞中释放出来。MSLN不是癌症特异性抗原，可表达于正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中，但在多种癌症细胞中高表达。MSLN在正常组织上的有限分布使其成为肿瘤特异性治疗很有潜力的靶标。

目前，多种靶向MSLN抗原的抗体药物或者细胞治疗都已进展到临床阶段。如Bayer、ImmunoGen、Morphosys等公司研发的抗体偶联药物Anetumab ravtansine，该药物在II期临床实验中用于治疗实体瘤(NCT03926143)；Morphotek公司开发的靶向MSLN的单克隆抗体药物Amatuximab，目前临床试验也已推进到临床II期，用于实体肿瘤的临床治疗；此外，中国人民解放军军事医学院和TCR2公司还开发了靶向MSLN的CAR-T疗法，目前均处于临床试验阶段。现有的临床试验多表明间皮素靶向治疗安全性尚可，但治疗效果一般。

单域抗体(sdAb)，又称纳米抗体(nanobody)或重链抗体(hcAb)，是从骆驼科动物和鲨鱼的血清中分离出的一种抗体，其体积约为传统抗体的1/10。与传统抗体不同的是，单域抗体仅由重链构成，其抗原结合区仅是一个通过铰链区与Fc区连接的单结构域，而且这个抗原结合区自抗体上分离后仍具有结合抗原的功能。单域抗体具有分子量小，稳定性好等特点，在药物研发和诊断试剂开发等方面相比于传统常见的正常抗体有着组织浸润性好、给药方式灵活、人源化程度高、容易重组蛋白改造等诸多优势。

发明内容

本申请的发明人经过大量的研究，筛选获得了系列抗MSLN的纳米抗体，所述纳米抗体与MSLN具有高结合活性，并且具备与人、猴和/或小鼠MSLN的交叉反应活性。此外，所述纳米抗体还具有分子量小，稳定性好等特点，在药物研发和诊断试剂开发等方面相比于传统常见的正常抗体有着组织浸润性好、给药方式灵活、人源化程度高、容易重组蛋白改造等诸多优势。

基于此，本申请还提供了含有所述纳米抗体或其抗原结合片段的组合物，编码所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸及包含其的宿主细胞，以及相关用途。

纳米抗体及其抗原结合片段

因此，在第一方面，本申请提供了能够特异性结合MSLN的纳米抗体或其抗原结合片段。本文中所述的纳米抗体通常由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成，称为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4，所述抗原结合片段包含该纳米抗体的至少一部分，该部分足以赋予该片段特异性结合MSLN的能力。在一些实施方案中，本发明所述的纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR1，其具有选自以下的结构：GX

(b)CDR2，其具有选自以下的结构：IX

(c)CDR3，其具有选自以下的结构：AACRRSPYARYCALX

其中，

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

YE-01/YE-33/YE-24/YE-26/YE-10

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR1，其具有如GX

(b)CDR2，其具有如IX

(c)CDR3，其具有如AACRRSPYARYCALX

其中，

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

在某些实施方案中，X

YE-01/YE-33/YE-24/YE-26

在某些优选的实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR1，其具有如GX

(b)CDR2，其具有如IX

(c)CDR3，其具有如AACRRSPYARYCALX

其中，

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

在某些优选的实施方案中，X

YE-17/YE-04

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR1，其具有如GX

(b)CDR2，其具有如ILNDGTT(SEQ ID NO:13)或IX

(c)CDR3，其具有如GYSDYRGTDY(SEQ ID NO:20)所示的结构；

其中，

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

在某些实施方案中，X

YE-23/YE-40/YE-63/YE-73

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR1，其具有如GX

(b)CDR2，其具有如IX

(c)CDR3，其具有如AADCPNLPLGARACRT(SEQ ID NO:22)或NRGSGTFGS(SEQ ID NO:24)所示的结构；

其中，

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

在某些实施方案中，X

YE-23/YE-40

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR1，其具有如GX

(b)CDR2，其具有如IX

(c)CDR3，其具有如AADCPNLPLGARACRT(SEQ ID NO:22)所示的结构；

其中，

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

在某些实施方案中，X

YE-63/YE-73

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR1，其具有如GX

(b)CDR2，其具有如IX

(c)CDR3，其具有如NRGSGTFGS(SEQ ID NO:24)所示的结构；

其中，

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

在某些实施方案中，X

YE-68

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(a)CDR1，其具有如GFMVEYYD(SEQ ID NO:9)所示的结构；

(b)CDR2，其具有如IX

(c)CDR3，其具有如NVRYRLTLY(SEQ ID NO:25)所示的结构；

其中，

X

X

X

X

X

X

在某些实施方案中，X

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NOs:1-9任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:10-18任一项所示的CDR2；以及，如SEQ ID NOs:19-25任一项所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(1)如SEQ ID NOs:1、3、6-7任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:10、12、15任一项所示的CDR2；以及，如SEQ ID NOs:19、21、23任一项所示的CDR3；优选地，如SEQ ID NOs:1、6-7任一项所示的CDR1；如SEQ ID NOs:10或15所示的CDR2；以及，如SEQ ID NOs:19或23所示的CDR3；

