使用超滤/渗滤制备寡核苷酸组合物的方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2020年2月21日提交的美国临时申请号62/979,687的申请日的权益，其全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本申请总体涉及生物制药技术，更具体地涉及使用能够控制寡核苷酸组合物中盐含量的过滤技术制备高纯度寡核苷酸组合物的方法。本公开的方法成功地将超滤/渗滤(UF/DF)的使用与冻干联系起来，其方式是避免需要进行通常用于生产冻干(固体)活性药物成分(API)的额外的加工步骤。

背景技术

寡核苷酸是可以化学合成用于研究和医学目的的短DNA或RNA寡聚物。寡核苷酸通常通过逐步添加核苷酸残基以产生特定序列来制备。在完成所需序列中的寡核苷酸的合成之后，目标寡核苷酸通常作为与失败序列和其他过程和产品相关杂质的混合物一起获得。

用于治疗用途的寡核苷酸的制备，诸如由FDA批准使用的商业寡核苷酸，由于严格的商业规格和药物产品验证要求而变得更加复杂。治疗性寡核苷酸的合适纯化和配制技术必须考虑产品的化学组成和稳定性，以及施用方式。

治疗性寡核苷酸通常使用水基平台方法或冻干API平台方法制备，具体取决于所需药物产品的形式。对于一些基于稳定性特征、易于储存和易于加工的产品，冻干(固体)药物产品可能优于液体药物产品。

(诺西那生钠)是一种用于治疗脊髓性肌肉萎缩症(SMA，一种罕见的神经肌肉疾病)的反义寡核苷酸(ASO)药物。市售的/>

发明内容

本公开描述了使用超滤/渗滤(UF/DF)来浓缩和缓冲液交换寡核苷酸的方法，以获得适合于冻干的寡核苷酸水溶液而无需额外的(中间)处理步骤。图1示出了本公开的方法如何能够以消除通常在冻干步骤之前进行基于溶剂的沉淀的需要的方式将使用UF/DF的水基平台方法与冻干API平台方法相结合。

特别地，本文公开的方法能够控制寡核苷酸API中冻干前和冻干后的钠含量以及冻干后的乙酸盐含量以满足预定的钠盐和乙酸盐规格。这通过控制UF/DF水性缓冲溶液中的组分(例如盐)来实现。本文所述的方法还能够在制造商推荐的跨膜压力(TMP)条件下进行UF/DF步骤的同时控制寡核苷酸的膜渗透通量和渗余物浓度。

本公开的一个方面涉及一种制备包含寡核苷酸的组合物的方法，其中该方法包括对寡核苷酸的水溶液进行超滤/渗滤(UF/DF)以形成包含寡核苷酸的渗余物，并且其中超滤/渗滤(UF/DF)使用包含一种或多种盐的水性缓冲溶液进行。

本公开的另一方面涉及包含寡核苷酸的组合物，其中组合物通过本文所述的方法之一获得。

在一些实施方案中，组合物是包含寡核苷酸的水溶液的形式。

在一些实施方案中，组合物是包含寡核苷酸的冻干组合物的形式。

本公开的另外的目的、优点和其他特征将部分地在下面的描述中阐述，并且部分地对于本领域普通技术人员在检查以下内容后将变得显而易见，或者可以从本公开的实践中获知。如所附权利要求中特别指出的，可以实现和获得本公开的优点。如将认识到的，本公开能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显方面进行修改，所有这些均不脱离本公开。在这点上，本文的描述应被理解为本质上是说明性的，而不是限制性的。

附图说明

图1描绘了溶剂密集型方法与本公开的水基方法的示例性结合。

图2是示出当在不同乙酸铵浓度下进行UF/DF时在缓冲液交换期间渗透通量下降的图。

图3是示出当DF缓冲液电导率增加时DF缓冲液对第二稳态渗透通量的影响的图。

图4是示出渗余物中最大ASO浓度与UF/DF缓冲液中乙酸盐总浓度的关系图。

图5是示出钠和铵含量的冻干之后(冻干后)趋势的图。

图6是示出UF/DF后渗余物中的钠(Na)含量与含有不同量乙酸铵(NH

图7是具有LyoGuard托盘的示例性冻干室的图片。

图8是托盘和袋中的示例性冻干ASO材料的图片。

图9是示出当在水中进行UF/DF时渗透通量如何随着渗余物中寡核苷酸浓度的增加而下降的图。

图10是示出固体API中剩余的乙酸盐(OAc)的质量百分比(％)与UF缓冲液中乙酸盐(OAc)的总浓度的关系图。

图11示出了示例性水基平台方法与包括乙醇沉淀步骤的示例性冻干API平台方法之间的比较。

图12示出了钠(Na

具体实施方式

本文公开了将超滤/渗滤(UF/DF)的使用结合到传统上用于制备固体形式的寡核苷酸活性药物成分(API)的冻干API平台方法中的方法。本公开的实施方案包括制备用于治疗用途的寡核苷酸的方法，诸如反义寡核苷酸

