一种基因修饰检测方法及其应用

技术领域

本申请涉及生物医学领域，具体的涉及一种基因修饰检测方法及其应用。

背景技术

胞外囊泡(Extracellular Vesicle)是大多数细胞分泌的50-1000nm的膜泡，存在于细胞培养基、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水等生物液体中。其中，大胞外囊泡的大小>200nm。越来越多的证据表明，这些囊泡充当细胞信使，将信息传递给身体内的细胞和组织。胞外囊泡包含细胞特异性蛋白、脂质和RNA，它们被运输到其他细胞，并改变其他细胞的功能或生理作用。这些胞外囊泡可能在介导对感染性病原体和肿瘤的适应性免疫反应、组织修复、神经通讯和病原蛋白转移方面发挥作用。

临床上，组织取样难是限制肿瘤分子诊断及精准治疗的一大难题。血液、尿液等液体活检样本因为具有易于获取，无创等特点，是肿瘤DNA的可靠来源，也是目前肿瘤分子诊断的热点领域。液体活检样本主要包括血浆游离DNA(cfDNA)、循环肿瘤细胞(CTC)和胞外囊泡(Extracellular Vesicle)。目前，cfDNA基因检测的应用较为成熟和广泛，然而cfDNA是肿瘤细胞凋亡或死亡后的DNA碎片，可能无法准确反映肿瘤细胞的实时基因信息。相反地，血浆、尿液等胞外囊泡来源的核酸(exoRN)由活的肿瘤细胞主动释放，有可能更好地反映肿瘤的实时动态。

DNA羟甲基化是重要的表观遗传修饰形式，已被证明是人类基因组中稳定的表观遗传标记，与基因转录水平正相关，在细胞发育，分化，成熟和自我更新中起着至关重要的作用。5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)作为一种很有前景的生物标志物，与人类多种疾病的发生及发展密切相关。所以，开发基于胞外囊泡DNA的5hmC测序技术方法具有重要的临床意义。

发明内容

本申请提供了一种基因修饰检测方法及其应用，可以包含基于胞外囊泡DNA的5hmC测序技术方法。血液、尿液等液体活检样本因为具有易于获取，无创等特点，是肿瘤DNA的可靠来源，也是目前肿瘤分子诊断的热点领域，然而cfDNA是肿瘤细胞凋亡或死亡后的DNA碎片，可能无法准确反映肿瘤细胞的实时基因信息。本申请提供的胞外囊泡来源的核酸(exoRN)由活的肿瘤细胞主动释放，其中，优选的大胞外囊泡的大小>200nm，其可以充当细胞信使，将信息传递给身体内的细胞和组织，也可以更好地反映肿瘤的实时动态。

一方面，本申请提供了一种分析方法，包含(S1)获取待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质，(S2)检测所述待测物质中羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

另一方面，本申请提供了一种确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的方法，包含(S1)获取待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质，(S2)检测所述待测物质中待测区域的羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

另一方面，本申请提供了一种分析方法，包含检测待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

另一方面，本申请提供了一种确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的方法，包含检测待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

另一方面，本申请提供了一种核酸，所述核酸包含能够结合待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列。

另一方面，本申请提供了一种制备核酸的方法，包含待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列，设计能够结合所述待测区域、或其互补区域、或上述的片段的核酸。

另一方面，本申请提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本申请对的核酸。

另一方面，本申请提供了本申请中的核酸、和/或本申请中的试剂盒，在制备疾病检测产品中的应用。

另一方面，本申请提供了本申请中的核酸、和/或本申请中的试剂盒，在制备确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的产品中的应用。

另一方面，本申请提供了一种数据库，包含待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列。

另一方面，本申请提供了一种储存介质，其记载可以运行本申请中的方法的程序。

另一方面，本申请提供了一种设备，其包含本申请中的储存介质。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：

图1显示的是本申请分离的胞外囊泡(>200nm)粒径分布图。

图2显示的是本申请分离的外泌体(<200nm)粒径分布图。

图3显示的是本申请分离得到的胞外囊泡(>200nm)中DNA的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)文库质控结果图。

图4显示的是血浆分离的胞外囊泡动态光散射测定的粒径分布图。血浆分离的胞外囊泡大小(>200nm)。

图5显示的是血浆分离的外泌体动态光散射测定的粒径分布图。血浆分离的外泌体大小(<200nm)。

图6显示的是胞外囊泡(>200nm)DNA的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)文库质控：全自动毛细管电泳系统结果显示，文库大小约306bp。

