铜绿假单胞菌工程菌DUEC的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种铜绿假单胞菌工程菌DUEC的构建方法及应用，具体是一株能够作为物理接触感应器和蛋白质传递平台的工程菌株。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种非常重要的革兰氏阴性病原菌，是具有很高临床意义的ESCAPE病原菌(Enterococcus faecium，Staphylococcus aureus，Klebsiella pneumoniae，Acinetobacter baumannii，P.aeruginosa和Enterobacterspp.)中的一员，能够响应异源细胞或姐妹细胞来源的T6SS攻击、RP4接合转移或胞外DNA等引起的膜干扰信号，通过TagQRST-PpkA-Fha1-PppA组成的苏氨酸磷酸化途径(threoninephosphorylation pathway，TPP)激活H1-T6SS组装。当铜绿假单胞菌细胞受到姐妹细胞来源的T6SS攻击后，能够在受攻击的位置组装H1-T6SS，将效应蛋白传递到姐妹细胞中，但是由于同源免疫蛋白的存在，不会导致姐妹细胞的死亡，这种发生在铜绿假单胞菌姐妹细胞之间的响应被称为T6SS对决(T6SS dueling)。当铜绿假单胞菌与霍乱弧菌共培养时，铜绿假单胞菌能够在三种菌株组成的混合物中，通过响应霍乱弧菌效应蛋白TseL引起的膜损伤，而非T6SS物理穿刺，区分T6SS

T6SS是在革兰氏阴性细菌中广泛存在的分子武器，大约25％已测序的革兰氏阴性细菌中都有T6SS的存在。T6SS能够分泌有毒性的效应蛋白，在复杂的环境中杀伤与其发生直接接触的竞争者。T6SS在结构上与噬菌体尾部类似，由可收缩TssB/C外鞘，闭合的Hcp内管，跨膜复合体和基座复合体组成。Hcp内管的顶端有一个尖状复合体(spike complex)，该复合体由VgrG三聚物和一个圆锥状的PAAR蛋白组成，有利于T6SS穿刺细胞膜。外鞘的收缩能够释放大量的能量，驱动Hcp内管、尖状复合体和相关效应蛋白进入相邻细胞(革兰氏阴性细菌，革兰氏阳性细菌和真菌)。外鞘的长度可能决定了T6SS的作用距离，因为将效应蛋白传递到靶细胞中，大多数是接触依赖的。在正常的细胞中，T6SS鞘/管从跨膜复合体开始延伸，到达细胞的对面后终止，形成一个直的杆状结构，但是在细胞壁缺陷细胞或TagA终止蛋白(stopper protein)编码基因敲除突变株中，能够形成长的弯曲的T6SS结构。T6SS分泌的效应蛋白能够杀伤受体细胞，但是T6SS管状结构的穿刺不能杀伤受体细胞。

将T6SS转变为一个通用的蛋白质传递工具通常不需要T6SS的毒性功能，但是效应蛋白不仅能够决定T6SS功能，还参与T6SS组装，因为在一些菌株中多个效应蛋白的敲除会废除T6SS组装。部分效应蛋白还能够像VgrG和PAAR一样，作为与货物蛋白(cargo protein)融合的载体。因此，霍乱弧菌和达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)中采取了一种有效的策略，通过效应蛋白催化位点突变而非效应蛋白编码基因敲除，在废除T6SS毒性的同时维持T6SS的分泌功能。这种策略在更复杂的系统，如铜绿假单胞菌T6SS中也许同样能够起作用，但是并没有被验证。

铜绿假单胞菌PAO1基因组中编码三个独立的T6SS基因簇(H1-，H2-和H3-T6SS)，每个T6SS都能分泌特定的效应蛋白。其中H1-T6SS分泌的8个效应蛋白根据作用位点可以分为两类：在周质空间中起作用的效应蛋白(Tse1，Tse3-Tse5)和在细胞质中起作用的效应蛋白(Tse2，Tse6-Tse8)。目前，虽然部分效应蛋白的功能得到了充分验证，但是铜绿假单胞菌中效应蛋白是否参与T6SS组装、哪种效应蛋白能够作为更有效的载体并没有得到验证。

在诸多的合成生物学模块中缺乏能够特异性响应物理接触信号的工具，而T6SS对决/以牙还牙式响应也许能够填补这一空白，用来调控混合群落中特定的微生物。但是，由于铜绿假单胞菌组分的复杂性，特定的蛋白相互作用和未被阐明的机制使得将铜绿假单胞菌开发为信号感应和调节模块非常有挑战性。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，提供一种新型铜绿假单胞菌工程菌DUEC的构建方法及应用。本发明的主要目的是构建能够响应外界信号，在混合群落中特异性区分T6SS

本发明的目的主要通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种铜绿假单胞菌工程菌DUEC的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