水基平台方法通常包括一个或两个色谱分离步骤、一个脱保护步骤，并以超滤/渗滤(UF/DF)步骤结束，该超滤/渗滤步骤浓缩感兴趣的寡核苷酸并将缓冲液交换成适于鞘内(IT)施用的液体制剂。该平台将液体药物物质从UF/DF操作递送到肠胃外填充设备，用于最终稀释、过滤和填充。相比之下，冻干API平台方法通常利用溶剂基纯化方法。图11示出了用于制备

通过将乙醇沉淀步骤替换为水基平台方法中使用的UF/DF步骤来改进目前用于制备商业

将UF/DF结合到大规模冻干中的困难主要是由于UF/DF产生的含水渗余物中的盐含量和/或寡核苷酸含量。然而，需要

本公开的方法通过控制缓冲溶液中的盐浓度和盐含量成功地克服了这些困难。这些方法将水性纯化方法与冻干步骤相结合，以产生具有预先确定的钠和乙酸盐规格的固体API，而无需添加额外的步骤和/或设备。UF/DF方法的成功取决于UF/DF操作(通量和浓度)的可操作性和UF/DF后产品通过冻干处理后的固体API的组成。开发了UF/DF方法，其中通过UF/DF浓缩和处理不仅含有目标寡核苷酸而且含有纯化过程中涉及的各种分子种类的纯化过程中间体，使得冻干后达到目标钠含量，并且冻干后满足乙酸盐规格。本公开的UF/DF方法通过控制占据沿着带负电荷的硫代磷酸酯或磷酸二酯寡核苷酸主链的抗衡离子位置的钠阳离子的平均数量来实现对总钠含量的控制。新方法还通过满足大规模生产工艺所需的最小膜渗透通量和最大渗余物浓度来促进UF/DF方法的有效操作。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与相关领域普通技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

除非另有说明，否则所有百分比、份数、比率等均以重量计。

当量、浓度或其他值或参数作为范围或一系列上限值和下限值给出时，这应理解为具体公开了由任何一对任何上限值和下限值形成的所有范围，而不管范围是否单独公开。在本文中列举数值范围的情况下，除非另有说明，否则该范围旨在包括其端点，以及该范围内的所有整数和分数。并不旨在将本公开的范围限于在定义范围时所列举的具体值。

使用“一个”或“一种”来描述本文中的各种要素和组分仅是为了方便并且给出本公开的一般含义。该描述应被理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且单数也包括复数，除非清楚地表明其他意图。

当使用指定的量或值时，应理解为包括与指定的量或值的轻微偏差，本领域技术人员应理解为与指定的量或值等同或基本相同。在一些实施方案中，指定的量或值涵盖指定的量或值的±10％。在一些实施方案中，指定的量或值涵盖指定的量或值的±5％。

本公开的一个方面涉及用于制备含有寡核苷酸的组合物诸如

在一些实施方案中，水性缓冲溶液中的一种或多种盐可以以最终控制渗余物的组成的方式配制。例如，在一些实施方案中，可以配制水性缓冲溶液以控制由UF/DF产生的渗余物的钠含量，从而间接控制冻干产品的钠含量。这种控制能够通过在水性缓冲溶液中存在多种盐(包括钠盐和具有与钠不同的阳离子的竞争性盐)来实现。竞争性盐包括例如具有不同阳离子(诸如铵、二甲铵、三甲铵、钾、锂、铷、铜、银或其他合适的一价阳离子)的盐。竞争性盐可以是挥发性盐、非挥发性盐或它们的组合。

在一些实施方案中，至少一种竞争性盐的使用使得本公开的方法能够控制占据寡核苷酸主链的抗衡离子位置的钠阳离子的平均数量。图12示出了钠(Na

在同时含有钠阳离子和竞争性阳离子的水溶液发生缓冲液交换后，钠阳离子和竞争性阳离子在寡核苷酸上的抗衡离子位置上达到平衡，从而导致溶液中的寡核苷酸没有完全被钠化，即寡核苷酸抗衡离子位置没有完全被钠阳离子占据。参见图12。该平衡比可以表示如下：