图7A-7D显示的是肺癌患者和健康人的检测结果。图7A：肺癌和健康人PCA图：基于30例肺癌患者和30例健康人外泌体(<200nm)5hmC测序；图7B：肺癌和健康人ROC曲线图：基于外泌体DNA中5hmC标志物区分30例肺癌患者和30例健康人；图7C：肺癌和健康人PCA图：基于30例肺癌患者和30例健康人胞外囊泡(>200nm)5hmC测序；图7D：肺癌和健康人ROC曲线图：基于胞外囊泡DNA中5hmC标志物区分30例肺癌患者和30例健康人。

图8A-8D显示的是结直肠癌患者和健康人的检测结果。图8A：结直肠癌和健康人PCA图：基于25例结直肠癌患者和30例健康人外泌体(<200nm)5hmC测序；图8B：结直肠癌和健康人ROC曲线图：基于外泌体DNA中5hmC标志物区分25例结直肠癌患者和30例健康人；图8C：结直肠癌和健康人PCA图：基于25例结直肠癌患者和30例健康人外泌体(>200nm)5hmC测序；图8D：结直肠癌和健康人ROC曲线图：基于胞外囊泡DNA中5hmC标志物区分25例结直肠癌患者和30例健康人。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

术语定义

在本申请中，术语“样品”通常是指涉及材料或材料混合物，通常是液体形式的或其它形式，其中可以包含一个或多个目标分析物。

在本申请中，术语“胞外囊泡”通常是指一种胞外颗粒。例如，胞外颗粒可以是指由细胞释放到细胞外基质的膜性颗粒。例如，胞外颗粒的直径可以为约30纳米至约1000纳米。例如，胞外囊泡可以是一类特定尺寸的胞外颗粒，例如胞外囊泡的直径可以为约200纳米以上。

在本申请中，术语“类器官”通常是指一种细胞团。例如，所述类器官可以具有自我更新能力和自我组织能力，例如，所述类器官可以具有相应组织器官功能。例如，所述类器官可以培养在基质胶中具有3D立体结构。

在本申请中，术语“确定”、“测量”、“评价”、“评估”、“测定”和“分析”在本文可互换使用，通常是指任何形式的测量，包括确定要素是否存在。这些术语都可以包括定量和/定性两方面。评估可以是相对的或绝对的。“评估……的存在”可以包括确定某物存在的量，以及确定其存在与否。

例如，基因突变检测的简要步骤可以包含取患者肿瘤组织样本，提取DNA，通过试剂盒及其他方法进行检测，判断患者是否有突变；具有突变的作为临床检验阳性样本；不具有突变的作为临床检验阴性样本。

例如，基因检测的方法可以包含：聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术、焦磷酸测序法、单链构象异构多态分析技术、探针扩增阻滞突变系统、高效液相色谱法、微数字聚合酶链反应、和高分辨率熔解曲线分析技术等。

例如，基因表达量检测可以包含根据基因、肿瘤的情况选择试剂盒及其他方法进行检测，判断患者是否有基因表达量变异；具有基因表达量变异的作为临床检验阳性样本；不具有基因表达量变异的作为临床检验阴性样本。

例如，预测疾病及相关症状发生的基因可以包含通过已有的测序数据，或对于临床患者样本进行测序(包括DNA、RNA等测序方式)，并进行数据分析得到的与疾病及其相关症状相关的基因，以及能够在疾病及其相关症状未发生的情况下即可通过表达量预测其发生的基因。预测与疾病及其相关症状相关性高的样本可以作为临床检验阳性样本，预测与疾病及其相关症状相关性高的样本可以作为临床检验阴性样本。

例如，肿瘤标志物的血液检测可以包含通过采血的方式进行，检查血液中肿瘤标志物的含量。或者也可以将胸水或者腹水引流出来，送肿瘤标志物的检查，胸水、腹水中的肿瘤标志物含量指标的变化可以和病人血中肿瘤标志物指标的变化进行对比，从而加强对疾病的监测和诊断。预测与疾病及其相关症状相关性高的样本可以作为临床检验阳性样本，预测与疾病及其相关症状相关性高的样本可以作为临床检验阴性样本。

在本申请中，术语“测序”通常是指一种方法，通过该方法可以获得多核苷酸的至少10个连续核苷酸的身份(例如至少20个、至少50个、至少100个或至少200个或者更多个连续核苷酸的身份)。

在本申请中，术语“修饰有化学选择性基团的UDP葡萄糖”通常是指已被官能化的、可以是在第6-羟基位置被官能化的UDP葡萄糖，以包括能够参与1,3-环加成(或“点击”)反应的基团。这样的基团可以包括叠氮基和炔基(例如环辛炔)。例如，UDP-6-N3-Glu可以是修饰有化学选择性基团的UDP葡萄糖。