(2)如SEQ ID NOs:2或4所示的CDR1；如SEQ ID NOs:11或13所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:20所示的CDR3；

或，

(3)如SEQ ID NOs:5或8所示的CDR1；如SEQ ID NOs:14、16-17任一项所示的CDR2；以及，如SEQ ID NOs:22或24所示的CDR3；优选地，如SEQ ID NO:5所示的CDR1；如SEQ IDNOs:14或16所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:22所示的CDR3；

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:1所示的CDR1；如SEQ ID NO:10所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:19所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:2所示的CDR1；如SEQ ID NO:11所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:20所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:3所示的CDR1；如SEQ ID NO:12所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:21所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:4所示的CDR1；如SEQ ID NO:13所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:20所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:5所示的CDR1；如SEQ ID NO:14所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:22所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:6所示的CDR1；如SEQ ID NO:15所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:23所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:7所示的CDR1；如SEQ ID NO:15所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:19所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:5所示的CDR1；如SEQ ID NO:16所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:22所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:8所示的CDR1；如SEQ ID NO:17所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:24所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：如SEQ ID NO:9所示的CDR1；如SEQ ID NO:18所示的CDR2；以及，如SEQ ID NO:25所示的CDR3。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含选自下列的氨基酸序列：

(i)如SEQ ID NOs:26-37任一项所示的序列；

(ii)与SEQ ID NOs：26-37任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NOs：26-37任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段是人源化的。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段进一步包含人免疫球蛋白的重链框架区(例如，人重链胚系抗体基因所编码的氨基酸序列中所包含的重链框架区)，所述重链框架区任选地包含一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)从人源残基至驼源残基的回复突变。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含：

(i)如SEQ ID NO:43所示或与SEQ ID NO:43相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的FR1；

(ii)如SEQ ID NOs:44-46任一项所示或与SEQ ID NOs:44-46任一项相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的FR2；

(iii)如SEQ ID NOs:47-49任一项所示或与SEQ ID NOs:47-49任一项相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的FR3；

和/或，

(iv)如SEQ ID NO:50所示或与SEQ ID NO:50相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)，或具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的FR4。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含选自下列的氨基酸序列：

(i)如SEQ ID NOs:39-42任一项所示的序列；

(ii)与SEQ ID NOs：39-42任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或

(iii)与SEQ ID NOs：39-42任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。

在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。

多肽构建体

在第二方面，本申请还提供了特异性结合MSLN的多肽构建体，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段，以及免疫球蛋白Fc结构域。

在本文中，所述Fc结构域也称为Fc区，是指包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。在一些实施方案中，Fc结构域包含铰链、CH2和CH3。当Fc结构域包含铰链时，铰链调节两个含Fc的多肽之间的二聚作用。Fc结构域可为任何抗体重链恒定区同型。在一些实施方案中，Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域是天然Fc区，其包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。例如，所述Fc结构域可以是天然序列人类IgG1 Fc区、天然序列人类IgG2 Fc区、天然序列人类IgG3 Fc区或天然序列人类IgG4Fc区。天然Fc区可具有效应子功能。示例性“效应子功能”包括与Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化等。可以通过将天然Fc区中的至少一个氨基酸残基替换为不同残基或化学修饰，产生功能改变，例如，改变抗体对效应子配体(如FcR或补体C1q)的亲和力，从而改变效应子功能(例如降低或增强)。

因此，在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域也可以是变异Fc区，其与天然Fc区相比可以包含一个或多个(例如1-10个，例如1-5个)氨基酸突变或化学修饰以改变本发明抗体的下列中的一个或更多个特性：Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能等。

在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域具备ADCC活性。在某些实施方案中，本发明多肽构建体所包含的Fc结构域不具备ADCC活性。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域任选地通过肽接头连接至所述纳米抗体或其抗原结合片段的N端和/或C端(例如C端)。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG的Fc结构域(例如IgG1的Fc结构域)。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO：38所示的序列，或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列，或与其相比具有一个或几个氨基酸置换、缺失或添加(例如，1个、2个、3个、4个或5个氨基酸置换、缺失或添加)的序列。

纳米抗体及多肽构建体的制备

本发明的纳米抗体或多肽构建体可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码本发明纳米抗体或多肽构建体的DNA分子。将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞。然后，在特定条件下培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的抗体或多肽构建体。

本发明的抗原结合片段可以通过水解完整的纳米抗体分子获得(参见Morimotoet al.,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.,Science229:81(1985))。另外，这些抗原结合片段也可以直接由重组宿主细胞产生(reviewed inHudson,Curr.Opin.Immunol.11:548-557(1999)；Little et al.,Immunol.Today,21:364-370(2000))。本领域的普通技术人员完全知晓制备这些抗原结合片段的其它技术。