在铜绿假单胞菌PAO1野生型中，首先敲除感应激酶编码基因retS和鞘蛋白编码基因tssB2、tssB3，随后对H1-T6SS分泌效应蛋白Tse1-Tse4、Tse6-Tse8进行催化位点突变，Tse5编码基因进行敲除；即得所述铜绿假单胞菌工程菌DUEC；

所述突变具体为：Tse1

DUEC工程菌株在显微镜下，既能够组成性的表达和组装H1-T6SS，还能够响应相邻姐妹细胞来源的T6SS攻击，在被攻击的位置组装H1-T6SS。DUEC工程菌株能够组装T6SS，但是丧失了所有H1-T6SS效应蛋白的毒性，不能像铜绿假单胞菌野生型一样杀伤T6SS

一种通过所述构建方法构建的铜绿假单胞菌工程菌DUEC。所述铜绿假单胞菌DUEC菌株显微镜下，不仅能够组成性表达H1-T6SS，还能够响应姐妹细胞T6SS攻击，组装自身H1-T6SS的表型。所述铜绿假单胞菌DUEC细胞H1-T6SS效应蛋白全部失活，不能杀伤T6SS

所述铜绿假单胞菌工程菌DUEC能够将与分泌标签融合的货物蛋白传递到T6SS+菌株中。所述分泌标签包括Tse6

铜绿假单胞菌VgrG1a/1b/1c蛋白和含有PAAR结构域并与VgrG相关的效应蛋白Tse5-Tse7作为分泌标签，融合Cre重组酶，筛选用于货物蛋白传递的合适分泌标签。

Tse6

所述铜绿假单胞菌DUEC细胞能够响应T6SS物理穿刺，在复杂的微生物群落中，将蛋白质特异性的传递到T6SS

所述的铜绿假单胞菌工程菌DUEC可应用于传递各种具有不同毒性或功能的货物蛋白，特异性的调控下游输出或用于调控微生物群落的组成。

被传递到T6SS

货物蛋白Cre重组酶和重组介导的输出可以被其他的酶或输出模块(如β-半乳糖苷酶及下游基因调控等)代替，使DUEC系统有更广泛的应用潜力。

(1)首先我们构建了用于基因敲除或催化位点突变的质粒，并通过接合转移的方法构建了相应的突变株。构建方法为：扩增相应位点上下游同源臂，大小为800-1,000bp。构建好的质粒测序验证后，转化到大肠杆菌SM10或WM6026菌株中，作为供体菌株。过夜培养的供体菌株与受体菌株分别用100μl LB悬浮，各取50μl混合，点在LB平板上，37℃培养3h后，用500μl LB悬浮，活化1h，取250μl涂布在含有三氯生(25μg/ml)和庆大霉素(20μg/ml)的LB固体平板上。37℃过夜培养后挑取接合转移子到500μl无抗LB中松弛培养4h后涂布在含有6％蔗糖的LBNS平板上，22℃培养1.5d后进行PCR验证。PCR验证正确且丢失质粒抗性的菌株保存在-80℃冰箱中。

通过基因敲除或催化位点突变等方法构建了一系列效应蛋白组合失活突变株。显微镜观察和统计分析结果显示没有任何一个单独的效应蛋白是T6SS对决和组装必需的。通过组合突变，构建了一株所有效应蛋白失活的突变株8eff

(2)通过细菌竞争实验，验证了8eff

(3)通过Cre传递实验，验证了8eff

(4)通过细菌竞争实验和Cre传递实验，验证了DUEC是否能够响应T6SS物理穿刺。首先，通过细菌竞争实验验证了霍乱弧菌V52效应蛋白全部失活突变株4eff

(5)通过Cre传递实验，验证了DUEC能够在混合微生物群落中区分T6SS

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过基因敲除或催化位点突变等方法构建了一株能够正常组装T6SS，无法杀伤T6SS

DUEC作为一种独特的蛋白质传递平台，能够用于传递不同的货物蛋白，货物蛋白能够在受体细胞中特异性调控下游通路，具有非常重要的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为H1-T6SS效应蛋白Tse相关突变株显微镜观察结果；图A-图B分别为在亲代菌株(parental strain)H1-T6SS