在本申请中，术语“生物素部分(biotin moiety)”通常是指包括生物素或者诸如脱硫生物素、氧化生物素、2-亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素硫氧化物、生物胞素之类的生物素类似物的亲和标记物。生物素部分可以与链霉亲和素结合。

在本申请中，术语“环加成反应”和“点击反应”通常是可互换描述的术语，通常是指叠氮和炔基之间的1,3-环加成形成五元杂环。在一些实施方案中，炔基可以是有张力(strained)的(例如在诸如环辛炔之类的环中)，环加成反应可以在无铜条件下进行。二苯并环辛炔(DBCO)和二氟辛炔(DIFO)可以是能够参与无铜环加成反应的炔的例子。

在本申请中，术语“结合生物素的载体”通常是指连接到链霉亲和素或亲和素或其功能性等价物上的载体(例如珠子，其可以是磁性的)。

在本申请中，术语“扩增”通常是指使用目标核酸作为模板来产生目标核酸的一个或多个拷贝。

在本申请中，术语“片段的拷贝”通常是指扩增的产物，其中片段的拷贝可以是片段链的反向互补，或者可以具有与片段链相同的序列。

在本申请中，术语“富集”通常是指将具有某种特征(例如包含羟甲基胞嘧啶的核酸)的分析物从没有该特征(例如包含羟甲基胞嘧啶的核酸)的分析物中部分纯化出来。例如，相对于没有该特征的分析物来说，富集通常会增加具有该特征(例如包含羟甲基胞嘧啶的核酸)的分析物的浓度至少2倍、至少5倍或至少10倍。富集之后，样品中至少10％、至少20％、至少50％、至少80％或至少90％的分析物可以具有富集所使用的特征。例如，在所富集的组合物中，至少10％、至少20％、至少50％、至少80％或至少90％的核酸分子可以包含具有一个或多个已被修饰为包含捕获标记物的羟甲基胞嘧啶的链。

发明详述

一方面，本申请提供一种分析方法，可以包含获取待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质，检测所述待测物质中羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

另一方面，本申请提供一种确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的方法，可以包含获取待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质，检测所述待测物质中羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

例如，本申请的待测样本可以包含血浆、尿液、组织培养液、细胞培养液和/或类器官培养液。例如，本申请的待测物质可以包含胞外囊泡。例如，本申请的胞外囊泡直径可以约为200纳米以上。例如，本申请的胞外囊泡直径可以约为200纳米以上、250纳米以上、300纳米以上、350纳米以上、400纳米以上、500纳米以上、600纳米以上、700纳米以上、750纳米以上、800纳米以上、900纳米以上、或1000纳米以上。例如，本申请的胞外囊泡直径可以为样本中胞外囊泡的平均直径。例如，本申请的待测物质可以含有核酸。例如，本申请的待测物质可以含有DNA。

例如，其中所述待测样可以本来源于动物、植物和/或真菌。例如，其中所述待测样本可以包括体液、组织、细胞和/或类器官培养上清。例如，其中所述待测样本中所述体液可以包括血浆和/或尿液。例如，其中所述组织可以包括胃组织、肝组织、脑组织、肾组织、乳腺组织、肺组织、淋巴结组织、腹膜组织和/或心脏组织。

例如，本申请的方法可以包括分离胞外囊泡的步骤。例如，其中所述的胞外囊泡分离可以包括离心、超滤、尺寸排阻层析、多聚物沉淀法和/或亲和捕捉法。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括超速离心、密度梯度离心、沉淀离心、差速离心、离心淘洗和/或区带离心。

例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第一次离心，所述第一次离心转速为约300g～约1000g。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第一次离心，所述第一次离心温度为约2℃～约10℃。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第一次离心，所述第一次离心时间为约5分钟～约20分钟。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第一次离心，所述第一次离心以约300g～约1000g的转速在约2℃～约10℃的温度下离心约5分钟～约20分钟。

例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第二次离心，其利用本申请的第一次离心获得的上清进行离心。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第二次离心，所述第二次离心转速为约1500g～约5000g。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第二次离心，所述第二次离心温度为约2℃～约10℃。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第二次离心，所述第二次离心时间为约10分钟～约30分钟。

例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第三次离心，其利用本申请所述的第二次离心获得的上清进行离心。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第三次离心，所述第三次离心转速为约10000g～约15000g。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第三次离心，所述第三次离心温度为约2℃～约10℃。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第三次离心，所述第三次离心时间为约10分钟～约30分钟。例如，其中所述第三次离心可以获得管底沉淀物，所述沉淀物可以为大囊泡。例如，其中所述第三次离心中所述大囊泡的直径可以约大于200nm。

