一株植物乳杆菌及其在产生尿石素A中的应用

技术领域

本发明涉及一株植物乳杆菌及其在产生尿石素A中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

鞣花单宁(ellagitannins,ETs)是极性大分子，难以被胃肠道直接吸收，生物利用度很低。ETs在小肠被水解成鞣花酸(ellagic acid，EA)，然后EA直接到达哺乳动物胃肠道的远端(结肠)经由定殖的肠道菌群代谢为更容易吸收的二苯并吡喃6-酮衍生物，即尿石素类物质(Urolithin,Uro)。Uro在人体细胞酶的作用下以II期缀合物(葡萄糖醛酸苷和硫酸盐)的形式进入血液，在摄入后3-4天内到达全身组织引发生物效应，最终结合在肝脏中并通过尿液排出。Uro是富含ETs的食物在生物体内发挥效应的真正生物活性物质(公开于Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(02):227-235)。

不同人体的肠道菌群具有特异性，因而产生的代谢物存在着显著的个体间差异。Tomás-Barberán等于2014年研究表明基于人类受试者排泄尿石素的不同能力，尿石素代谢型(urolithin metabotypes,UMs)可分为三种表型，即“表型A”、“表型B”以及“表型0”。代谢表型A(UM-A)产生Uro-A；代谢表型B(UM-B)主要产生iso-Uro-A和Uro-B，也少量产生Uro-A；代谢表型0(UM-0)不产生Uro-A、iso-Uro-A和Uro-B(公开于Journal of Agricultural andFood Chemistry,2014,62(28):6535-8)。近年来新的一项研究表明UMs和年龄有一定的关联，在年轻健康人群中(5～30岁)，UM-A约占70～80％，UM-B约占10～20％，随着年龄的增长(30～90岁)，UM-A减少，UM-B增加，最终分别达到50％和40％，而UM-0的比例(10％)从5岁到90岁保持不变(公开于Food&Function,2018,9(8):4100-4106)。这也进一步说明Uro在人体代谢中差异显著。

多项研究表明，Uro中的Uro-A在抗衰老、抗氧化、抗炎、抗癌、抗炎、预防肥胖、调节雌激素受体等方面有着重要的功效。特别近年来Uro-A抗衰老方面的研究受到了重点关注，2016年《Nature Medicine》的线虫研究表明Uro-A能够清除损伤的线粒体和调节线粒体的生物合成，从而延长正常线虫的寿命，达到抗衰老功效(公开于Nature Medicine,2016,22(8):879-888)。2019年《Nature Metabolism》的人群临床试验证明了人体直接口服Uro-A的抗衰老功效和安全性(公开于Nature Metabolism,2019,1(6):595-603)。最近研究人员开始将目光投向于Uro-A对线粒体相关疾病的改善，2021年《Science TranslationalMedicine》的杜氏肌营养不良症模型小鼠试验证明Uro-A能改善其肌肉功能并延长预期寿命(公开于Science Translational Medicine,2021,13(588):12)。

美国食品和药物管理局已将Uro-A通过了GRAS(通常被认为是安全的)认证。目前Uro-A的工业化生产方法仅化学合成法一种，其以3-甲氧基苯甲酸为起始原料，通过溴化反应、铜催化的偶联酯化反应以及去甲基化反应等化学反应实现Uro-A的批量制备(记载于公开号为CN 105142632 A的中国发明专利申请文本中)。但是通过化学合成法制备的Uro-A在国内无法应用于食品添加当中；而生物转化法的成本低廉、操作简便，并且可以达成Uro-A作为功能性食品原料的目标。目前，仅一篇文献报道了具有转化EA产生Uro-A能力(产量0.42μM(～0.09576mg/L)，转化率3.5％)的菌株：假小链双歧杆菌INIA P815(公开于Journal of Functional Foods,2018,45(18):95-99)。由于EA不溶于水，需先溶至二甲基亚砜(DMSO)，再添加到培养基中，而DMSO会抑制菌的生长，降低酶活，最终影响EA到Uro-A的转化。并且由于有机溶剂DMSO的存在，导致其难以直接应用于功能食品添加当中。