并且由在UF/DF方法过程中使用的水性缓冲溶液中竞争性阳离子与钠阳离子的摩尔比控制。

竞争性盐的性质不仅可以影响UF/DF方法后的渗余物的组成，而且还可以影响冻干后的固体产品的最终组成。例如，当竞争性盐是挥发性盐时，可以降低冻干产品的总盐含量(相对于渗余物的总盐含量)而不影响钠含量。

在一些实施方案中，包含在水性缓冲溶液中的一种或多种盐可以包括至少一种挥发性盐。本公开的利用挥发性盐的UF/DF方法可以在具有所需钠含量的渗余物溶液中实现最大ASO浓度。由于挥发性盐的酸-碱性质，可以使用挥发性竞争性盐来降低冻干产品中的总盐含量(相对于渗余物的总盐含量)。在挥发性竞争性盐中，盐的挥发性竞争性阳离子与相应的挥发性共轭碱平衡存在。竞争性阳离子物质(以与其相应共轭碱呈中性形式)的挥发性允许其在冻干过程中通过升华除去。

乙酸铵(NH

在上面所示的平衡中，质子化的铵阳离子用作将乙酸根阴离子转化为乙酸的质子源，乙酸是挥发性的并且可以通过冻干除去。从铵到乙酸盐的质子转移使得这两种物质呈中性和挥发性，便于在冻干过程中除去这两种物质。

其他示例性的挥发性竞争性盐包括例如甲酸、丙酸、丁酸、乳酸和碳酸的铵盐。

通过使用挥发性竞争性盐，诸如上述的乙酸铵，UF/DF后渗余物的后续冻干可以以除去显著量的挥发性竞争性盐同时仍保持渗余物的钠含量的方式进行。因此，可以通过使用挥发性竞争性盐来制备冻干的寡核苷酸组合物，该冻干的寡核苷酸组合物的钠含量基于水性缓冲溶液的组成来控制，同时其总盐含量显著低于UF/DF后渗余物的总盐含量。通过该特征，本公开的方法可以产生具有预定钠含量的固体寡核苷酸API，同时将竞争性盐去除至痕量。

在一些实施方案中，竞争性盐可以是不通过冻干去除的非挥发性盐。例如，水性缓冲溶液可以包括钠盐，诸如乙酸钠、氯化钠、溴化钠或碘化钠，以及非挥发性竞争性盐，诸如乙酸钾、氯化钾、溴化钾或碘化钾。其他非挥发性竞争性盐包括例如钾盐、锂盐(例如乙酸锂、氯化锂、溴化锂或碘化锂)、铷盐(例如乙酸铷、氯化铷、溴化铷或碘化铷)、铜盐(例如乙酸铜、氯化铜、溴化铜或碘化铜)和银盐(例如乙酸银、氯化银、溴化银或碘化银)。

在本公开的方法中，可以控制水性缓冲溶液的组成以实现UF/DF后渗余物和冻干后产品中的宽范围的钠含量，从基本上零钠含量到远大于完全钠化的ASO的当量的钠含量。

在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含选自乙酸钠、乙酸铵和乙酸钾的至少一种盐。在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含乙酸钠和乙酸铵。在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含乙酸钠和乙酸钾。在其他实施方案中，水性缓冲溶液包含乙酸钠、乙酸铵和乙酸钾。

在一些实施方案中，通过调节至少一种钠盐相对于水性缓冲溶液中盐的总浓度的比例来控制含寡核苷酸的渗余物中的钠含量(例如钠浓度)。在其他实施方案中，通过调节至少一种钠盐相对于水性缓冲溶液中盐的总浓度的比例来控制渗余物中占据寡核苷酸的抗衡离子位置的钠阳离子的比例。

在一些实施方案中，水性缓冲溶液中包含的钠盐与竞争性盐的摩尔比范围为1:100至100:1、或1:20至20:1、或1:10至10:1、或1:1至19:1、或5:1至19:1、或12:1至15:1、或5:1至10:1、或5:1至6:1、或5:1至6:1.8范。

在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含乙酸钠和乙酸铵，并且水性缓冲溶液中乙酸钠与乙酸铵的摩尔比范围为1:100至100:1、或1:20至20:1、或1:10至10:1、或1:1至19:1、或5:1至19:1、或12:1至15:1、或5:1至10:1、或5:1至6:1、或5:1至6:1.8。在一些实施方案中，乙酸钠与乙酸铵的摩尔比为17:3。在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含34mM乙酸钠和6mM乙酸铵。