核酸分子

在第三方面，本申请还提供了分离的核酸分子，其编码如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体。

载体

在第四方面，本申请还提供了载体，其包含如上所述的核酸分子。在某些实施方案中，所述载体为克隆载体或表达载体。

宿主细胞

在第五方面，本申请还提供了宿主细胞，其包含如上所述的核酸分子或载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如细菌细胞(如大肠杆菌细胞)，以及真核细胞例如真菌细胞(例如酵母细胞)，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。

制备方法

在第六方面，本申请还提供了制备如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养如上所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述纳米抗体或其抗原结合片段或所述多肽构建体。

双特异性或多特异性抗体

在第七方面，本申请还提供了双特异性或多特异性抗体，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体。本申请还提供了本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体、或编码它们的核酸分子、载体或宿主细胞用于制备双特异性或多特异性抗体的用途。

在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体特异性结合MSLN，并且额外地特异性结合一个或多个其他靶标。

在某些实施方案中，所述双特异性或多特异性抗体还包含至少一种具有针对第二靶标的第二结合特异性的第二抗体。

缀合物

在第八方面，本申请还提供了缀合物，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体，以及与所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体连接的治疗剂。本申请还提供了本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体、或编码它们的核酸分子、载体或宿主细胞用于制备缀合物的用途。

在某些实施方案中，所述治疗剂选自抗肿瘤药物，例如细胞毒剂、激素类药物、生物反应调节剂、另外的抗体或其抗原结合片段。

嵌合抗原受体

在第九方面，本申请还提供了嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域(例如初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域)，其中所述抗原结合结构域包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段。本申请还提供了本发明的纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体、或编码它们的核酸分子、载体或宿主细胞用于制备嵌合抗原受体或表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞的用途。

在某些实施方案中，所述抗原结合结构域赋予所述嵌合抗原受体识别MSLN的能力；所述间隔结构域允许蛋白质具有柔性并且允许一个或两个结构域相对于彼此的运动；所述跨膜结构域能够在细胞膜(特别是真核细胞膜)中热力学稳定；所述胞内信号传导结构域参与将有效的抗原受体结合的信号传导进免疫效应细胞内部，激活表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能，或增强表达CAR的免疫效应细胞的至少一种细胞因子的分泌。

在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体由免疫效应细胞(例如T细胞)所表达。

在第十方面，本申请还提供了分离的核酸分子，其编码如上所述的嵌合抗原受体。

在第十一方面，本申请还提供了载体，其包含如上所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，所述分离的核酸分子用于制备嵌合抗原受体T细胞。

在第十二方面，本申请还提供了宿主细胞，其包含如上所述的分离的核酸分子或载体。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。

在某些实施方案中，所述宿主细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。

药物组合物

在第十三方面，本申请还提供了药物组合物，其包含如上所述的第一方面的纳米抗体或其抗原结合片段、第二方面的多肽构建体、第七方面的双特异性或多特异性抗体、第八方面的缀合物、第九方面的嵌合抗原受体、第三方面或第十方面的分离的核酸分子、第四方面或第十一方面的载体、或第五方面或第十二方面的宿主细胞。

在某些实施方案中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含如上所述的第一方面的纳米抗体或其抗原结合片段、第二方面的多肽构建体、第三方面的分离的核酸分子、第四方面的载体或第五方面的宿主细胞。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含如上所述的第七方面的双特异性或多特异性抗体。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含如上所述的第八方面的缀合物。

在某些实施方案中，所述药物组合物包含如上所述的第九方面的嵌合抗原受体、第十方面的分离的核酸分子、第十一方面的载体、或第十二方面的宿主细胞。

制药用途

在第十四方面，本申请还提供了如上所述的第一方面的纳米抗体或其抗原结合片段、第二方面的多肽构建体、第七方面的双特异性或多特异性抗体、第八方面的缀合物、第九方面的嵌合抗原受体、第三方面或第十方面的分离的核酸分子、第四方面或第十一方面的载体、第五方面或第十二方面的宿主细胞、或第十三方面的药物组合物用于制备药物的用途，所述药物用于在受试者中预防和/治疗肿瘤。

在某些实施方案中，所述肿瘤为MSLN阳性的肿瘤。

在某些实施方案中，所述肿瘤选自实体瘤，例如胃癌、肺癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、宫颈癌、间皮瘤或乳腺癌。本领域已知所述肿瘤高表达MSLN(参见例如Aurore et al.,cancer discovery,2016)。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些实施方案中，所述纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、分离的核酸分子、载体、宿主细胞、双特异性或多特异性抗体、缀合物、嵌合抗原受体、或药物组合物单独使用，或与另外的药学活性剂(例如抗肿瘤剂)联合使用。

预防和/或治疗肿瘤的方法

在第十五方面，本申请还提供了用于在受试者中预防和/或治疗肿瘤的方法，其包括：给有此需要的受试者施用有效量的如上所述的第一方面的纳米抗体或其抗原结合片段、第二方面的多肽构建体、第七方面的双特异性或多特异性抗体、第八方面的缀合物、第九方面的嵌合抗原受体、第三方面或第十方面的分离的核酸分子、第四方面或第十一方面的载体、第五方面或第十二方面的宿主细胞、或第十三方面的药物组合物。

