一株抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株罗伊氏乳杆菌A21325及含有该罗伊氏乳杆菌A21325的组合物抑制幽门螺旋杆菌感染和缓解幽门螺旋杆菌所引起的炎症的应用。

背景技术

幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性的微需氧细菌,迄今为止，幽门螺旋杆菌感染被认为是世界范围内最常见的细菌感染。1994年世界卫生组织将幽门螺旋杆菌列为第Ⅰ类致癌因子。根据Correa提出的肠型胃癌发生模式，幽门螺旋杆菌从感染到癌症发生的发展路径为：幽门螺旋杆菌感染正常胃黏膜-慢性非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎-肠上皮化生-异型增生-肠型胃癌，炎症因子在幽门螺旋杆菌致病中起着重要作用，幽门螺旋杆菌直接或间接引起炎症因子表达的上调，通过多种途径参与胃炎和胃癌的病变演进。

由于幽门螺杆菌是引起胃炎和胃癌的主要致病因子，因此通过各种手段根除幽门螺旋杆菌感染是治疗的主要方向。目前，幽门螺杆菌治疗最普遍的现行疗法是通过几种抗生素和质子泵抑制剂的组合来根除病原体，如抗生素三联疗法、四联疗法等。抗生素疗法在根除幽门螺杆菌的同时也导致了幽门螺杆菌的耐药以及肠道菌群失调、肠道功能紊乱等严重的副作用。

因此，除了现行的抗生素疗法外，益生菌在抑制和缓解幽门螺旋杆菌感染方面的应用日益受到广泛关注。越来越多研究表明，特定的益生菌可以抑制幽门螺旋杆菌的生长和定植，在幽门螺旋杆菌的辅助治疗中发挥着重要作用。但是现有的益生菌在发挥抑制或拮抗幽门螺旋杆菌作用时对益生菌自身的活性要求较高，必须在具有较高活菌数的条件下才能有效的抑制或拮抗幽门螺旋杆菌。此外，现有益生菌的作用主要是抑制或拮抗幽门螺旋杆菌本身，对幽门螺旋杆菌引起的炎症的缓解作用效果不显著。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株通过与幽门螺旋杆菌发生共凝集作用而有效抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325，该菌株的灭活菌株也能与幽门螺旋杆菌发生共凝集作用。

本发明的第二个目的是提供所述的抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325在抑制幽门螺旋杆菌感染引起的炎症中的应用，具体表现为降低炎症因子TNF-α的表达同时促进抑炎因子IL-10的表达上调。

本发明的第三个目的是提供所述的抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325在制备抑制幽门螺旋杆菌感染的产品中的应用。

一株抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325，该菌株于2022年12月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC NO:63041。

所述的抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325，其菌落特征为：在MRS固体培养基上，菌落为圆形，乳白色，菌落突起、光滑，边缘整齐，不透明。革兰氏染色后显微镜观察显色，菌株为杆状，革兰氏阳性。

该抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325是从广西上林县健康百岁老人的新鲜粪便样品中筛选获得。

所述抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325的筛选包括如下步骤：

3.1称取1.0g新鲜的粪便样品加入9.0mL无菌生理盐水中，震荡混合均匀制成菌悬液。将菌悬液用无菌PBS缓冲液进行梯度稀释，取适当稀释度的稀释液涂布于MRS显色培养基上。37℃厌氧培养2-4d，挑取有黄色变色圈的菌株划线于MRS固体培养基上进行纯化，纯化好的菌株进行斜面保藏备用。

3.2将3.1中的待测菌株挑取单菌落接种MRS肉汤培养基，37℃厌氧培养16-24h。离心收集待测菌株的菌体，用PBS缓冲液洗2次，用PBS缓冲液重悬并调节菌体浓度为1×10

3.3将指示菌幽门螺旋杆菌接种于哥伦比亚血琼脂平板，在37℃三气培养箱(5％氧气、10％二氧化碳、85％氮气)培养72-96h。收集幽门螺旋杆菌菌体，用PBS缓冲液洗2次，用PBS缓冲液重悬并调节菌体浓度为1×10

3.4将待测菌与幽门螺旋杆菌菌悬液等量混合，震荡3-5分钟后于37℃培养2h。吸取上层液体测定OD600吸光值，计算共凝集率。挑选共凝集率高的菌株备用。

3.5将3.4中得到的菌株挑取单菌落接种MRS肉汤培养基，37℃厌氧培养16-24h。离心收集待测菌株的菌体，用PBS缓冲液洗2次，用PBS缓冲液重悬并调节菌体浓度为1×10