在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含乙酸钠和乙酸钾，并且水性缓冲溶液中乙酸钠与乙酸钾的摩尔比范围为1:100至100:1、或1:20至20:1、或1:10至10:1、或1:1至19:1、或5:1至19:1、或12:1至15:1、或5:1至10:1、或5:1至6:1、或5:1至6:1.8。在一些实施方案中，乙酸钠与乙酸钾的摩尔比为17:3。在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含34mM乙酸钠和6mM乙酸钾。

在一些实施方案中，水性缓冲溶液的pH范围为4.0至10.0、或4.5至9.5、或5.0至9.0、或5.0至8.5、或5.0至8.0、或5.5至9.0、或5.5至8.5、或5.5至8.0、或5.5至7.5、或6.0至9.0、或6.0至8.5、或6.0至7.5、或6.0至7.0、或6.5至9.0、或6.5至8.5、或6.5至8.0、或6.5至7.5、或6.9至7.5。

在一些实施方案中，水性缓冲溶液不含任何钠盐，使得UF/DF后渗余物不含钠。在其他实施方案中，水性缓冲溶液不含任何竞争性盐。

在一些实施方案中，本公开的方法可以包括冻干UF/DF渗余物以产生包含目标寡核苷酸的冻干组合物的步骤。冻干可以除去挥发性UF/DF缓冲液组分(例如挥发性竞争性盐，诸如乙酸铵盐)。冻干步骤可以作为单次冻干进行，或者可以作为单个冻干设备或多个冻干设备中发生的多次冻干进行。

在一些实施方案中，包含在冻干组合物中的一种或多种竞争性盐的比例小于包含在UF/DF后渗余物中的一种或多种竞争性盐的比例。例如，如上所述，水性缓冲溶液中的挥发性竞争性盐诸如乙酸铵随后可以在冻干过程中除去(部分或全部)。

本公开的方法还可以包括在进行冻干之前调节UF/DF后渗余物的pH的步骤。在一些实施方案中，将渗余物的pH调节至5.0至9.0、或5.0至8.5、或5.0至8.0、或5.5至9.0、或5.5至8.5、或5.5至8.0、或5.5至7.5、或6.0至9.0、或6.0至8.5、或6.0至7.5、或6.0至7.0、或6.5至9.0、或6.5至8.5、或6.5至8.0、或6.5至7.5范围内的pH。在一个实施方案中，将渗余物的pH调节至6.9至7.5范围内的pH。

本公开的方法能够非常精确地控制冻干组合物中所含的钠的比例。在一些实施方案中，相对于冻干组合物的总重量，冻干组合物中钠的重量百分比范围为0％至100％、或0％至50％、或1％至25％、或1％至10％、或2％至10％、或1％至5％、或5％至10％、或4.3％至6.1％、或4.8％至5.4％、或4.9％至5.0％。在一些实施方案中，冻干组合物中钠的重量百分比为5.2％±0.9％。在一些实施方案中，寡核苷酸是诺西那生钠并且钠在诺西那生钠的冻干组合物中的重量百分比为5.2％±0.9％。

对于本公开的方法，可以通过调节水性缓冲溶液中的盐的总浓度(并因此调节电导率)来间接控制UF/DF后渗余物中的寡核苷酸的浓度。尽管使用去离子水进行UF/DF将保持完全钠化的ASO的钠含量，但由于渗透通量和最大渗余物浓度的限制，在可以直接冻干的纯水中进行寡核苷酸的UF/DF是不可行的。发现寡核苷酸在水中的UF/DF处理受到膜表面胶凝或浓差极化现象的限制，导致膜渗透通量降低并产生仅30-40g/L的最大可实现渗余物浓度。

为了成功操作UF/DF并达到冻干理想的ASO浓度(即，至少50g/L)，发现在UF/DF缓冲液中需要最小量的盐浓度(和电导率)。盐浓度和电导率对渗透通量的影响如图2和图3所示。如图2的研究所示，当使用不同浓度的乙酸铵进行一系列UF/DF方法时，观察到当使用较低浓度的乙酸铵时渗透通量显著降低，并且随着UF/DF的渗滤体积数增加，渗透通量进一步显著降低。如图3所示，在给定TMP下，总盐浓度与膜渗透通量成正比。

基于该观察结果，发现水性缓冲溶液中的总盐浓度可用于控制UF/DF方法的渗透通量和UF/DF后渗余物中的寡核苷酸浓度。如图4的研究所示，发现最终渗余物ASO浓度可以通过增加水性缓冲溶液中乙酸盐的浓度来增加。因为水性缓冲溶液中的总盐浓度的增加导致渗透通量和渗余物中寡核苷酸的最大浓度两者的增加，所以本公开的方法可用于实现所需的渗透通量和适当高的渗余物浓度，以实现大规模冻干而无需额外(即，溶剂去除)步骤。