在某些实施方案中，所述肿瘤为MSLN阳性的肿瘤。

在某些实施方案中，所述肿瘤选自实体瘤，例如胃癌、肺癌、卵巢癌、食道癌、胰腺癌、宫颈癌、间皮瘤或乳腺癌。

在某些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

本申请的纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、双特异性或多特异性抗体、或药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、双特异性或多特异性抗体、或药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、双特异性或多特异性抗体、或药物组合物，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

本申请的纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、双特异性或多特异性抗体、或药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、多肽构建体、双特异性或多特异性抗体、或药物组合物通过静脉注射或推注给予。

检测应用

缀合物

在第十六方面，本申请还提供了缀合物，其包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体，以及与所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体连接的可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

试剂盒

在第十七方面，本申请还提供了试剂盒，其包括如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体或如上所述的第十六方面的缀合物。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含如上所述的第十六方面的缀合物。

在某些实施方案中，所述试剂盒包含如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体，以及特异性识别所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体的第二抗体；任选地，所述第二抗体还包括可检测的标记，例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素。

检测方法

在第十八方面，本申请还提供了用于检测MSLN在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体或如上所述的第十六方面的缀合物。在某些实施方案中，所述方法用于治疗目的，诊断目的，或者非治疗非诊断目的。

在某些实施方案中，所述方法是免疫学检测，例如免疫印迹法、酶免疫测定法(例如ELISA)、化学发光免疫分析法、荧光免疫分析法或放射免疫测定法。

在某些实施方案中，所述方法包括使用如上所述的第十六方面的缀合物。

在某些实施方案中，所述方法包括使用如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体，并且所述方法还包括使用携带可检测的标记(例如酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物、鲁米诺及其衍生物、或钌衍生物)、荧光染料(例如荧光素或荧光蛋白)、放射性核素或生物素)的第二抗体来检测所述纳米抗体或其抗原结合片段或多肽构建体。

在某些实施方案中，所述方法包括：(1)将所述样品与本发明的纳米抗体或其抗原结合片段、本发明的多肽构建体、或本发明的第十六方面的缀合物接触；(2)检测抗原-抗体免疫复合物的形成或检测所述免疫复合物的量。所述免疫复合物的形成表明存在MSLN或表达MSLN的细胞。

在某些实施方案中，所述方法用于检测肿瘤是否能够通过靶向MSLN的抗肿瘤疗法来治疗。

检测试剂制备用途

在第十九方面，本申请还提供了如上所述的纳米抗体或其抗原结合片段或如上所述的多肽构建体或如上所述的第十六方面的缀合物在制备用于检测MSLN在样品中的存在或其水平或者用于检测肿瘤是否能够通过靶向MSLN的抗肿瘤疗法来治疗的检测试剂中的用途。

在某些实施方案中，所述检测试剂通过如上所述的第十八方面的方法来检测MSLN在样品中的存在或其水平以及任选地检测肿瘤是否能够通过靶向MSLN的抗肿瘤疗法来治疗。

在某些实施方案中，所述样品为来自受试者(例如哺乳动物，例如人)的细胞样品(例如包含肿瘤细胞的样品)或体液样品(例如血液)。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的病毒学、生物化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其变体时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“但不限于”或“不限于”。

除非本文另外指明或根据上下文明显矛盾，否则术语“一个”和“一种”以及“该”和类似指称物在描述本发明的上下文中(尤其在以下权利要求的上下文中)应被解释成覆盖单数和复数。

如本文中所使用的，术语“驼源抗体”是指，经免疫接种或抗原入侵的骆驼科(Camelidae)动物(包括骆驼(Camel)、羊驼(Alpaca)和大羊驼(L.glama))所产生的针对该抗原的抗体。本领域技术人员已知，在骆驼科动物所产生的抗体中存在缺失轻链的“重链抗体”(Camelid heavy-chain antibody,HCAb)，这种抗体只包含一个重链可变区(variabledomain of heavy chain of HCAb,VHH)和两个常规的CH2与CH3区，并且单独克隆并表达出来的VHH区具有很好的结构稳定性与抗原结合活性，VHH是目前己知的可结合目标抗原的最小单位。

如本文中所使用的，术语“纳米抗体(nanobody)”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体(single-domainantibody,sdAb)，两者可互换使用。

如本文中所使用的，术语纳米抗体的“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

如本文中所使用的，术语“Fc结构域”或“Fc区”意指，包含CH2和CH3的重链恒定区的一部分。抗体的Fc片段具有多种不同的功能，但不参与抗原的结合。由Fc区介导的“效应子功能”包括Fc受体结合；Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；噬菌作用；对细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞活化等。在一些实施方案中，Fc区包含铰链、CH2和CH3。当Fc区包含铰链时，铰链调节两个含Fc的多肽之间的二聚作用。Fc区可为任何抗体重链恒定区同型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