发明内容

本发明提供可转化ETs产生Uro-A并处于可食用菌种目录中的益生菌以及通过该益生菌来生产尿石素A的方法，并探究制成的发酵产品和复合制剂的抗衰老功效，从而为抗衰老产品的工业化生产打下基础。本发明对目标益生菌进行了广泛而深入的探究，最终发现了一株具有转化ETs产生Uro-A能力的植物乳杆菌。

本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CCFM1290，所述植物乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62801，保藏日期为2022年09月15日。

所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CCFM1290来源于健康人群的粪便，菌株经测序分析，16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株为乳杆菌属植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌CCFM1290。

所述植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CCFM1290在BHI固体培养基上的菌落凸起，呈白色、光滑、圆形状，直径约3mm。

本发明提供一种尿石素类物质生物合成的方法，在以含有鞣花单宁或鞣花酸的物质为底物反应体系中，接种具有转化发酵底物产生发酵产物Uro的能力的菌株(可以转化ETs产生Uro)，从而得到富含Uro的发酵制品，然后从富含Uro的发酵制品中进一步分离纯化得到Uro提取物；所述尿石素类物质是尿石素A(二羟基尿石素)、尿石素M5(五羟基尿石素)、尿石素D(四羟基尿石素)、尿石素C(三羟基尿石素)等或其组合。

在本发明的一种实施方式中，所述具有转化发酵底物产生发酵产物Uro的能力的菌株为植物乳杆菌CCFM1290。

在本发明的一种实施方式中，根据所述的生物合成方法，其中，所述Uro前体物质包括但不局限于：膳食来源的ETs、EA中的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述含有鞣花单宁或鞣花酸的物质包含但不局限于：石榴、桑葚、覆盆子、草莓等浆果，核桃、开心果、胡桃等坚果中的一种或多种组合物。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌CCFM1290的发酵在有氧条件下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌CCFM1290的发酵在150～200rpm震荡培养条件下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为30～37℃。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的时间为24～72h。

在本发明的一种实施方式中，所述ETs浓度≥1.5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述底物为BHI肉汤、石榴汁。当底物为BHI肉汤时，需外加ETs；当底物为NFC石榴汁时，需先将pH调至6.8-7.2，再加入适当成分以维持发酵过程中的pH并提供菌株生长所需的氮源(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、2g/L磷酸氢二钾、2g/L柠檬酸二胺)。

在本发明的一种实施方式中，发酵液中的Uro成分的萃取方法主要为：先取一定量的发酵液，分别加入等量的乙醚、乙酸乙酯连续3次进行萃取，萃取液进行冷冻真空离心浓缩至干，然后用甲醇复溶(利用超声促溶)，最后通过0.22μm的醋酸纤维素过滤器过滤，通过HPLC和LC-MS/MS进行检测。

在本发明还提供了上述植物乳杆菌或上述方法在生产Uro-A中的应用，主要表现为改善肌肉及延缓衰老方向上的应用，可以作为在食品、药品或保健品中的应用。

本发明提供了一种制备尿石素A的方法，所述方法为，采用所述植物乳杆菌CCFM1290，以含有鞣花单宁或鞣花酸的物质为底物，进行反应，制备得到反应液，从反应液中提取得到尿石素A。

在本发明的一种实施方式中，所述含有鞣花单宁的物质包含：石榴、桑葚、覆盆子、草莓、核桃、开心果、胡桃。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的条件为30～37℃，150～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的时间为24～72h。

在本发明的一种实施方式中，所述反应底物中ETs浓度≥1.5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应底物为NFC石榴汁。

在本发明的一种实施方式中，调整石榴汁的pH调至6.8～7.2，再加入适当成分以维持发酵过程中的pH并提供菌株生长所需的氮源。

在本发明的一种实施方式中，所述以维持发酵过程中的pH并提供菌株生长所需的氮源为：5～15g/L胰蛋白胨、0～5g/L酵母粉、1～3g/L磷酸氢二钾、1～3g/L柠檬酸二胺。

在本发明的一种实施方式中，所述氮源为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、2g/L磷酸氢二钾、2g/L柠檬酸二胺。