在一些实施方案中，水性缓冲溶液中一种或多种盐的总浓度范围为1mM至500mM、或10mM至200mM、或20mM至100mM、或30mM至60mM、或35mM至45mM。在一些实施方案中，水性缓冲溶液中一种或多种盐的总浓度为40mM。

当乙酸盐用作水性缓冲溶液的组分时，可能需要在冻干过程中将这些盐去除至痕量水平。如图10的研究所示，还发现固体API中的乙酸盐含量与水性缓冲溶液中的总盐浓度成正比(并且因此与总乙酸盐浓度成正比)。因此，可以控制UF/DF缓冲液的总乙酸盐含量，以将固体API中的乙酸盐降低至痕量水平。在一些实施方案中，由于在冻干过程中除去挥发性乙酸盐，使用挥发性乙酸盐诸如乙酸铵可进一步降低最终乙酸盐含量。

在一些实施方案中，水性缓冲溶液包含乙酸钠和乙酸铵，并且水性缓冲溶液中乙酸钠和乙酸铵的总浓度范围为1mM至500mM、或10mM至200mM、或20mM至100mM、或30mM至60mM、或35mM至45mM。在一些实施方案中，水性缓冲溶液中乙酸钠和乙酸铵的总浓度为40mM。

在其他实施方案中，水性缓冲溶液包含乙酸钠和乙酸钾，并且乙酸钠和乙酸钾的总浓度范围为1mM至500mM、或10mM至200mM、或20mM至100mM、或30mM至60mM、或35mM至45mM。在一些实施方案中，水性缓冲溶液中乙酸钠和乙酸钾的总浓度为40mM。

在一些实施方案中，相对于冻干组合物的总重量，冻干组合物中乙酸盐的重量百分比小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％、或小于1％、或小于0.8％、或小于0.5％、或小于0.2％。例如，在一些实施方案中，相对于冻干组合物的总重量，冻干组合物中乙酸盐的重量百分比范围为5％至0.1％、或5％至0.5％、或5％至1％、或3％至0.5％、或3％至0.2％、或2％至0.5％、或2％至1％、或1％至0.5％、或1％至0.1％、或0.8％至0.1％、或0.5％至0.1％、或0.2％至0.01％。

可以控制水性缓冲溶液的组成和性质，以使UF/DF方法的渗透通量最大化，参见图2和图3。因此，本公开提供了通过调节水性缓冲溶液中一种或多种盐的总浓度或通过调节水性缓冲溶液的电导率来控制UF/DF方法的渗透通量的方法。在一些实施方案中，UF/DF方法以至少1L·m

还可以执行本公开的方法，使得UF/DF方法能够实现高渗滤体积水平，参见图2。在UF/DF方法过程中增加通过膜的渗滤体积数，同时仍保持可接受的渗透通量水平，使得本公开的方法能够使整个过程的效率和生产率最大化。在一些实施方案中，UF/DF方法以至少3、或至少4、或至少5、或3至10、或5至10、或5至8个渗滤体积进行。

本公开的方法显著增加了UF/DF后渗余物中的寡核苷酸的浓度，这使得能够直接冻干UF/DF后渗余物而无需进行额外的水去除(即浓缩)步骤。在一些实施方案中，渗余物中寡核苷酸的浓度为至少20g/L、至少30g/L、至少40g/L、至少50g/L、或范围为30g/L至150g/L、或范围为50g/L至150g/L、或范围为60g/L至125g/L、或范围为70g/L至125g/L、或范围为70g/L至100g/L、或为80g/L至90g/L。

本公开的方法可以利用本领域已知的任何合适的UF/DF过滤膜。例如，在一些实施方案中，使用截留分子量(MWCO)为1kDa至10kDa、或1kDa至7kDa、或1kDa至5kDa、或2kDa至4kDa的膜进行UF/DF方法。在一些实施方案中，膜具有3kDa的MWCO。

在一些实施方案中，使用切向流过滤进行UF/DF步骤。

本公开的方法可以应用于具有10至50个核苷酸、10至30个核苷酸、10至25个核苷酸、10至20个核苷酸、16至30个核苷酸、16至25个核苷酸或16至20个核苷酸的任何寡核苷酸(诸如反义寡核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸是诺西那生钠。在一些实施方案中，冻干寡核苷酸组合物是