例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第四次离心，可以对上述三次离心获得的上清进行离心。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第四次离心，所述第四次离心转速为约50000g～约150000g。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第四次离心，所述第四次离心温度为约2℃～约10℃。例如，其中所述的胞外囊泡分离中的所述离心可以包括第四次离心，所述第四次离心时间为约60分钟～约100分钟。例如，其中所述第四次离心获得管底沉淀物，所述沉淀物的直径可以约小于200nm。

例如，本申请的方法可以包含以下步骤：(S1-1)以约500g离心所述待测样本，获取上清液；(S1-2)以约3000g离心所述步骤(S1-1)所得的上清液，获取上清液；(S1-3)以约12000g离心所述步骤(S1-2)所得的上清液，获取包含所述待测物质的沉淀。例如，所述步骤(S1-1)的时长可以约10分钟。例如，所述步骤(S1-2)的时长可以约20分钟。例如，所述步骤(S1-3)的时长可以约20分钟。

例如，本申请的方法可以包含以下步骤：(S1-1)以约1350g离心所述待测样本，获取上清液；(S1-2)以约3000g离心所述步骤(S1-1)所得的上清液，获取上清液；(S1-3)使所述步骤(S1-2)所得的上清液接触尺寸排阻填料，分离包含所述待测物质的组分。例如，所述步骤(S1-1)的时长可以约15分钟。例如，所述步骤(S1-2)的时长可以约10分钟。例如，所述尺寸排阻填料可以包含直径约为22微米至44微米的填料。例如，所述步骤(S1-3)可以收集两管或以上的尺寸排阻洗脱的组分，通过动态光散射确定包含所述待测物质的所述组分。

例如，本申请的所述羟甲基化测序方法可以包含以下步骤：(S2a)提取样本中的核酸片段，(S2b)标记所述核酸片段中包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段，(S2c)富集所述包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段，(S2d)对所富集的所述包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段进行测序。

例如，本申请所述的所述标记包含使所述核酸片段与DNAβ-葡萄糖基转移酶和修饰有化学选择性基团的UDP葡萄糖接触。例如，本申请的所述标记可以是使所述有化学选择性基团连接在所述样本的包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段上。

例如，本申请所述的化学选择性基团可以包含叠氮基。例如，本申请的化学选择性基团可以包含任意的化学点击基团。

例如，本申请所述的标记还可以包含使带有化学选择性基团的所述核酸片段与包含能够与所述化学选择性基团反应的生物素接触。例如，所述能够与所述化学选择性基团反应的生物素可以包含含二苯并环辛炔修饰的生物素。例如，所述标记可以是使第一标记连接在所述样本的包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段上，并且可以包含使连接了所述第一标记的核酸片段再连接第二标记，所述第二标记可以和所述第一标记选择性反应。

例如，所述富集可以包含使带有生物素的所述核酸片段与包含链霉亲和素的磁珠接触。例如，所述标记后的包含羟甲基胞嘧啶的核酸片段可以与包含链霉亲和素的磁珠结合。例如，所述富集可以包含通过磁力将带有所述羟甲基胞嘧啶的核酸片段的磁珠分离。

例如，本申请的方法可以包含通过测序的方法，检测待测样的带有所述羟甲基胞嘧啶的核酸片段的数量和/或存在。例如，本申请可以通过选自以下组的方法对所述待测样本测序：数字PCR和高通量测序。例如，本申请的测序方法可以选自本领域已知的任意一种测序方法。

另一方面，本申请还提供一种分析方法，可以包含检测待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

另一方面，本申请还提供一种确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的方法，可以包含检测待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中羟甲基胞嘧啶的数量和/或存在。

另一方面，本申请提供了一种核酸，所述核酸可以包含能够结合待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列。

另一方面，本申请提供了一种制备核酸的方法，可以包含待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列，设计能够结合所述待测区域、或其互补区域、或上述的片段的核酸。

另一方面，本申请提供了一种试剂盒，可以包含本申请所述的核酸。例如，所述试剂盒还可以包含采血管。例如，所述试剂盒可以配合离心机使用。例如，所述试剂盒还可以包括含有糖基化基团的试剂，例如所述糖基化基团可以包含UDP葡萄糖基团或其衍生物、含有标记基团的试剂，例如所述标记基团可以包含生物素基团或其衍生物、连接物、介质、扩增引物和/或缓冲液。例如，所述试剂盒可以配合测序仪器使用。