在本发明的一种实施方式中，所述提取得到尿石素A的方法为：先取一定量的发酵液，分别加入等量的乙醚、乙酸乙酯连续3次进行萃取，萃取液进行冷冻真空离心浓缩至干，然后用甲醇复溶(利用超声促溶)，最后通过0.22μm的醋酸纤维素过滤器过滤，通过HPLC和LC-MS/MS进行检测。

本发明提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中，含有所述植物乳杆菌CCFM1290，或含有植物乳杆菌CCFM1290的发酵液，或含有植物乳杆菌CCFM1290的冻干粉，或含有植物乳杆菌CCFM1290灭活的菌体，或含有植物乳杆菌CCFM1290的裂解物，或含有植物乳杆菌CCFM1290提取物。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，植物乳杆菌CCFM1290的含量不低于10

本发明还提供了一种产品，所述产品中含有所述植物乳杆菌CCFM1290或上述微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品或保健品。

在本发明的一种实施方式中，所述食品为保健食品；或所述食品为使用含有所述植物乳杆菌CCFM1290的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品为含有权利要求1所述植物乳杆菌CCFM1290的饮料或零食。

本发明还提供了一种延缓衰老的药品，所述药品中含有上述植物乳杆菌CCFM1290或上述微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，在使用植物乳杆菌CCFM1290制备富含Uro的抗衰老发酵产品时可以根据实际需求，将有效量的Uro或菌粉和药学上可接受的载体制备成各形状，如片剂、饮品、针剂、胶囊剂等。

本发明还提供了一种膳食补充组合物，其主要成分为植物乳杆菌CCFM1290和富含ETs的膳食，组合为复合制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述复合制剂为：植物乳杆菌CCFM1290菌粉与石榴冻干粉、桑葚冻干粉按质量比为5：1.5：0.5的比例进行混合，可用于膳食补充以促进ETs的代谢及Uro等的吸收，从而实现抗衰老方向上的功效。本发明还提供了一种富含植物乳杆菌CCFM1290、ETs、Uro中的一种多种组合成的组合物在制备干预衰老或改善肌肉的功能食品上的应用。

本发明还提供了上述植物乳杆菌CCFM1290，或上述微生物菌剂在制备延缓衰老的产品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品或保健品。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，植物乳杆菌CCFM1290的含量不低于10

有益效果

本发明提供了一株可生产Uro-A的菌株：植物乳杆菌CCFM1290，将该菌株的有以下优势(以下数值均为四个平行实验的值所取得平均值)：

(1)将该菌株以2％的接种量接种至含有1.5g/L ETs的培养基中发酵48h，即可使ETs转化为以Uro-A为代表的各种Uro，培养基中的Uro-A的含量为24.70±0.82μM，Uro-A的转化率为8.59±0.62％。

(2)本发明基于植物乳杆菌CCFM1290开发的发酵产品和复合制剂可发挥抗衰老功效，能够将秀丽隐杆线虫的寿命分别延长32.05％、21.88％。

(3)本发明提供的发酵产品或复合制剂还可以改善肌肉功能损伤，相比于对照组，发酵产品和复合制剂可将秀丽隐杆线虫的游动能力提高33.84％、27.99％。最后，可将该生物合成方法获得的Uro-A等Uro类物质应用于功能食品开发当中，以期得到抗衰老和保持肌肉健康等有益功效。

(4)本发明提供的植物乳杆菌CCFM1290还可以抑制线虫脂滴随年龄增长而出现的积累，发挥降脂功效。

生物材料保藏

一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CCFM1290，分类学命名为Lactiplantibacillus plantarum，已于2022年09月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62801，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学微生物研究所。

附图说明

图1：目标菌株的筛选流程。

图2：目标菌株的菌落特征。

图3：发酵产品HPLC图谱。

图4：发酵产品的总离子流图、尿石素A的质量色谱图及其二级质谱图。

图5：不同生长时期发酵产品中尿石素A积累量变化。

图6：发酵产品和复合制剂对线虫寿命的影响。

图7：发酵产品和复合制剂对线虫运动能力的影响。

图8：植物乳杆菌CCFM1290对线虫脂滴积累的影响，(a)线虫被喂养大肠杆菌和植物乳杆菌后，第八天的脂滴积累情况；(b)使用ImageJ软件计算脂滴的平均光密度值。