在一些实施方案中，本公开的方法不限于某些工艺步骤，或限于排除某些工艺步骤。例如，在一些实施方案中，该方法包括进行至少一次超滤/渗滤(UF/DF)以获得渗余物，然后对渗余物进行至少一次冻干以获得包含寡核苷酸的冻干组合物。在其他实施方案中，该方法由以下步骤组成：进行单次超滤/渗滤(UF/DF)以获得渗余物，然后对渗余物进行至少一次冻干以获得包含寡核苷酸的冻干组合物。在其他实施方案中，该方法由以下步骤组成：进行单次超滤/渗滤(UF/DF)以获得渗余物，然后对渗余物进行单次冻干以获得包含寡核苷酸的冻干组合物。

在一些实施方案中，可以进行本公开的方法，使得在进行渗余物的冻干以获得冻干组合物之前，不对渗余物进行(i)额外的过滤，(ii)额外的缓冲液交换，(iii)额外的浓缩，和/或(iv)额外的纯化。在其他实施方案中，可以进行本公开的方法，使得在进行渗余物的冻干以获得冻干组合物之前，不对渗余物进行以下中的任一种：(i)额外的过滤，(ii)额外的缓冲液交换，(iii)额外的浓缩，和/或(iv)额外的纯化。在一些实施方案中，将从UF/DF步骤产生的渗余物直接冻干而无需任何额外的步骤。

本公开的另一方面涉及使用本文所述的方法获得的组合物。在一些实施方案中，组合物包含寡聚核苷酸，诸如

实施例

材料和方法

使用KrosFlo KR2i TFF System(Spectrum Labs)和Pellicon 3(0.11m

实施例1.在水中进行UF/DF

图9总结了为确定使用纯水而不是本公开的水性缓冲溶液的典型UF/DF方法的渗透通量如何随渗余物中寡核苷酸浓度增加而随时间影响而进行的研究的实验结果。在该研究中，使用纯水对含有10g/L

在将α-Syn ASO缓冲液交换到水中后，进行实验以确定通过使用仅含水的缓冲溶液浓缩渗余物可以达到的最大ASO浓度。使用20psi的跨膜压力(TMP)和1.5LMM(升/分钟/米

图9中的研究表明，寡核苷酸在水中的UF/DF处理受到膜表面胶凝或浓差极化现象的限制，这导致膜渗透通量显著降低并产生30-40g/L之间的最大可达到的渗余物浓度。由于30-40g/L的浓度不足以高到在冻干过程中获得所需的饼状结构，因此通常对水中的UF/DF后寡核苷酸进行额外的单元操作以减少体积。

实施例2.水性缓冲溶液中盐浓度对渗透通量的影响

实施例1中的结果表明，由于膜表面胶凝或浓差极化现象导致膜渗透通量降低，在理想API浓度下缓冲液交换到水中是不可行的。然而，发现向水性缓冲溶液中引入盐添加剂可以增加缓冲液交换过程中的渗透通量。尝试缓冲液交换到水中的实验表明，高电导率与高渗透通量相关，并且向渗滤缓冲液中添加盐含量是增加渗透通量的有效方式。

选择乙酸铵作为实验添加剂以增加电导率并因此增加渗透通量。铵和乙酸盐物质均与冻干API平台方法相容，并且因此不会在整个生产工艺中引入任何新物质，并且已知这两种物质在它们的中性状态下易挥发。另外，基于API产品的所需pH，乙酸铵的pH在所需范围内(6.9-7.7)。

进行三个实验研究以绘制乙酸铵浓度与渗透通量之间的关系。用于所有三个实验的起始材料包括105g/L ASO、710mM NaCl和25mM Tris，pH为7.2，并且所有三个实验都使用35psi的跨膜压力(TMP)、3LMM(升/分钟/米

在该研究中，制备三种乙酸铵水性缓冲溶液，其中乙酸铵的浓度设定为50mM、100mM和200mM，并针对对

如图2所示，观察到在整个UF/DF过程中发生的渗透通量的下降与水性缓冲溶液中乙酸铵的浓度成正比。使用浓度为200mM的乙酸铵使得UF/DF方法能够保持大于10L·m

图3总结了为确定水性缓冲溶液的电导率如何影响UF/DF方法的渗透通量而进行的相关研究的实验结果。研究了缓冲液电导率与渗透通量之间的关系以确定UF/DF方法所需的最低盐含量。在该研究中，制备了三种水性缓冲溶液，其中电导率设定为约5.1mS/cm、约9.8mS/cm和约18.9mS/cm，并针对对