Fc结构域既可以包括天然Fc区，也可以包括变异Fc区。天然Fc区包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列，例如天然序列人类Fc区包括天然序列人类IgG1 Fc区(非A和A同种异型)；天然序列人类IgG2 Fc区；天然序列人类IgG3 Fc区；及天然序列人类IgG4 Fc区，以及其天然存在的变异体。变异Fc区包含因至少一个氨基酸修饰而与天然序列Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一些实施方案中，变异Fc区可具备相比于天然Fc区改变的效应子功能(例如Fc受体结合、抗体糖基化、半胱氨酸残基的数目、效应细胞功能或补体功能)。

如本文中所使用的，术语“人源化抗体”是指，经基因工程改造的非人源抗体，其氨基酸序列经修饰以提高与人源抗体的序列的同源性。通常而言，人源化抗体的全部或部分CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。在某些实施方案中，人源化抗体的CDR区来自于非人源抗体(供体抗体)，全部或部分的非CDR区(例如，可变区FR和/或恒定区)来自于人源免疫球蛋白(受体抗体)。人源化抗体通常保留了供体抗体的预期性质，包括但不限于，抗原特异性、亲和性、反应性等。在本申请中，供体抗体可以是有预期性质(例如，抗原特异性、亲和性、反应性等)的驼源抗体。为制备人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将免疫动物的CDR区插入人源框架序列。在纳米抗体的语境下，人源化抗体可指人源化VHH，即其中一或多个骨架区已基本上由人类骨架区替换的VHH。在一些情形中，人类免疫球蛋白的某些骨架区(FR)由相应非人类残基替换。此外，人源化VHH可包含在初始VHH或人类骨架序列中均未发现、但被包括在内以进一步改进和优化VHH或含VHH的多肽的性能的残基。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。为了测定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，为了最佳比较目的将序列进行比对(例如，可在第一氨基酸序列或核酸序列中引入缺口以与第二氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后比较对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置上是同一的。两个序列之间的百分比同一性是由序列所共享的同一性位置的数目的函数(即，百分比同一性＝同一重叠位置的数目/位置的总数×100％)。在某些实施方案中，两个序列长度相同。

两个序列之间的百分比同一性的测定还可使用数学算法来实现。用于两个序列的比较的数学算法的一个非限制性实例是Karlin和Altschul的算法，1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268，如同Karlin和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中改进的。将这样的算法整合至Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的平衡解离常数(K

两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(ka或kon)和“解离速率常数”(kdis或koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数K

如本文中所使用的，本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-ASynthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括(但不限于)减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人、猴、小鼠。在某些实施方案中，所述受试者(例如人、猴、小鼠)患有与MSLN相关的疾病(例如，涉及MSLN阳性的肿瘤)，或者，具有患有上述疾病的风险。

如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例如，预防疾病(例如，涉及MSLN阳性的肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟所述疾病的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

发明的有益效果

本发明提供了与MSLN具有高结合活性的纳米抗体，其具备与人、猴和/或小鼠MSLN的交叉反应活性。此外，所述纳米抗体还具有分子量小，稳定性好等特点，在药物研发和诊断试剂开发等方面相比于传统常见的正常抗体有着组织浸润性好、给药方式灵活、人源化程度高、容易重组蛋白改造等诸多优势。

因此，本发明的纳米抗体可以用于多种用途，包括但不限于抑制肿瘤生长和检测MSLN蛋白。并且，本发明的全人源抗体可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。因此，本发明的抗体具有重大的临床价值。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了抗MSLN纳米抗体与CHO-hMSLN细胞亲和力的检测结果。

图2显示了人源化抗MSLN纳米抗体与CHO-hMSLN细胞亲和力的检测结果。

图3显示了人源化抗MSLN纳米抗体与CHO-cyMSLN细胞亲和力的检测结果。

图4显示了人源化抗MSLN纳米抗体与CHO-mMSLN细胞亲和力的检测结果。

图5显示了人源化抗MSLN纳米抗体阻断人MSLN与其配体CA125结合的阻断活性检测结果。

序列信息

本申请涉及的序列的描述提供于下表中。

表1：序列信息

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具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1：抗MSLN纳米抗体的免疫和筛选

利用人MSLN抗原(购自AcroBiosystems，货号：MSN-H522a)免疫羊驼(Llama)后，提取羊驼外周淋巴细胞中的总RNA并进行反转录得到cDNA，将cDNA的PCR产物与酵母展示载体连接后电转化入酿酒酵母(购自ATCC，货号：208289)，构建抗MSLN纳米抗体文库。

按照生物素标记试剂盒(购自Thermo，货号：90407)的产品说明书标记人MSLN蛋白。将扩增后的抗MSLN纳米抗体酵母文库用生物素标记的MSLN蛋白标记后，使用磁珠富集阳性标记酵母。将经过磁珠富集的酵母细胞扩增后，加入1:200稀释的anti-c-Myc抗体(购自Thermo，货号：MA1-980)和适量生物素标记的MSLN抗原染色，PBS清洗酵母后加入1:500稀释的Goat-Anti-mouse IgG(H+L)Alexa Fluor Plus 488(购自Invitrogen，货号：A32723TR)和streptavidin APC Conjugate荧光抗体(购自Invitrogen，货号：SA1005)，孵育15min。用PBS重悬细胞，使用BD FACSAria II仪器进行分选获得可与人MSLN抗原有较高结合能力的酵母。