图9：喂食FITC标记的植物乳杆菌CCFM1290后线虫的显微照片，(a)FITC标记植物乳杆菌情况，通过倒置荧光显微镜观察可知FITC成功标记植物乳杆菌；(b)喂食含FITC标记的植物乳杆菌后，秀丽隐杆线虫体内荧光情况；(c)喂食大肠杆菌OP50后线虫体内的荧光情况。

具体实施方式

本发明所述的动物模型为秀丽隐杆线虫，秀丽隐杆线虫是探究退行性疾病发生和治疗机制的理想模型。通过秀丽隐杆线虫寿命实验发现可转化鞣花单宁产生尿石素A的菌株的发酵提取物可干预线虫衰老，为其在抗衰老食品领域的进一步开发利用提供了强有力的研发模型。

下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步阐述。

下述实施例中涉及的ETs(安石榴苷)购自sigma，纯度≥98％；下述实施例中涉及的Uro-A购自sigma，纯度≥97％；下述实施例中涉及的NFC石榴汁、石榴冻干粉、桑葚冻干粉购自无锡欧尚超市。下述实施例中所涉及的秀丽隐杆线虫为：N2野生型秀丽隐杆线虫，来自于江南大学食品生物技术中心菌种保藏中心。

下述实施例中所涉及的油红O染色液购自：Solarbio(货号：G1262)，地塞米松购自：麦克林(货号：D829854)，异硫氰酸荧光素(FITC)购自：Solarbio(货号：F8070)。

下述实施例中涉及的培养基如下：

BHI固体培养基：蛋白胨10.0g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、琼脂15.0g/L，pH值调至7.0±0.2(25℃)。

BHI液体培养基：蛋白胨10.0g/L、脱水小牛脑浸粉12.5g/L、脱水牛心浸粉5.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖2.0g/L、磷酸氢二钠2.5g/L，pH值调至7.0±0.2(25℃)。

石榴汁发酵液：NFC石榴汁、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、2g/L K2HPO4、2g/L柠檬酸二胺，pH值调至7.0±0.2(25℃)。

NGM培养基：蛋白胨2.5g/L、氯化钠3.0g/L、氯化钙0.111g/L、硫酸镁0.12g/L、胆固醇0.005g/L、磷酸二氢钾3.4g/L、琼脂17.0g/L，pH值调至7.3±0.2(25℃)。

LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L，琼脂15.0g/L，pH值调至7.0±0.2(25℃)。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L，pH值调至7.0±0.2(25℃)。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

Uro-A的含量的检测，采用HPLC检测Uro-A的含量，使用Q Exactive液质联用仪进一步确认产物Uro-A的存在：

HPLC检测：使用Waters 1525液相色谱仪，液相柱X Bridge○RC18(250×4.6mm,5μm)；流动相：0.1％甲酸水(A相)，甲醇(B相)；光谱扫描以确定最大吸收波长，检测器：紫外检测器(UA)306nm；洗脱条件：流速1.0ml/min，梯度洗脱。安石榴苷具有两种同分异构体，分别为α型和β型，且不断相互转化。α-安石榴苷出峰时间：8.5min；β-安石榴苷出峰时间：18.1min。Uro-A出峰时间：19.1min(图3)。

LCMS检测：使用Q Exactive液质联用仪，色谱柱C18，流动相：0.1％甲酸水(A相)，乙腈(B相)。EA，出峰时间为8.68min，分子式为C14H6O8，实际m/z为303.01184；Uro-A，出峰时间为10.88min，分子式为C13H8O4，实际m/z为229.04840；Uro-A二级碎片的m/z为229.05040、185.06015、157.06517。(LCMS/MS相关数据见图4)。