图2为实施例1中得到的突变株按照实施例2中的方法对T6SS的组装和T6SS对决进行统计分析结果示意图；30μm×30μm区域内亲代菌株H1-T6SS

图3为实施例1中得到的所有突变株按照实例三中的方法得到的结果图；亲代菌株H1-T6SS

图4为实施例4测得的铜绿假单胞菌DUEC菌株能够通过VgrG1a分泌标签将有活性的Cre传递到受体细胞中结果示意图；图A为VgrG分泌标签融合Cre示意图，VgrG1a、VgrG1b和VgrG1c终止密码子前分别插入Cre重组酶；图B-图E分别为铜绿假单胞菌DUEC在受到霍乱弧菌野生型(WT)攻击后Cre重组效率(B)，发生Cre重组的霍乱弧菌存活(C)，有pFIGR质粒的霍乱弧菌受体细胞存活(D)和铜绿假单胞菌供体细胞存活(E)；DL为检测极限，误差线指的是至少三个不同的生物重复平均值±标准方差，单因素方差分析-Dunnett多重比较检验用来比较其他菌株与只含有Cre的铜绿假单胞菌之间重组效率差异(B)、发生重组霍乱弧菌存活差异(C)、受体细胞存活差异(D)或供体细胞存活差异(E)；*P<0.05；ns，notsignificant。

图5为实施例4测得铜绿假单胞菌DUEC菌株能够通过H1-T6SS将Tse6

图6为实施例4测得铜绿假单胞菌DUEC能够感应T6SS物理接触，将Tse6

图7为实施例4测得铜绿假单胞菌DUEC能够在混合群落中响应T6SS

图8为混合群落中DUEC精准货物传递模式图；左图：铜绿假单胞菌野生型(PA)在感应到相邻T6SS

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。

本发明实施例涉及的具体培养基配方和培养条件：

本发明中所有菌株均培养于LB培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L)中，37℃条件下进行培养。LBNS培养基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L)用于筛选质粒抗性丢失的菌株，使用前加入终浓度为6％的蔗糖，并置于22℃培养。抗生素使用浓度如下：100μg/mL链霉素(streptomycin)，50μg/mL卡那霉素(kanamycin)，100μg/mL羧苄青霉素(carbenicillin)，20μg/mL庆大霉素(gentamicin)和25μg/mL三氯生(Irgasan)。实验中用到的0.5×PBS为10×PBS(NaCl:1.37M，KCl:26.8mM，NaH

本发明中用到的质粒如表1所示：

表1质粒及特征

本发明中用到的引物如表2所示:

表2引物及序列

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本发明中用到的菌株信息如表3所示：

表3菌株及描述

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实施例1：铜绿假单胞菌突变株构建

背景菌株的获得：

在铜绿假单胞菌PAO1野生型中，首先敲除感应激酶编码基因retS和鞘蛋白编码基因tssB2、tssB3。

Tse效应蛋白敲除或点突变相关突变株构建：使用表2中KO1和KO2相关引物扩增上游同源臂，使用表2中KO3和KO4相关引物扩增下游同源臂，使用表2中KO1和KO4将上下游同源臂重叠到一起，将重叠后的同源臂片段用Gibson组装的方法克隆到自杀型质粒pEXG2.0中，通过PCR和Sanger测序验证质粒是否正确。将验证正确的质粒转化到供体细胞大肠杆菌WM6026或SM10中，作为供体菌株，过夜培养的供体菌株和受体菌株用100μlLB悬浮后，1:1混合，37℃共培养3h后，刮菌到500μl LB中，37℃，950r.p.m.活化1h后涂布在含有选择性抗生素的LB固体平板上，37℃过夜培养后挑取接合转移子到500μl无抗LB中松弛培养4h后涂布在含有6％蔗糖的LBNS(胰蛋白胨：10g/L，酵母提取物：5g/L)平板上，22℃培养1.5d后使用表2中KO5和KO6相关引物进行PCR验证，催化位点突变突变株使用KO5和KO6扩增相应的片段后，进行Sanger测序，验证突变株是否正确。

通过两次同源重组实现Tse编码基因单独敲除。使用到的质粒如表1所示，其中，tse1敲除使用自杀型质粒pEXG2.0 tse1，tse2敲除使用自杀型质粒pEXG2.0 tse2，tse3敲除使用自杀型质粒pEXG2.0 tse3，tse4敲除使用突变株构建自杀型质粒pEXG2.0 tse4，tse5敲除使用自杀型质粒pEXG2.0 tse5，tse6敲除使用自杀型质粒pEXG2.0 tse6，tse7敲除使用自杀型质粒pEXG2.0 tse7，tse8敲除使用自杀型质粒pEXG2.0 tse8，利用基因敲除方法，构建了Tse效应蛋白单敲除菌株，分别命名为Δtse1-Δtse8，得到的突变株按照实施例2中的方法进行显微镜观察，得到的结果如图1所示。

效应蛋白催化位点失活使用到的质粒如表1所示，Tse1催化位点突变使用自杀型质粒pEXG2.0 Tse1

将H1-T6SS分泌的效应蛋白分为三组：Tse1和Tse3作用于肽聚糖，Tse4和Tse5可能对细胞膜起作用，Tse2、Tse6，Tse7和Tse8在细胞质中起作用。