3.6按3.4的方法检测灭活菌株的共凝集率，挑选共凝集率高的菌株。

3.7将3.6中挑选出的菌株开展幽门螺杆菌AGS细胞黏附的干预试验，筛选能降低幽门螺旋杆菌黏附率的菌株。

3.8将3.7中筛选出的菌株开展AGS细胞IL-8检测，筛选能有效缓解幽门螺旋杆菌引起的炎症的菌株。

3.9将3.8中筛选得到的菌株制备冻干菌粉，将冻干菌粉和幽门螺旋杆菌菌悬液喂予C57小鼠，8周后取样检测小鼠胃组织匀浆液中尿素酶、TNF-α、IL-10等指标，筛选出能降低尿素酶、TNF-α和提高IL-10的菌株。

所述的抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325在制备功能性食品和/或保健品中的应用。

所述的抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325在制备发酵乳制品、发酵果蔬制品、饮料、或者零食发酵食品中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明所述的抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325可与幽门螺旋杆菌发生共凝集作用，进而抑制了幽门螺旋杆菌的定植和感染。

2、所述罗伊氏乳杆菌A21325的灭活菌株也可与幽门螺旋杆菌发生共凝集作用。

3、所述罗伊氏乳杆菌A21325可以有效缓解幽门螺旋杆菌引起的细胞炎症，主要表现为降低了炎症因子TNF-α表达，促进了抑炎因子IL-10的表达上调。

附图说明

图1为AGS细胞黏附率。

图2为IL-8浓度检测结果。

图3为胃尿素酶检测结果。

图4为胃组织TNF-α检测结果。

图5为胃组织IL-10检测结果。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不是用于限制本发明的范围，所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

除非特别说明，否则本发明采用的试剂、方法和设备均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，否则本发明实施例所用的培养基和试验条件均为本领域常规培养基和试验条件。

除非特别说明，否则本实施例所用试剂均为市购。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

本发明所述抑制幽门螺旋杆菌感染的罗伊氏乳杆菌A21325的筛选、纯化、鉴定，包括如下步骤：

取长寿老人的新鲜粪便样品1.0g加入9ml无菌生理盐水震荡混合均匀制备菌悬液。取5mL上述菌悬液加入45mL富集培养基中，37℃厌氧培养7d。将培养好的富集培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释至10

挑取纯化好的待鉴定菌株单菌落于无菌水中制成菌悬液作为PCR模板进行菌落PCR扩增菌株16S rDNA。PCR引物采用27F、1492R通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。反应采用25μl体系：2×San Taq PCR Mix 12.5μl，模板1μl，上下游引物各1μl，补足ddH

实施例2

乳杆菌活菌与幽门螺旋杆菌共凝集实验

菌悬液制备：将活化好的待测菌及幽门螺旋杆菌菌体用无菌PBS缓冲液洗涤2次，用PBS缓冲液重悬后调整菌悬液浓度为1×10

将待测菌菌悬液及幽门螺旋杆菌菌悬液进行等量混合，震荡3-5min充分混合均匀后置于37℃静置培养，并于0h、2h取样上层液体进行OD

A

A

A

检测结果如表1所示，2h时A21325菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集率达到76％。这表明A21325菌株与幽门螺旋杆菌具有较强的结合能力，二者形成凝集体有助于将幽门螺旋杆菌排除体外。

表1乳杆菌活菌对幽门螺旋杆菌的互交凝集能力

实施例3

乳杆菌灭活菌株与幽门螺旋杆菌共凝集实验

菌悬液制备：将活化好的待测菌及幽门螺旋杆菌菌体用无菌PBS缓冲液洗涤2次，用PBS缓冲液重悬后调整菌悬液浓度为1×10

将待测菌菌悬液及幽门螺旋杆菌菌悬液进行等量混合，震荡3-5min充分混合均匀后置于37℃静置培养，并于0h、2h取样上层液体进行OD

A

A

A

检测结果如表2所示，2h时A21325的灭活菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集率达到65.26％。这表明A21325菌株的灭活菌株依旧与幽门螺旋杆菌具有较强的结合能力，这扩大了A21325菌株的应用范围和剂型选择。

表2菌株灭活菌株对幽门螺旋杆菌的互交凝集能力

实施例4

乳杆菌活菌抑制幽门螺旋杆菌细胞粘附力实验

AGS细胞准备：在无菌24孔板中接种AGS细胞，细胞接种量为2×10

幽门螺旋杆菌菌悬液准备：培养好的新鲜幽门螺旋杆菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为2×10

待测菌活菌菌悬液准备：培养好的待测菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为2×10

待测菌灭活菌悬液准备：培养好的待测菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后在75℃水浴灭活30分钟，灭活菌体用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为2×10

24孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.25ml幽门螺旋杆菌菌悬液和0.25ml待测菌菌悬液，在37℃三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次，加入尿素酶试剂，于550nm处检测吸光值。以未经幽门螺旋杆菌和待测菌处理的AGS细胞为空白组，以经幽门螺旋杆菌处理但未经待测菌处理的AGS细胞为模型组，以经幽门螺旋杆菌和待测菌处理的AGS细胞为实验组，通过尿素酶活力表征幽门螺旋杆菌黏附率高低。

黏附率计算以模型组OD值减去空白组OD值为100％，实验组黏附率计算公式为：

实施例5

AGS细胞IL-8分泌量检测

AGS细胞准备：在无菌24孔板中接种AGS细胞，细胞接种量为1×10

幽门螺旋杆菌菌悬液准备：培养好的新鲜幽门螺旋杆菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×10

待测菌菌悬液准备：培养好的待测菌菌体用PBS缓冲液清洗2次后用F12K+10％胎牛血清培养基重悬，调整菌液浓度为1×10

24孔板中培养过夜的AGS细胞用PBS缓冲液洗3次除去未贴壁的细胞后加入0.5ml幽门螺旋杆菌菌悬液，在三气培养箱中共培养2h。培养结束后用PBS缓冲液洗3次除去未黏附的幽门螺旋杆菌，加入0.5ml待测菌悬液，在三气培养箱中共培养24h。以未感染幽门螺旋杆菌的AGS细胞为空白组，以感染幽门螺旋杆菌但未经待测菌处理的AGS细胞为模型组，以感染幽门螺旋杆菌且经待测菌处理的AGS细胞为实验组。培养结束后收集细胞培养液，在4℃以4000rpm/min离心10min，收集上清液。上清液根据ELISA试剂盒(购自上海江莱生物公司)提供的方法进行IL-8含量检测。IL-8检测结果如图2所示，和对照组相比，感染幽门螺旋杆菌的HP模型组AGS细胞上清液IL-8浓度显著增加到对照组的4.5倍；经A21325菌株处理后，AGS细胞IL-8的分泌量为对照组的2.6倍，相比HP模型组减少42.2％。该结果表明，罗伊氏乳杆菌A21325可以显著抑制幽门螺旋杆菌对细胞的感染，在减少细胞促炎因子IL-8的分泌，缓解HP引起的细胞炎症。

实施例6

菌株对人工胃肠液的耐受性

菌悬液制备：将菌株从保藏斜面上转接活化2次后接入MRS培养基培养16-24h，将菌悬液浓度调整至1×10

耐人工胃液实验：取1ml菌悬液添加入9ml pH值3.0的人工胃液中，在37℃厌氧培养3h；分别于0h和3h对培养液进行梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数。根据公式计算存活率。

人工胃液存活率＝(3h平板菌落数/0h平板菌落数)×100％

耐人工肠液实验：取1ml菌悬液添加入9mL pH值3.0的人工胃液中，37℃厌氧培养3h后取1ml加入到9ml pH值8.0的人工肠液中，37℃厌氧培养8h；加入人工肠液后分别于0h和8h取培养液进行梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数，根据公式计算存活率。

人工肠液存活率＝(8h平板菌落数/0h平板菌落数)×100％

存活率统计结果如表3所示。罗伊氏乳杆菌A21325可以很好的耐受胃酸环境，对肠液也具有较好的耐受性。

表3菌株人工胃肠液耐受检测结果

实施例7

冻干菌粉及微生态菌剂的制作

将罗伊氏乳杆菌A21325接种至MRS固体培养基中进行活化，将活化后的菌株接种至MRS液体培养基中制备种子液。制备好的种子液以2％接种量接种至MRS液体培养基中，37℃培养16h进行大批量发酵。发酵结束镜检确认无污染后，将菌液在4℃条件下4000-6000r/min离心10min收集菌体。

收集好的菌体用无菌生理盐水洗2次后在菌体中按1:1加入脱脂乳粉等常规冻干保护剂，混合均匀制备成菌悬液。将菌液转移至冻干容器中，梯度降温冷冻，再用真空冷冻干燥机进行冻干。将冻干的菌体进行粉碎研磨后即可得到罗伊氏乳杆菌A21325冻干菌粉。

罗伊氏乳杆菌A21325冻干菌粉与常用辅料进行混合后经过压片或填充胶囊可制作成粉剂、片剂、胶囊等微生态菌剂。

实施例8

A21325菌株与其它市售菌株在预防或缓解小鼠幽门螺旋杆菌感染中的作用

为了验证本发明的罗伊氏乳杆菌A21325在动物体内具有预防或缓解幽门螺旋杆菌感染的作用，选用6-8周龄的C57BL/6小鼠进行实验，同时采购了1株商业化销售的具有拮抗幽门螺旋杆菌作用的植物乳杆菌(在此以植物乳杆菌A代替具体的菌株名字)作为参照，比较了罗伊氏乳杆菌A21325菌株与商业化销售的植物乳杆菌A菌株预防或缓解小鼠幽门螺旋杆菌感染的作用。