实施例1：目标的筛选、鉴定、培养、观察和保藏

1、筛选

单宁酰基水解酶(GenBank:AIR09580.1)可水解没食子单宁中的酯键和缩酚键，生成没食子酸和葡萄糖，而ETs水解产生EA也是通过该途径，即该酶可能起到水解ETs产生Uro-A的作用。此外，EA被肠道菌群代谢成Uro-A的过程涉及三类酶：酯酶、脱羧酶、邻苯二酚-脱羟基酶，核心是邻苯二酚-脱羟基酶。从NCBI获得可能具有这些催化功能的酶序列，包括酯酶(GenBank:VWA42738.1)，其可水解乙酸苯酯等芳香族酯类，将酯键水解为羧基和羟基；没食子酸脱羧酶(UniProtKB:F9US27)，其可分别催化没食子酸和原儿茶酸脱去苯环上的羧基生成邻苯三酚和儿茶酚；多巴胺脱羟基酶(GenBank:RDC23575.1)、氢化咖啡酸脱羟基酶(GenBank:RDC18391.1)、儿茶素脱羟基酶(GenBank:RDC23615.1)、多巴脱羟基酶(GenBank:RDB62136.1)、木脂素脱羟基酶(GenBank:RDB65137.1)等，它们具有邻苯二酚-脱羟基酶酶活性，可在苯环上的不同位点脱去酚羟基。我们分别将这些酶的序列在本地基因组数据库进行BLAST比对，筛选出相似度≥70％、覆盖率≥30％的菌株，获得共计168株。然后取这些菌分别进行体外发酵，发酵液经处理后，再通过waters液相(HPLC)和QE高分辨液质联用分析仪(LCMS)检测，筛选出具有转化ETs产生Uro-A的菌株，此次筛选得1株菌(具体筛选流程可见图1)。

2、鉴定

提取筛选得到的菌株的基因组，将菌株的16S rDNA进行扩增和测序(扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列再NCBI-Blast中进行核酸序列比对，结果显示菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌CCFM1290；

其中，16S rDNA扩增所用引物如下：

27F(正向)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA-3’；

1492R(反向)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

16S rDNA扩增程序如下：

94℃5min；共重复30个循环(94℃30s；55℃30s；72℃2min)；72℃10min；12℃2min。

3、培养和观察

挑取植物乳杆菌CCFM1290的单菌落接入BHI固体培养基，37℃培养48h，观察菌株在BHI固体培养基上的菌落特征(具体特征可见图2)。

观察可得，所述植物乳杆菌在BHI固体培养基上的菌落凸起，呈白色、光滑、圆形状，直径约3mm。

4、保藏

挑取植物乳杆菌CCFM1290的单菌落接入BHI液体培养基，37℃培养36h，取1.0mL菌液至菌种保藏管，平行5份，6000rpm离心3min，于超净台中弃去上清，加入1.0mL30％(m/m)无菌甘油生理盐水，用旋涡振荡器充分混匀后，于-80℃保藏。

实施例2：植物乳杆菌CCFM1290发酵石榴汁制备尿石素A

1、植物乳杆菌CCFM1290制备尿石素A

(1)植物乳杆菌CCFM1290的活化

用接种环从上述保菌管中蘸取植物乳杆菌CCFM1290的菌液在BHI固体培养基上划线，植物乳杆菌CCFM1290在恒温恒湿培养箱37℃有氧条件下培养24～48h；挑取单菌落接种至BHI液体培养基中于37℃有氧培养24h，取摇匀后的液体培养基以2％的接种量(v/v)接种到新的BHI液体培养基中培养，重复3次该操作进行活化培养，得到活化的菌液。

(2)石榴汁发酵液的制备

取定量市售NFC石榴汁，加入10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、2g/L K

(3)植物乳杆菌CCFM1290的发酵

将步骤(1)获得的活化的菌液以2％(v/v)的接种量接种至步骤(2)所述的石榴汁发酵液，于37℃环境下200rpm震荡培养72h，并分别在0、18、27、48、72h处取发酵液。

4、Uro-A的提取

取1mL发酵液，分别用1ml乙醚、乙酸乙酯连续萃取3次，用冷冻真空离心浓缩仪处理萃取液至近干状，加入1mL色谱级甲醇，超声30min促溶，过0.22μm有机系滤膜后，转移至进样瓶中，检测尿石素A(Uro-A)含量。结果如表1所示：

表1：不同发酵时间的Uro-A的产量

结果显示，植物乳杆菌CCFM1290在石榴汁中可将ETs(安石榴苷)转化为Uro-A，随着菌体的生长，发酵液中的Uro-A的含量逐渐增加；发酵至48h后，发酵液中Uro-A产量保持基本稳定状态(图5)。