通过磁珠和流式细胞分选富集得到的能与人MSLN抗原有较高结合能力的酵母菌液，在扩增培养基中30℃，225rpm培养过夜，按照酵母质粒抽提试剂盒(购自天根，货号：DP112)操作抽提酵母质粒。质粒通过电转化入Top10感受态细胞(购自天根，货号：CB104-02)，涂布氨苄抗性平板，于37℃培养过夜。挑取单克隆测序获得VHH(可变区)基因序列，并根据IMGT编号系统确定CDR区序列。所获得的单克隆纳米抗体的序列信息如下表所示。

表2：纳米抗体的VHH以及CDR序列信息

实施例2：抗MSLN纳米抗体的表达载体构建、蛋白表达和纯化

将筛选所得抗MSLN抗体VHH编码序列和人IgG1 Fc段(SEQ ID NO:38)编码序列通过同源重组构建成融合蛋白表达序列，其中人IgG1 Fc段连接于VHH的C端。采用ExpiCHO

实施例3：抗MSLN纳米抗体在蛋白水平的亲和力检测

ForteBio亲和力测定按照现有的方法(Estep,P等人，High throughput solutionBased measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs,2013.5(2):p.270-8)进行。简言之，将传感器在分析缓冲液中线下平衡30min，然后线上检测60s建立基线，在线加载实施例2获得的经纯化的抗体至AHQ传感器上。再将传感器放入100nM的人MSLN抗原(Uniprot ID：Q13421)中作用5min，之后将传感器转移至PBS中解离5min。使用1:1结合模型进行动力学的分析。此外，平行设置抗体amatuximab(CAS号：931402-35-6)为对照组，所述抗体amatuximab的轻重链氨基酸序列如SEQ ID NOs:55-56所示。结果如表3所示。

表3.候选分子亲和力

实施例4：抗MSLN纳米抗体在细胞水平的亲和力检测

通过转染MSLN cDNA的pCHO1.0载体(购自Invitrogen)制备过表达人MSLN(Uniprot ID：Q13421)的CHO细胞(CHO-hMSLN细胞)。将扩大培养的CHO-MSLN细胞调整细胞密度至2×10

实验结果如图1和表4所示，实验结果表明实施例2制备的抗MSLN抗体和CHO-hMSLN细胞均有结合活性，且部分纯化样品的结合活性高于来自于Morphotek的单链对照抗体amatuximab。

表4.抗MSLN纳米抗体与CHO-hMSLN细胞水平结和力EC50

实施例5：抗MSLN人源化纳米抗体在蛋白水平的亲和力检测

根据上述实施例中所筛选抗体的序列及亲和力各方面特性，我们从中挑选了抗体YE-17完成序列人源化改造。并将人源化的改造的序列按照实施例2中所描述方法完成人源化抗体的载体构建、表达和纯化。最终，通过YE-17获得4株人源化改造抗体，分别为HZ-P-YE-17-01、HZ-P-YE-17-02、HZ-P-YE-17-03和HZ-P-YE-17-04，其VHH序列分别如SEQ IDNOs:39-42所示。

将纯化后的人源化抗体按照实施例3中所述方法完成在蛋白水平的亲和力鉴定，结果如表5所示。

表5.抗MSLN人源化纳米抗体的蛋白水平亲和力检测结果

实施例6：抗MSLN人源化纳米抗体与CHO-hMSLN细胞水平结和力的检测及其种属交叉识别特性

将纯化后的人源化抗体按照实施例4中所述方法完成CHO-hMSLN细胞水平亲和力鉴定。

结果如图2和表6所示，结果表明实施例5制备的人源化抗MSLN抗体和CHO-hMSLN细胞均有结合活性。

表6.人源化纳米抗体与CHO-hMSLN细胞结合力EC50

为鉴定人源化抗体与猴MSLN(cyMSLN，Uniprot ID：F6Q1U7)在细胞水平上的亲和力，按照实施例4中所述方法构建细胞株，并完成纯化后的人源化抗体与CHO-cyMSLN在细胞水平上的亲和力鉴定。

结果如图3和表7所示，结果表明抗体YE-17及其人源化抗MSLN抗体和CHO-cyMSLN细胞均有结合活性。

表7.人源化纳米抗体与CHO-cyMSLN细胞结合力EC50

为鉴定抗体与鼠MSLN(mMSLN，Uniprot ID：Q61468)在细胞水平上的亲和力，按照实施例4中所述方法构建细胞株，并完成纯化后的人源化抗体与CHO-mMSLN在细胞水平上的亲和力鉴定，结果如图4和表8所示。