另一方面，本申请提供了本申请中的核酸、和/或本申请中的试剂盒，在可以制备疾病检测产品中的应用。

另一方面，本申请提供了本申请中的核酸、和/或本申请中的试剂盒，在可以制备确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的产品中的应用。

另一方面，本申请提供了本申请中的核酸、和/或本申请中的试剂盒，其可以用于疾病检测。

另一方面，本申请提供了本申请中的核酸、和/或本申请中的试剂盒，其可以用于确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群。

另一方面，本申请一种疾病检测的方法，可以包含提供本申请中的核酸、和/或本申请中的试剂盒。

另一方面，本一种确认疾病的存在、评估疾病形成或形成风险、评估疾病的进展和/或预后和/或筛选对治疗有相应的人群的方法，可以包含提供本申请中的核酸、和/或本申请中的试剂盒。

例如，本申请的疾病可以包含肿瘤。

另一方面，本申请提供了一种数据库，可以包含待测样本中直径约为200纳米以上的待测物质中的待测区域、或其互补区域、或上述的片段的序列。

另一方面，本申请提供了一种储存介质，其可以记载可以运行本申请中的方法的程序。

另一方面，本申请提供了一种设备，其可以包含本申请中的储存介质。例如，所述非易失性计算机可读存储介质可以包括软盘、柔性盘、硬盘、固态存储(SSS)(例如固态驱动(SSD))、固态卡(SSC)、固态模块(SSM))、企业级闪存驱动、磁带或任何其他非临时性磁介质等。非易失性计算机可读存储介质还可以包括打孔卡、纸带、光标片(或任何其他具有孔型图案或其他光学可识别标记的物理介质)、压缩盘只读存储器(CD-ROM)、可重写式光盘(CD-RW)、数字通用光盘(DVD)、蓝光光盘(BD)和/或任何其他非临时性光学介质。

例如，如本申请所述的设备，还包含耦接至所述储存介质的处理器，所述处理器被配置为基于存储在所述储存介质中的程序执行以实现本申请所述的方法。例如，所述数据库系统可以实现各种机制以便确保在数据库系统上执行的本申请所述的方法产生正确的结果。在本申请中，所述数据库系统可以使用磁盘作为永久性数据存储器。在本申请中，所述数据库系统可以为多个数据库客户端提供数据库存储和处理服务。所述数据库客户端可以跨多个共享存储设备存储数据库数据，和/或可以利用具有多个执行节点的一个或更多个执行平台。所述数据库系统可以被组织成使得存储和计算资源可以被有效地无限扩展。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。

实施例

实施例1胞外囊泡DNA 5-羟甲基胞嘧啶检测方法

(一)5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)文库建立

胞外囊泡分离

可以从血浆样本分离胞外囊泡：

1.取全血(8mL)于10mL康为公司(CW2815M)cfDTM游离核酸采血管(请在室温操作，取血后室温保存；

2.第一次离心，500g，4℃低温离心10min，小心取出淡黄色上清(去除血细胞、血小板)，转移至2mLDNase free无菌离心管中；

3.第二次离心，3000g，4℃低温离心20min，小心取出上清(去除白细胞以及细胞碎片)，转移至2-3管2mL DNase free无菌离心管中；

4.第三次离心，12000g，4℃低温离心20min，小心取出上清，将上清转移至2-3管2mL DNase free无菌离心管中，收集管底沉淀(直径>200nm的大囊泡)，加入1mLPBS(1X),混匀后冻存于-80°冰箱；

5.第四次离心，100000g，4℃低温离心70min，去除上清，收集管底沉淀(直径<200nm的外泌体)，加入1mLPBS(1X),混匀后冻存于-80°冰箱；

可以从尿液样本分离胞外囊泡：

1.取尿液10mL；

2.第一次离心，500g，4℃低温离心10min，小心取出淡黄色上清(去除细胞)，转移至2mLDNase free无菌离心管中；

3.第二次离心，3000g，4℃低温离心20min，小心取出上清(去除细胞碎片)，转移至15mL无菌离心管中；

4.第三次离心，12000g，4℃低温离心20min，小心取出上清，将上清转移至15mL无菌离心管中，收集管底沉淀(直径>200nm的大囊泡)，加入1mLPBS(1X),混匀后冻存于-80°冰箱；