2、植物乳杆菌CCFM1290后生元的制备

(1)后生元制备：

取植物乳杆菌CCFM1290活化后的菌液以2％(v/v)的接种量接种于石榴汁发酵液中，于37℃环境下200rpm震荡培养48h，取发酵48h处的石榴汁发酵液进行过滤，滤液杀菌并3000rpm离心15min，收集上清液，获得所述后生元。

实施例3：复合制剂的制备

具体步骤如下：

(1)植物乳杆菌CCFM1290的菌粉的制备

蘸取植物乳杆菌CCFM1290菌液并划线，37℃有氧倒置培养18-24h；挑取单菌落至MRS液体培养基，于37℃下200rpm震荡培养20h后，充分混匀，然后取菌液按2％(v/v)的接种量接种至新的MRS液体培养基中于相同环境下培养，重复这个步骤3～5次，最终制备得到种子液；

将制备得到的种子液以2～4％(v/v)的接种量接种于MRS培养基中培养18～36h，离心收集菌泥，磷酸缓冲液充分漂洗3～5次，用冻干保护剂重悬至10

其中，所述冻干保护剂成分为10％脱脂奶粉、3％甘油、10％麦芽糊精、15％海藻糖，将这些冻干保护剂原料与饮用水混合充分溶解并115℃灭菌20min。

(2)将步骤(1)植物乳杆菌CCFM1290菌粉与石榴冻干粉、桑葚冻干粉按质量比为5：1.5：0.5的比例进行混合，经检测，所述合生制剂中植物乳杆菌CCFM1290活菌数为(1.5-1.7)×10

实施例4：发酵产品和复合制剂对秀丽隐杆线虫的作用

具体步骤如下：

1、大肠杆菌OP50的培养

用接种环从保菌管中蘸取大肠杆菌OP50的菌液在LB固体培养基上划线，大肠杆菌在恒温恒湿培养箱37℃有氧条件下培养18h；挑取单菌落接种至LB液体培养基中，再在恒温恒湿培养箱37℃有氧培养18h，混匀后按1.5％(v/v)的接种量接种于新的LB液体培养基中培养，重复这个操作3次，得到活化的菌液。

2、秀丽隐杆线虫的复苏、传代及同步化

于-80℃冰箱取出1管dauer“多尔阶段”幼虫期的线虫，再在37℃水浴锅中迅速融化后涂布于接种大肠杆菌OP50的NGM培养基上，置于20℃恒温恒湿培养箱里培养。传代时，用酒精灯灼烧后的手术刀切下面积1cm

用M9缓冲溶液收集NGM培养基上的秀丽隐杆线虫并洗去多余的大肠杆菌OP50，静止10min使得虫体及虫卵沉淀到底部，弃去上清，按含有秀丽隐杆线虫的M9缓冲液：5％NaClO：1M NaOH＝2：1：2的体积比例混合，在漩涡振荡器上持续震荡5min，待虫体裂解完全后立即6000rpm离心2min，弃去上清，加入M9缓冲溶液润洗，反复清洗3～5次以充分除去残余的裂解液，最后将虫卵置于5mL M9缓冲溶液中并于20℃摇床培养，虫卵基本上于18～24h内孵化完成，得到同步化线虫。

3、植物乳杆菌CCFM1290发酵石榴汁得到的发酵制品对线虫的影响

(1)植物乳杆菌CCFM1290发酵石榴汁得到的发酵液(发酵制品)：

按照实施例2中的步骤1的方法，取步骤(3)得到的发酵48h的石榴发酵液；

(2)未发酵石榴汁提取物：

取定量市售NFC石榴汁，加入10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、2g/L K

(3)先用等量乙醚和乙酸乙酯连续3次充分萃取石榴汁发酵液/未发酵石榴汁，再冷冻离心浓缩至干，然后加入1/100原发酵液体积的DMSO，最后再用OP50菌液稀释到原体积(即DMSO的终浓度为1％)，即获得石榴汁发酵提取物(实验组1)；

未发酵石榴汁提取物为对照组1；

(4)分别取步骤(3)得到的80μL石榴汁发酵提取物、未发酵石榴汁提取物均匀铺至NGM培养基表面，分别得干预式NGM培养基。

(5)取步骤2获得的同步化线虫于正常NGM培养基培养48h至L4期，再将线虫转移至步骤(4)得到的干预式NGM培养基实现对线虫的干预，平均2天将线虫转移至新的干预式NGM培养基。从线虫L4期到死亡的整个过程，线虫都暴露在干预式NGM培养基中的化合物中。