表8.人源化纳米抗体与CHO-mMSLN细胞结合力EC50

综合表6-8以及图2-4的结果，表明抗体YE-17及其人源化抗体具备与人和猴MSLN的交叉结合活性，并且，抗体YE-17和其部分人源化抗体(例如HZ-P-YE-17-01、HZ-P-YE-17-02、HZ-P-YE-17-03)还具备一定的与人、猴和鼠MSLN的交叉结合活性。

实施例7：抗MSLN人源化纳米抗体阻断人MSLN与其配体CA125的结合

为鉴定抗体阻断人MSLN与其配体CA125的结合的阻断活性，按照下述方法进行实验验证：首先将1μg/mL人MSLN抗原包被在高吸附ELISA包被板，4摄氏度包被过夜；去除包被液，5％BSA室温封闭2小时；加入梯度稀释的人源化抗体，室温孵育1h；洗板3次，加入1μg/mLBiotin-CA125(购自Acro，货号：CA5-H82F4)，室温孵育1h；洗板3次，加入1:10000稀释的SA-HRP(购自Abcam，货号：Ab7403)，室温孵育30min；洗板6次，加入50μl/mL TMB显色液，3-5分钟；加入50μl/mL终止液；上机读取A450。

结果如图5和表9所示，结果表明抗体YE-17及其人源化抗体均能有效阻断人MSLN与其配体CA125的结合，从而抑制癌症的侵袭和转移。

表9.人源化纳米抗体阻断人MSLN与其配体CA125结合的EC50

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

SEQUENCE LISTING

<110> 普米斯生物技术(珠海)有限公司

<120> 抗间皮素纳米抗体及其用途

<130> IDC210231

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-01 CDR1氨基酸序列

<400> 1

Gly Leu Thr Phe Ser Thr Tyr Gly

1 5

<210> 2

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-04 CDR1氨基酸序列

<400> 2

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1 5

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<212> PRT

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<220>

<223> YE-10 CDR1氨基酸序列

<400> 3

Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

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<212> PRT

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<220>

<223> YE-17 CDR1氨基酸序列

<400> 4

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1 5

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Gly Arg Thr Phe Ser Met Tyr Ala

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1 5

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<211> 8

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<220>

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1 5

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<211> 8

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<223> YE-63/YE-73 CDR1氨基酸序列

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Ile Asn Ala Arg Gly Asp Arg Thr

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<400> 19

Ala Ala Cys Arg Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Tyr Cys Ala Leu Thr Gly

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Asn Gln Asp Tyr

20

<210> 20

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Gly Tyr Ser Asp Tyr Arg Gly Thr Asp Tyr

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<223> YE-10 CDR3氨基酸序列

<400> 21

Val Lys Ser Pro Tyr Gly Trp Trp Phe Gly Asn Asp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 16

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<220>

<223> YE-23/YE-40 CDR3氨基酸序列

<400> 22

Ala Ala Asp Cys Pro Asn Leu Pro Leu Gly Ala Arg Ala Cys Arg Thr

1 5 1015

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<211> 20

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<220>

<223> YE-24/YE-26 CDR3氨基酸序列

<400> 23

Ala Ala Cys Arg Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Tyr Cys Ala Leu Ala Gly

1 5 1015

Asn Gln Asp Tyr

20

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<212> PRT

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<220>

<223> YE-63/YE-73 CDR3氨基酸序列

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Asn Arg Gly Ser Gly Thr Phe Gly Ser

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<211> 9

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<223> YE-68 CDR3氨基酸序列

<400> 25

Asn Val Arg Tyr Arg Leu Thr Leu Tyr

1 5

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<211> 127

<212> PRT

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<220>

<223> YE-01 VHH氨基酸序列

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Thr Tyr

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ser Val

354045

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505560

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100 105 110

Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

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<211> 116

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<220>

<223> YE-04 VHH氨基酸序列

<400> 27

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Arg Asn

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Leu Val

354045

Ala Arg Ile Phe Ser Gly Gly Arg Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

505560

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Leu Leu

65707580

Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

859095

Tyr Ser Asp Tyr Arg Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

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<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-10 VHH氨基酸序列

<400> 28

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

202530

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

354045

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Gly Arg Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Leu

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Val Lys Ser Pro Tyr Gly Trp Trp Phe Gly Asn Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-17 VHH氨基酸序列

<400> 29

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Arg Asn

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Leu Val

354045

Ala Arg Ile Leu Asn Asp Gly Thr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

505560

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Leu Leu

65707580

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

859095

Tyr Ser Asp Tyr Arg Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

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<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-23 VHH氨基酸序列

<400> 30

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Met Tyr

202530

Ala Lys Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

354045

Ala Gly Ile Thr Trp Arg Gly Glu His Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Met Ala

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

859095

Ala Ala Asp Cys Pro Asn Leu Pro Leu Gly Ala Arg Ala Cys Arg Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-24 VHH氨基酸序列

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ser Val

354045

Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Ala Cys Arg Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Tyr Cys Ala Leu Ala Gly

100 105 110

Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

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<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-26 VHH氨基酸序列

<400> 32

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ser Val

354045

Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ile Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Ala Cys Arg Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Tyr Cys Ala Leu Ala Gly