空白对照组不灌胃乳杆菌和幽门螺旋杆菌，HP模型组只灌胃幽门螺旋杆菌菌液不灌胃乳杆菌，实验组灌胃幽门螺旋杆菌菌液并间隔1h后灌胃待测乳杆菌。将待测乳杆菌的冻干粉用无菌生理盐水溶解后灌胃小鼠7天，然后每天灌胃幽门螺旋杆菌菌液一次，连续灌胃5天，接着灌胃待测乳杆菌49天。饲养结束后断颈处死小鼠，用灭菌的手术刀和剪刀解剖取胃组织，将胃组织按1：5加入无菌生理盐水后进行匀浆，得到的胃组织匀浆液进行指标检测。

尿素酶测定在96孔板中进行，将胃组织匀浆液在4℃、4000rpm下离心10分钟，取10μL上清液加入无菌96孔板中，再加入190μL尿素酶测试液，振荡反应后用酶标仪测定550nm的吸光值。尿素酶测试剂配方为0.9％NaCl，20mmol/L尿素，14μg/mL苯酚红，用HCl调pH至6.8。以HP模型组尿素酶活性为100％，各组尿素酶相对活性如图3所示。尿素酶由幽门螺旋杆菌分泌产生，感染HP后模型组小鼠胃组织中的尿素酶相较空白对照组显著升高，灌胃罗伊氏乳杆菌A21325后小鼠胃组织尿素酶降低到HP模型组的69.4％，效果优于市售植物乳杆菌A(79.2％)。这表明罗伊氏乳杆菌A21325在动物小鼠体内可以较好抑制幽门螺旋杆菌感染定植。

小鼠胃组织TNF-α含量使用上海江莱生物公司试剂盒检测，将胃组织匀浆液在4℃、4000rpm下离心10分钟，取上清液按照试剂盒提供的说明书方法进行检测，以HP模型组TNF-α浓度为100％，各组TNF-α的相对浓度如图4所示。HP模型组小鼠感染幽门螺旋杆菌后胃组织发生炎症反应TNF-α含量比空白对照组有所上升。给小鼠灌胃罗伊氏乳杆菌A21325后，小鼠胃组织的TNF-α含量降低到HP模型组的54.38％，效果优于市售植物乳杆菌A(60.1％)。表明罗伊氏乳杆菌A21325能够较好的抑制幽门螺旋杆菌感染以及有效降低幽门螺旋杆菌感染引起的炎症因子表达量的升高，缓解炎症的发生。

小鼠胃组织IL-10含量使用江苏酶免公司试剂盒检测，将胃组织匀浆液在4℃、4000rpm下离心10分钟，取上清液按照试剂盒提供的说明书方法进行检测，以HP模型组IL-10浓度为100％，各组IL-10的相对浓度如图5所示。HP模型组小鼠感染幽门螺旋杆菌后胃组织发生炎症反应但是抑炎因子IL-10与空白对照组相比无显著变化。给小鼠灌胃罗伊氏乳杆菌A21325后，小鼠胃组织的IL-10含量比HP模型组和空白对照组有所上升，含量为HP模型组的1.53倍，而市售植物乳杆菌A与空白对照组及HP模型组处于同一水平。这表明被幽门螺旋杆菌感染的胃组织发生炎症反应后小鼠在罗伊氏乳杆菌A21325的作用下刺激胃组织增加抗炎因子IL-10的表达，抑制炎症反应进程，缓解炎症发生。

实施例9

含有罗伊氏乳杆菌A21325的发酵牛乳制备

将牛乳或脱脂牛乳按常规工艺进行巴氏杀菌，冷却至37℃后加入罗伊氏乳杆菌A21325菌粉，搅拌均匀。在37-40℃条件下发酵8h，即得含有罗伊氏乳杆菌A21325的发酵牛乳。

实施例10

含有罗伊氏乳杆菌A21325的固体饮料制备

将罗伊氏乳杆菌A21325如实施例7所示，制备成罗伊氏乳杆菌A21325菌株冻干粉，称取菊粉15％，低聚果糖15％，低聚异麦芽糖15％，低聚半乳糖15％、海藻糖10％，水苏糖10％、罗伊氏乳杆菌A21325冻干粉10％，樱桃果粉5％，蓝莓果粉5％，用混合机混合均匀，使用粉剂包装机对混合物进行分装及密封。