在20℃、每2天更换一次培养基、每个干预用的培养基额外含有150μM 5-氟-2'-脱氧尿苷(抑制线虫产卵，防止其子代对实验的影响)条件下，持续干预8天。

4、复合制剂的处理

(1)将实施例3制备得到的复合制剂为实验组2；

(2)大肠杆菌OP50菌粉(菌浓≥2.1×10

(3)分别将对照组2和实验组2这两组粉剂水溶后，分别涂至NGM平板，以此来干预线虫的生长：

将同步化后的线虫使用正常NGM培养基进行培养48h(L4期)后，将线虫转移至步骤得到的已添加上述粉剂的NGM培养基中进行干预，并且为了保持NGM培养基中提取物浓度的稳定，平均每两天将线虫转移至新的含有上述粉剂的NGM培养基。

在20℃、每2天更换一次培养基、每个干预用的培养基额外含有150μM 5-氟-2'-脱氧尿苷(抑制线虫产卵，防止其子代对实验的影响)条件下，持续干预8天。

实施例5：发酵制品和复合制剂对秀丽隐杆线虫寿命、运动能力的影响

1、秀丽隐杆线虫寿命的检测

具体实施方式同实施例4。实验组别分为：对照组1(石榴汁提取物)、对照组2(大肠杆菌OP50菌粉+相应膳食)、实验组1(发酵产品提取物)和实验组2(复合制剂)。

干预的实验过程中，每天观察线虫的存活情况，直到最后一条线虫死亡为止。

寿命测试期间，每2天转移一次线虫，以免细菌污染并保持平板中发酵液Uro的浓度。

结果显示(图6)：

(1)与对照组1相比，实验组1(发酵产品提取物)从L4期开始干预秀丽隐杆线虫直至死亡，其寿命延长了32.05％。

(2)与对照组2相比，实验组2(复合制剂)从L4期开始干预秀丽隐杆线虫直至死亡，其寿命延长了21.88％。

2、秀丽隐杆线虫肌肉状态的检测

地塞米松是一种诱导线虫肌肉损伤的药物，并在本发明中，我们通过线虫的运动能力变化(游动频次)来表征其体壁肌肉。

(1)具体实施方式同实施例4，区别在于：

将步骤3的第(5)调整为：取步骤2获得的同步化线虫于正常NGM培养基培养48h至L4期，再将线虫转移至步骤(4)得到的干预式NGM培养基实现对线虫的干预，同时，向培养基中添加10μM地塞米松，平均2天将线虫转移至新的含有10μM地塞米松的干预式NGM培养基；于20℃下培养36h；

将步骤4的的第(3)调整为：将同步化后的线虫使用正常NGM培养基进行培养48h(L4期)后，将线虫转移至步骤得到的已添加上述粉剂的NGM培养基中进行干预，同时，向培养基中添加10μM地塞米松，并且为了保持NGM培养基中提取物浓度的稳定，平均每两天将线虫转移至新的含有上述粉剂、10μM地塞米松的NGM培养基，于20℃下培养36h。

空白组为：取步骤2获得的同步化线虫于正常NGM培养基培养48h至L4期，再将线虫转移至正常NGM培养基培养，于20℃下培养36h。

(2)培养结束后，将各组线虫转移至添加了M9缓冲液(pH为：7.4)的NGM平板中，待线虫适应5min后，记录线虫的游动频次(以其身体由左往右再往左摆动记为游动一次)。