如图3所示，发现渗透通量与水性缓冲溶液的电导率成正比，使得渗透通量的增加与缓冲液电导率的增加线性相关。该研究的结果表明，在合适的ASO浓度范围内，乙酸铵是渗透通量的有效促进剂。本研究中稳态通量(图2)和缓冲液电导率(图3)的比较表明存在线性关系，因此具有实现特定通量(图3)的能力，这对于控制UF/DF操作至关重要。

实施例3.水性缓冲溶液中盐的总浓度与渗余物中最大寡核苷酸浓度之间的相关性

图4总结了为确定水性缓冲溶液中盐的总浓度如何影响UF/DF后渗余物中寡核苷酸的最终浓度而进行的研究的实验结果。在该研究中，制备了多种水性缓冲溶液(200mM乙酸铵；50mM乙酸铵和50mM乙酸钠；75mM乙酸铵25mM乙酸钠；90mM乙酸铵和10mM乙酸钠；7.5mM乙酸铵和42.5mM乙酸钠；4mM乙酸铵和36mM乙酸钠)，其中乙酸盐的总浓度从约4mM增加到约200mM，并针对对

如图4所示，观察到UF/DF后渗余物中寡核苷酸的浓度与水性缓冲溶液中乙酸盐的总浓度成正比。虽然增加UF/DF缓冲液电导率(总盐浓度)有助于提高渗透通量，但也有助于提高最大可达到的渗余物浓度。这种关系也是线性的，证明了通过操纵UF/DF缓冲盐浓度来实现最大可达到的渗余物浓度的能力。

图4中的研究出人意料地表明，控制水性缓冲溶液中的盐的浓度也可以控制渗余物中的寡核苷酸的浓度—使得UF/DF方法能够以显著增加渗余物浓度的方式进行，从而允许直接冻干渗余物(无需额外的步骤)以形成固体API。

图2和图4所示的研究表明，渗余物中可达到的最大ASO浓度与UF/DF缓冲液中的总乙酸盐浓度和渗透通量成正比。实现80g/L的最小浓度，以确保固体饼状物的质量和密度可接受，以及适合现有的冻干机(LyoStar3)。

缓冲液的总盐浓度控制渗透通量和渗余物中可达到的最大ASO浓度，由此总盐的增加导致通量和最大渗余物浓度的可再现的增加。通过这种控制方法，可以达到目标并可再现地实现所需的渗透通量和最大渗余物浓度。

实施例4.控制冻干后寡核苷酸组合物中钠含量的方法

图5和表1总结了为确定水性缓冲溶液中乙酸钠盐和乙酸铵盐的摩尔比如何影响冻干后组合物中钠和铵的量而进行的研究的实验结果。本研究中的UF/DF实验均使用以下条件：

·35psi的TMP

·3LMM的交叉流

·膜负载在50-275g/m

UF/DF合并物的冻干在LyoGuard托盘中进行，使用以下条件：

·-50℃的初始冷冻温度

·在23℃和100mTorr下进行初步干燥

·在30℃和100mTorr下进行二次干燥。

在该研究中，制备一系列水性缓冲溶液(参见表1)，其中改变乙酸钠(NaOAc)和乙酸铵(NH

分析冻干后固体API的样品的钠(使用电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES))、氨(使用用于Cedex BioHT分析仪的NH

表1

在所测试的缓冲体系中，钠与氨之间的折衷在钠与铵的比率的整个范围内是一致的(图5)，证明了实现最终产品(固体API)中钠和铵的特定浓度的能力。在图5的所有实施例中，将UF/DF渗余物浓缩到80-85g/L的类似浓度。由于UF/DF合并物溶液中存在的钠没有通过冻干除去，因此最终API钠值包括冻干过程中缓冲液中存在的钠。如果UF/DF合并物的ASO浓度较低(体积较大)，钠值将偏移得较高，相反，如果UF/DF合并物可以增加到较高浓度(较小体积)，钠值将偏移得较低。当实现特定钠和氨含量时，必须考虑最终UF/DF渗余物ASO浓度的任何变化。

如图5所示，发现UF/DF缓冲液中铵与钠的比率决定了冻干后组合物中钠和铵的最终含量。使用23℃和100mTorr的初步干燥条件和30℃和100mTorr的二次干燥条件，在LyoGuard托盘中进行UF/DF合并物的冻干。在本研究的冻干条件下，观察到钠和铵的最终含量与乙酸钠和乙酸铵各自的摩尔比呈线性相关。