5.第四次离心，100000g，4℃低温离心70min，去除上清，收集管底沉淀(直径<200nm的外泌体)，加入1mLPBS(1X),混匀后冻存于-80°冰箱；

可以从组织、细胞、原代细胞、类器官培养上清样本分离胞外囊泡：

1.取10ml组织、细胞、原代细胞、类器官培养上清于15mL离心管中；

2.第一次离心，500g，4℃低温离心10min，小心取出上清(去除细胞)，转移至15mL无菌离心管中；

3.第二次离心，3000g，4℃低温离心20min，小心取出上清(去除细胞碎片)，转移至15mL无菌离心管中；

4.第三次离心，12000g，4℃低温离心20min，小心取出上清，将上清转移至15mL无菌离心管中，收集管底沉淀(直径>200nm的大囊泡)，加入1mLPBS(1X),混匀后冻存于-80°冰箱；

5.第四次离心，100000g，4℃低温离心70min，去除上清，收集管底沉淀(直径<200nm的外泌体)，加入1mLPBS(1X),混匀后冻存于-80°冰箱。

可以通过排阻色谱法分离胞外囊泡：

1.采集的无抗凝全血4度冰箱放置4个小时；

2. 1350g离心15分钟，分离得到血浆样本；

3.血浆样本3000g离心10分钟，去除细胞碎片；

4.使用Sigma公司的superdex填料填装尺寸排阻柱；

5.预先装好的柱子使用PBS缓冲液平衡；

6.将去细胞碎片的血浆样本加入尺寸排阻柱中，PBS进行洗脱，每管0.5mL收集洗脱的组分，大的胞外囊泡首先被洗脱，小的胞外囊泡后洗脱；

7.进行动态光散射表征每一管的粒径大小，即区分得到大的胞外囊泡(>200nm)和外泌体(<200nm)。

胞外囊泡(>200nm)gDNA提取

1.利用Quick-DNA miniprep plus kit(ZYMO，D4069)试剂盒，从来自上述任一种方法制备得到的胞外囊泡样品中提取20ng左右基因组DNA；

2.利用Qubit3.0测定胞外囊泡和颗粒gDNA浓度。

将gDNA进行打断、末端补齐并与测序接头连接

根据KAPA HyperPlus Library Preparation Kit(KK8514)说明书进行，简要操作如下：

1.对大片段gDNA进行打断，gDNA投入量10ng，样本体积为12μL，反应物为2μL0.6％FCS、2μL Frag Buffer、4μL Frag Enzyme；37℃水浴20分钟；

2.制备20μL含有10ng基因组DNA、2.8μL End Repair&A-Tailing Buffer和1.2μLEnd Repair&A-Tailing Enzyme mix的反应混合液(总体积为24μL)；在20℃温浴30分钟，然后在65℃温浴30分钟；

3.在.5mL低吸附EP管中配置以下连接反应混合物：2μL Nuclease free water(无核酸酶水)，12μL Ligation Buffer以及4μL DNA Ligase；向18μL连接反应混合物中加入2μL的测序KAPA index(PKR2015、PKR2016和PKR2017)，混合，加入至24μL反应样本中，于20℃加热4小时；

4.使用DNA Clean&Concentrator 5(ZYMO,D4014)纯化试剂盒对反应产物进行纯化，用20μL洗脱缓冲液进行洗脱获得最终的DNA连接样品。

5hmC标记

1.制备总体积为4μL的标记反应混合液：1μL 50uM UDP-N3-Glu(hmC标记底物)、2.5μLβGT酶(NEB)和2.5μL HEPES缓冲液(pH 8.0，终浓度为50mM)，将6μL标记混合液加入至20μL DNA连接样本中。将混合液在37℃水浴1小时；

2.取出混合液，用DNA Clean&Concentrator 5(ZYMO,D4014)纯化试剂盒对反应产物进行纯化，获得纯化的30μL DNA；

3.然后在上述纯化的30μL DNA中加入1μL 45uM DBCO-PEG4-Biotin(ClickChemistry Tools)，于37℃水浴1小时；

4.用DNA Clean&Concentrator 5(ZYMO,D4014)纯化试剂盒对反应产物进行纯化，获得30μL纯化的标记产物。

5hmC富集

1.按以下步骤平衡结合磁珠：取出2.5μL Dynabeads(Invitrogen,65306)并加入100μL洗涤缓冲液(5mM Tris(pH 7.5)、lM NaCl和0.02％Tween20)，吹打混匀，放置于1.5mL磁力架上，重复用100μL洗涤缓冲液洗涤结合磁珠3次，最后加入100uL洗涤缓冲液，混匀磁珠，涡旋30min；

2. 30min后用100uL洗涤缓冲液洗涤磁珠3次，最后加入32μL结合缓冲液(10mMTris(pH 7.5)、2M NaCl和0.04％Tween20)，并混合均匀；