100 105 110

Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 33

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-33 VHH氨基酸序列

<400> 33

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Pro Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Thr Gly

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Gly Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ser Val

354045

Ala Ala Ile Gly Trp Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ile Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Ala Ala Cys Arg Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Tyr Cys Ala Leu Thr Gly

100 105 110

Asn Gln Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 34

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-40 VHH氨基酸序列

<400> 34

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Met Tyr

202530

Ala Lys Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

354045

Ala Gly Ile Thr Trp Arg Gly Glu Asp Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Thr Val Thr

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

859095

Ala Ala Asp Cys Pro Asn Leu Pro Leu Gly Ala Arg Ala Cys Arg Thr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 35

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-63 VHH氨基酸序列

<400> 35

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Gln Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr

202530

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

354045

Ala Gly Ile Asp Ser Ala Ser Leu Ala Thr His Tyr Val Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Asn Arg Gly Ser Gly Thr Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-68 VHH氨基酸序列

<400> 36

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Met Val Glu Tyr Tyr

202530

Asp Ala Val Trp Val Arg Gln Ile Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val

354045

Ser Ala Ile Asn Ala Arg Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Arg Thr Leu Tyr

65707580

Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

859095

Asn Val Arg Tyr Arg Leu Thr Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 37

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> YE-73 VHH氨基酸序列

<400> 37

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ile Tyr

202530

Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

354045

Ala Gly Ile Asp Ser Ala Ser Leu Ala Thr His Tyr Val Asp Ser Val

505560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Val Tyr

65707580

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

859095

Asn Arg Gly Ser Gly Thr Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 38

<211> 226

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人IgG1-Fc片段

<400> 38

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 1015

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

202530

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

354045

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

505560

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65707580

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

859095

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly

225

<210> 39

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HZ-YE-17-01 VHH氨基酸序列

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Arg Asn

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Leu Val

354045

Ala Arg Ile Leu Asn Asp Gly Thr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

505560

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Leu Leu

65707580

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

859095

Tyr Ser Asp Tyr Arg Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 40

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HZ-YE-17-02 VHH氨基酸序列

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Arg Asn

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

354045

Ala Arg Ile Leu Asn Asp Gly Thr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

505560

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65707580

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

859095

Tyr Ser Asp Tyr Arg Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 41

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HZ-YE-17-03 VHH氨基酸序列

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Arg Asn

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

354045

Ala Arg Ile Leu Asn Asp Gly Thr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

505560

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65707580

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

859095

Tyr Ser Asp Tyr Arg Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HZ-YE-17-04 VHH氨基酸序列

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Thr Ile Phe Ser Arg Asn

202530

Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val

354045

Ala Arg Ile Leu Asn Asp Gly Thr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys

505560

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65707580

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly

859095

Tyr Ser Asp Tyr Arg Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 43

<211> 25

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源FR1氨基酸序列

<400> 43

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser

2025

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源FR2氨基酸序列1

<400> 44

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 1015

Arg

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源FR2氨基酸序列2

<400> 45

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 1015

Arg

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源FR2氨基酸序列3

<400> 46

Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val Ala

1 5 1015

Arg

<210> 47

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源FR3氨基酸序列1

<400> 47

Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 1015

Ser Lys Asn Thr Val Leu Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

202530

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 48

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源FR3氨基酸序列2

<400> 48

Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 1015

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

202530

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 49

<211> 38

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源FR3氨基酸序列3

<400> 49

Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 1015

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

202530

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 人源FR4氨基酸序列

<400> 50

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 式I

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa选自（i）Leu，Phe，Arg，Thr和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa选自（i）Thr，Ile和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa选自（i）Thr，Ser，Arg，Met，Ile和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa选自（i）Tyr，Gly，Asn和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa缺失或者选自（i）Gly，Ala和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<400> 51

Gly Xaa Xaa Phe Ser Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 52

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 式II

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa选自（i）Gly，Ser和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa选自（i）Tyr，Trp和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa选自（i）Asp，Arg和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa选自（i）Thr，Arg和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<400> 52

Ile Xaa Xaa Ser Gly Gly Xaa Xaa

1 5

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 式III

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa选自（i）Thr，Asp，Asn，Phe和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Xaa选自（i）Trp，Ser，Ala和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa选自（i）Arg，Ala，Gly和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa选自（i）Gly，Ser和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa选自（i）Glu，Leu，Arg，Asp和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa选自（i）His，Asp，Ala，Arg，Thr和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<400> 53

Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr

1 5

<210> 54

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 式IV

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa选自（i）Thr，Ala和（ii）相对于（i）是保守置换的氨基酸残基

<400> 54

Ala Ala Cys Arg Arg Ser Pro Tyr Ala Arg Tyr Cys Ala Leu Xaa Gly

1 5 1015

Asn Gln Asp Tyr

20

<210> 55

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amatuximab重链氨基酸序列

<400> 55

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala

1 5 1015

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

202530

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

354045

Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

505560

Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65707580

Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

859095

Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Ser Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 56

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amatuximab轻链氨基酸序列

<400> 56

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 1015

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

202530

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

354045

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

505560

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu

65707580

Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr

859095

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210