如图6中总结的相关研究中所示，UF/DF缓冲液组分比率(例如铵与钠的比率)的微调可以控制冻干后的钠含量，从而允许固体API满足某些规格，诸如5.2％±0.9％的临界钠含量。本研究的钠含量结果低于5.2±0.9质量％的目标，但线性趋势允许预测将导致钠含量在目标范围内的必要UF/DF缓冲液组成(乙酸钠和乙酸铵)。如图6所示，将数据外推到目标钠含量范围的中心，预测用由85％乙酸钠和15％乙酸铵组成的缓冲液操作UF/DF将导致产品钠含量为约5.2质量％。

实施例5.冻干后寡核苷酸组合物中乙酸盐含量与水性缓冲溶液中总乙酸盐含量的相关性

图10总结了为确定水性缓冲溶液中的总乙酸盐含量如何影响冻干后固体API中的乙酸盐量而进行的研究的实验结果。在该研究中，制备了一系列水性缓冲溶液，其中总乙酸盐浓度从40mM变化到100mM(参见表1中的实施例2-8)，并测量了冻干后组合物中乙酸盐的质量百分比。如图10所示，发现冻干后API中的残余乙酸盐含量与UF/DF缓冲液中的乙酸盐的总含量成正比。在UF/DF缓冲液基质中的总乙酸盐含量与固体API中的残余乙酸盐含量之间观察到线性趋势。满足≤0.8质量％的乙酸盐规格的缓冲液条件均含有40mM总乙酸盐。

尚未发现残余乙酸盐含量受铵/钠阳离子比的影响。此外，基于乙酸铵在冻干条件下的挥发性，水性缓冲溶液中总乙酸盐浓度的降低允许将乙酸盐在冻干后去除至痕量水平。

部分基于上述实验研究，发现优化UF/DF缓冲液中乙酸钠与乙酸铵的比率以及降低总乙酸盐浓度可以成功地将包括UF/DF的含水下游过程与冻干API联系起来。

实施例6.冻干API的大规模制备

使用缓冲水溶液中固定摩尔比的钠盐进行大规模实验，并测量UF/DF后渗余物(在下表2中标记为“冻干前寡核苷酸浓度”)中寡核苷酸的浓度和冻干后组合物的水分含量、钠含量和乙酸盐含量。在这些实验中，将寡核苷酸

基于之前的实验，选择6mM乙酸铵、34mM乙酸钠(85％乙酸钠与15％乙酸铵，总乙酸盐浓度为40mM)作为缓冲液基质，这将最佳地实现渗余物中的最大ASO浓度、钠含量和乙酸盐含量的终点。以实验室规模确认条件，然后以生产(MFG)规模(18mmol)重复。将来自生产工艺的UF/DF合并物分开，一部分以实验室规模冻干(在表2中标记为“实验室规模冻干”)，而剩余部分以生产规模冻干。

如表2所示，对于钠和乙酸盐冻干后没有观察到显著差异，表明通过操纵UF/DF缓冲液进行的阳离子控制是可放大的。两种规模的最大可实现UF/DF合并物浓度相同。在生产规模下观察到固体API中的水含量略高，这是设备差异的结果。总体而言，通过操纵UF/DF缓冲液来放大阳离子和乙酸盐控制，以及通过盐组合物促进渗透通量和渗余物浓度是成功的，证明了该方法的可扩展性。

表2：实验室规模和生产规模的最终UF/DF缓冲液条件和结果

使用4个LyoGuard托盘对从生产规模运行(表2中的实施例12)获得的材料进行批量冻干，总液体体积为6L。图7示出了含有冻干材料的4个LyoGuard托盘。改进冻干过程以促进最大程度地去除挥发性UF/DF缓冲液组分。该批量冻干方法包括-50℃冷冻、23℃初步干燥，然后在150mTorr压力下30℃二次干燥。水分含量和挥发性缓冲液组分成功去除至痕量，满足API规格。图8示出了冻干材料在LyoGuard托盘中并随后转移到储存袋中。

选择的最终缓冲液是34mM NaOAc和6mM NH

·固体API Na含量：4.9％-5.0％(目标5.2％±0.9％)

·UF/DF后浓度：允许85g/L液体API

·渗透通量：维持>10LMH通量

·UF/DF过程的持续时间：单元操作在1天内完成

·最终乙酸盐含量：冻干后最低残余乙酸盐

·冻干后组合物的稳定性：固体API在25℃下稳定31天

虽然本文已经示出并描述了本公开的各种实施例，但是显而易见的是，这些实施例仅作为示例提供。在不脱离本文公开内容的情况下，可以进行多种变化、改变和替换。因此，本公开旨在仅由所附权利要求的实质和范围限制。