3.在磁珠混合液中加入上述步骤获得的纯化的标记产物，并在旋转混合器中混合30min使其充分结合；

4.最后，用100μL洗涤缓冲液洗涤磁珠5次，加入23.8μL RNase-Free water。

PCR扩增

1.向上述步骤的最终体系中加入25μL 2×PCR master mix和1.25μL PCR引物(总体积为50μL)，按下面所述PCR反应循环的温度和条件进行扩增：

2.将扩增产物用AmpureXP beads(KAPA，KK8001)纯化，最后用20uL洗脱液洗脱并得到最终5hmC文库。可以用Qubit 3.0进行文库浓度测定。

对5hmC文库质控后进行高通量测序

1.将获得的5hmC文库进行Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳系统质控(试剂盒:DNF-900；使用软件：Fragment Analyzer仪器控制软件、PROSize数据分析软件)，确定文库中DNA片段大小以及是否含有杂质(文库大小为300bp左右)；

2.进行qPCR浓度测定(试剂盒：KAPA SYBR FAST Universal qPCR Kit(KK4601))，判断样本文库是否符合上机测序标准；

具体步骤：

a.配制样本：准备5个1.5mL EP管,每4个待测序样本混样到一个EP管中，5管共20个样本(index不能重复)；每个5hmC文库样本吸取5ng，每个EP管总体积为20uL，终浓度为1ng/uL；

b.样本反应体系(20uL)如下：每个EP管中文库吸取4uL进行qPCR定量。

c.qPCR程序设置：

d.结果分析：根据qPCR操作软件进行分析，判断5hmC文库是否降解，是否满足测序要求；

3.将通过质检的文库(16uL)用I1lumina NextSeq500进行测序，使用的测序试剂盒是High Output Kit v2(75cycles)，每个样品的测序通量为1.5Gb，测序条带大小为75bp。

原始测序数据比对

1.每个原始测序FASTQ数据先用Trimmomatic软件进行低质量数据修剪，再用Bowtie2软件比对到人基因组hg19上；

2.使用MACS软件进行包含5hmC的reads数峰识别，参数为：effective genomesize＝2.72e+09；tag size＝38；band width＝100；model fold＝10；P value cutoff＝1.00e-05，并以此进行call peaks，生成counts文件；

3.用DEseq2软件比对来自阳性样本和阴性样本的counts文件，找到的reads数大于50的5hmC峰区域，按|log2FoldChange|>＝0.5，pvalue<0.05，分别得到5hmC上下调的差异性生物标志物。

临床样本检测

收集临床检测阳性患者样本和临床检测阴性患者样本，通过本申请的基于胞外囊泡DNA的5hmC测序技术方法，检测不同样本来源的胞外囊泡(>200nm)中差异性生物标志物的羟甲基化位点拷贝数。结果显示，本申请的基于胞外囊泡DNA的5hmC测序技术方法可以更准确的区分临床检测阳性患者和临床检测阴性患者。

实施例2

1.样本收集与胞外囊泡提取：

收集1例健康人血液样本(8-10mL)，并分离血浆(4-5mL)；按梯度离心的方法从血浆中提取胞外囊泡(>200nm)；接着提取胞外囊泡中的DNA进行5hmC文库构建；最后，使用I1lumina NextSeq500对5hmC文库进行测序，每个样品的测序通量为1.5Gb，测序条带大小为75bp；

2.胞外囊泡(>200nm)和外泌体(<200nm)表征：

将提取的胞外囊泡和外泌体稀释到PBS中，浓度为0.2mg/mL，然后使用Malven公司的Zeta sizer Nano ZS90进行动态光散射测定胞外大囊泡和外泌体的尺寸。

图1显示的是本申请分离的胞外囊泡(>200nm)粒径分布图，图2显示的是本申请分离的外泌体(<200nm)粒径分布图。结果显示，本申请的方法可以分离出胞外囊泡(>200nm)。

3.5hmC文库质控：

将获得的5hmC文库进行Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳系统质控(试剂盒:DNF-900；使用软件：Fragment Analyzer仪器控制软件、PROSize数据分析软件)，确定文库中DNA片段大小以及是否含有杂质(文库大小为300bp左右)。图3显示的是本申请分离得到的胞外囊泡(>200nm)中DNA的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)文库质控结果图,全自动毛细管电泳系统结果显示，文库大小在306bp左右。结果显示，本申请基于胞外囊泡(>200nm)的检测方法可以得到合格的5hmC文库。