结果显示：

(1)与对照组1相比，发酵产品提取物(实验组1)将秀丽隐杆线虫游动频次提高了33.84％(图7)；

(2)与对照组2相比，实施例3制备得到的复合制剂(实验组2)将秀丽隐杆线虫游动频次提高了27.99％(图7)；

表明通过给予发酵产品提取物及复合制剂，能够有效改善肌肉健康状况。

实施例6：植物乳杆菌对秀丽隐杆线虫的作用

已知衰老会使得线虫体内的脂代谢失调，从而脂滴出现异常积累。且脂滴容易受到ROS的侵袭，出现脂质过氧化，从而加剧细胞的衰老。

具体步骤如下：

1、大肠杆菌OP50的培养

用接种环从保菌管中蘸取大肠杆菌OP50的菌液在LB固体培养基上划线，大肠杆菌在恒温恒湿培养箱37℃有氧条件下培养18h；挑取单菌落接种至LB液体培养基中，再在恒温恒湿培养箱37℃有氧培养18h，混匀后按1.5％(v/v)的接种量接种于新的LB液体培养基中培养，重复这个操作3次，最终得到活化的菌液。

2、秀丽隐杆线虫的复苏、传代及同步化

于-80℃冰箱取出1管dauer“多尔阶段”幼虫期的线虫，再在37℃水浴锅中迅速融化后涂布于接种大肠杆菌OP50的NGM培养基上，置于20℃恒温恒湿培养箱里培养。传代时，用酒精灯灼烧后的手术刀切下面积1cm

用M9缓冲溶液收集NGM培养基上的秀丽隐杆线虫并洗去多余的大肠杆菌OP50，静止10min使得虫体及虫卵沉淀到底部，弃去上清，按含有秀丽隐杆线虫的M9缓冲液：5％NaClO：1M NaOH＝2：1：2的体积比例混合，在漩涡振荡器上持续震荡5min，待虫体裂解完全后立即6000rpm离心2min，弃去上清，加入M9缓冲溶液润洗，反复清洗3～5次以充分除去残余的裂解液，最后将虫卵置于5mL M9缓冲溶液中并于20℃摇床培养，虫卵基本上于18-24h内孵化完成，得到同步化线虫。

3、植物乳杆菌对秀丽隐杆线虫的作用

(1)同步化后的线虫在接种含有大肠杆菌OP50的NGM平板上生长48h至L4期，然后转移至分别涂有1.0×10

(2)在衰老期(培养至第8天)，用M9缓冲溶液清洗并收集平板上的线虫，向收集的溶液中加入固定液固定30min，弃去固定液，加入现配制的油红O染色液，浸染20min，再用M9缓冲液洗涤3次以除去染液，最后于显微镜下明场观察线虫油红O染色强度并拍照，然后使用ImageJ软件对染色强度进行量化，以平均光密度值来表征线虫的脂滴积累水平。

结果显示：相比于喂食大肠杆菌OP50，通过喂食植物乳杆菌可显著抑制线虫体内的脂滴积累，可降低21.21％的脂滴含量(图8)；

4、同时给予秀丽隐杆线虫大肠杆菌OP50和FITC标记后的植物乳杆菌CCFM1290，1天后，通过测定线虫体内荧光来确定秀丽隐杆线虫在有大肠杆菌OP50存在的条件下是否摄入植物乳杆菌CCFM1290，具体如下：

(1)用DMSO将FITC配制成1mM的溶液；

(2)将植物乳杆菌CCFM1290在37℃MRS培养液中生长到OD600＝0.6，然后用MRS培养基稀释为OD600＝0.3，得到细菌培养液；

(3)将配制好的FITC溶液以1％(v/v)的比例加入到上述细菌培养液中并混匀(即探针FITC终浓度为100μM)，在37℃中孵育30min，然后用M9缓冲液洗去游离的FITC；

(4)取标记FITC后的植物乳杆菌菌液与等量大肠杆菌OP50菌液混合，然后铺至NGM固体培养基上，待固体培养基吹干后，向其转移同步化线虫，于20℃暗环境下培育1天，再用M9缓冲液将虫冲洗至ep管，用M9缓冲液冲洗3次以洗去多余的菌，最后通过荧光倒置显微镜检测秀丽隐杆线虫是否摄入植物乳杆菌。

结果显示(图9)，通过在荧光显微镜下检测异硫氰酸荧光素(FITC)标记的植物乳杆菌CCFM1290，证实了线虫肠道中存在植物乳杆菌CCFM1290(图9b)，表明在有大肠杆菌OP50存在的情况下，线虫也能摄入植物乳杆菌CCFM1290，即植物乳杆菌CCFM1290发挥功效时，并不会影响线虫的正常进食。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。