对H1-T6SS分泌效应蛋白Tse1-Tse4、Tse6-Tse8进行催化位点突变(Tse1

利用基因敲除和催化位点突变构建了三组效应蛋白单独失活的突变株：

(1)菌株eff245678：Tse1和Tse3催化位点失活突变株；此外，还有中间构建菌株eff2345678：Tse1催化位点失活突变株。

(2)菌株eff123678：Tse4催化位点失活和Tse5敲除突变株。

(3)菌株eff13458：Tse2、Tse6和Tse7催化位点失活突变株。此外，还有中间构建菌株eff1234568(Tse7催化位点失活突变株)、eff134568(Tse2和Tse7催化位点失活突变株)。

然后将三组效应蛋白进行两两组合构建了效应蛋白组合突变株：

(4)菌株eff2678：Tse1、Tse3、Tse4催化位点突变及Tse5敲除突变株。此外，还有中间构建菌株eff24678(Tse1、Tse3催化位点突变和及Tse5敲除突变株)。

(5)菌株eff458：Tse1、Tse2、Tse3、Tse6和Tse7催化位点突变突变株。此外，还有中间构建菌株eff1458(Tse2、Tse3、Tse6和Tse7催化位点突变突变株)。

(6)菌株eff138：Tse2、Tse4、Tse6和Tse7催化位点突变及Tse5敲除突变株；此外，还有中间构建突变株eff1348(Tse2、Tse6和Tse7催化位点突变及Tse5敲除突变株)随后，我们在eff138的基础上，构建了三组效应蛋白同时丧失活性的突变株：

(7)菌株eff8：Tse1、Tse2、Tse3、Tse4、Tse6和Tse7催化位点突变及Tse5敲除突变株。此外，还有中间构建菌株eff38(Tse1、Tse2、Tse4、Tse6和Tse7催化位点突变及Tse5敲除突变株)。

最后，由于Tse8是近期被报道的，因此我们在菌株eff8的基础上对Tse8可能的活性位点(Tse8

实施例2：Tse效应蛋白相关突变株显微镜观察和统计分析

实施例1中构建得到的效应蛋白单敲除突变株、三组效应蛋白单独失活突变株、三组效应蛋白两两失活突变株、三组效应蛋白同时失活突变株和8eff

所有的显微镜图片用Fiji软件进行分析，10s间隔，5min拍摄时间的图片首先统一信号强度来纠正信号淬灭。细胞数目统计使用的是相差(phase contrast)图片，通过调节阈值使细胞轮廓清晰，使用“analyze particles”选项进行计数，同时排除边缘细胞，细胞计数结果人工确认。为了保证实验结果的准确性和可重复性，选择来源于三个重复的至少10个不同区域分析能够形成T6SS鞘的活跃细胞比例及成对存在的能够形成T6SS鞘的活跃细胞比例。使用Fiji插件“Temporal-Color code”评估5min内T6SS活跃细胞，有活跃sfGFP信号的细胞进行人工计数。所有的实验结果至少进行三次独立的生物学重复。

实施例1中得到的突变株按照实例二中的方法对T6SS的组装和T6SS对决进行统计分析，得到的结果如图2所示。

实施例3：细菌竞争实验

将killer单克隆在含有合适抗性的LB固体平板37℃过夜培养，第二天刮取适量的菌，将菌体浓度统一到OD

实施例1中得到的所有突变株按照实施例3中的方法得到的结果如图3所示。

实施例4：Cre传递实验

质粒构建：首先，使用表2中Cre-pPSV-F和Cre-pPSV-R扩增Cre重组酶片段；使用表2中VgrG1a-pPSV-RBS-F和VgrG1a-pPSV-R扩增VgrG1a片段；使用表2中VgrG1b-pPSV-RBS-F和VgrG1b-pPSV-R扩增VgrG1b片段；使用表2中VgrG1c-pPSV-RBS-F和VgrG1c-pPSV-R扩增Vgr1c片段；使用表2中Tse6-281-pPSV-RBS-F和Tse6-281-pPSV-R扩增Tse6

使用表2中Cre-hifi-F和pPSV37-RBS-hifi-R扩增pPSV37-Cre载体，DpnI酶切处理4h后回收备用。使用表2中VgrG1a-pPSV-RBS-F和VgrG1a-Cre-hifi-R扩增VgrG1a片段；使用表2中VgrG1b-pPSV-RBS-F和VgrG1b-Cre-hifi-R扩增与VgrG1b片段；使用表2中VgrG1c-pPSV-RBS-F和VgrG1c-Cre-hifi-R扩增Vgr1c片段；使用表2中Tse6-281-pPSV-RBS-F和Tse6-281-Cre-hifi-R扩增Tse6

含有Cre融合质粒的铜绿假单胞菌单克隆在含有相应抗生素的LB培养基中过夜培养后，按照1/50的比例转接，37℃条件下培养大约3h后，OD

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。