实施例3

对于样本的检测可以通过羟甲基化位点筛选对应的待测位点。

1.确定临床样本分组：根据临床免疫组化(IHC)、原位杂交荧光(FISH)等方法检测药物治疗靶点(如:MET)的结果，将临床样本分为MET阳性与阴性两组；

2.通过阳性组与阴性组的对比分析，按|log2FoldChange|>＝0.5，pvalue<0.05筛选条件筛选5hmC差异性markers，寻找到MET对应的羟甲基化位点(MET等)；

3.合成MET羟甲基化位点引物(擎科生物科技有限公司)

基于cfDNA羟甲基化位点的数字PCR检测

(1)样本体系制备(20uL)

1.样本5hmC文库加入量为10ng，引物标准浓度为10uM，染料法预混液(永诺，S0200020301)；

(1)微滴生成

1.使用永诺样本制备通用耗材(S0100010101)进行芯片制备，将50uL微滴生成油加入芯片第一排8个孔，将20uL样本体系加入至芯片第二排8个孔，然后将5uL密封剂加入到第二排样本孔中；

2.使用永诺MicroDrop-100数字PCR系统进行微滴生成；

(2)封膜

1.将制备成的微滴(50uL)转入至96孔PCR板(S0100030101),贴上膜片；

2.使用永诺MicroDrop-100数字PCR系统190℃高温封膜；

(3)PCR扩增

1.PCR扩增程序：

2.将样本进行PCR扩增；

(4)数字PCR检测

1.使用永诺MicroDrop-100数字PCR系统对PCR产物进行检测、分析。

对于待测样本的羟甲基化检测可以不局限于特定羟甲基化位点，染色体上任意位置的羟甲基化位点均可进行单基因数字PCR检测。

实施例4

对于胞外囊泡以及外泌体的样本的检测

1.样本收集与胞外囊泡提取：

收集1例健康人血液样本(8-10mL)，并分离血浆(4-5mL)；按梯度离心的方法从血浆中提取胞外囊泡(>200nm)；接着提取胞外囊泡中的DNA进行5hmC文库构建；最后，使用I1lumina NextSeq500对5hmC文库进行测序，每个样品的测序通量为1.5Gb，测序条带大小为75bp；

2.胞外囊泡(>200nm)和外泌体(<200nm)表征：

将提取的胞外囊泡和外泌体稀释到PBS中，浓度为0.2mg/mL，然后使用Malven公司的Zeta sizer Nano ZS90进行动态光散射测定胞外大囊泡和外泌体的尺寸。

3.5hmC文库质控：

将获得的5hmC文库进行Fragment AnalyzerTM全自动毛细管电泳系统质控(试剂盒:DNF-900；使用软件：Fragment Analyzer仪器控制软件、PROSize数据分析软件)，确定文库中DNA片段大小以及是否含有杂质(文库大小为300bp左右)；

4.结果

如图4和图5结果显示，本申请分离出血浆分离的胞外囊泡大小(>200nm)；血浆分离的外泌体大小(<200nm)。如图6结果显示，本申请胞外囊泡构建的文库。

实施例5

对于肺癌样本的检测

样本收集与5hmC-Seal测序：

收集60例肺癌患者和60例健康人血液样本(8-10mL)，并分离血浆(4-5mL)。利用梯度离心方法从血浆中分离胞外囊泡(>200nm)和外泌体(<200nm)，并提取DNA进行5hmC-Seal测序。其中，30例肺癌和30例健康人样本分离胞外囊泡(>200nm)；30例肺癌和30例健康人样本分离胞外囊泡(<200nm)。每个样品的测序通量为1.5Gb，测序条带大小为75bp；图7A-7D显示的是肺癌患者和健康人的检测结果。结果显示本申请对于胞外囊泡的5hmC检测具有显著提高的准确性，检测灵敏度和特异性高于对于外泌体的检测。

实施例6

对于结直肠癌样本的检测

样本收集与5hmC-Seal测序：

收集50例结直肠癌患者和60例健康人血液样本(8-10mL)，并分离血浆(4-5mL)。利用梯度离心方法从血浆中分离胞外囊泡(>200nm)和外泌体(<200nm)，并提取DNA进行5hmC-Seal测序。其中，25例结直肠癌和30例健康人样本分离胞外囊泡(>200nm)；25例结直肠癌和30例健康人样本分离胞外囊泡(<200nm)。每个样品的测序通量为1.5Gb，测序条带大小为75bp；图8A-8D显示的是结直肠癌患者和健康人的检测结果。结果显示本申请对于胞外囊泡的5hmC检测具有显著提高的准确性，检测灵敏度和特异性高于对于外泌体的检测。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。