人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体为从人体皮肤组织中对人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法。

背景技术

利用体外重组皮肤模型替代动物实验和人体临床，为日化制品对人体皮肤造成的影响进行评估试验越来越被重视，不仅解决了以往试验受到的临床伦理和动物保护福利的限制，还解决了成本高、测试规模有限、不能高通量进行的等一系列的缺陷。皮肤模型的构建主要包括表皮层和真皮层，表皮层是由角质形成细胞分化形成，真皮层主要是由成纤维细胞构成，两种细胞的一个双旁分泌信号概念促进了皮肤的形成。已知两种细胞可由人体皮肤组织中提取，因此，一种简单高效的从人体组织中提取原代角质形成细胞和成纤维细胞的方法对于成功构建体外重组皮肤模型至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法，该方法包括以下步骤：

s1、获取人体皮肤组织时需要储存在含有双抗的PBS中，4度保存，处理组织时使用PBS清洗3-5次，尽可能除去血污和结缔组织；将待处理人体皮肤组织与dispaseII中性分离酶在37℃下处理30-60min，使用dispaseII中性分离酶与组织共孵育时，需将待处理样品剪成宽约0.5mm，长约2cm的小长条，且dispaseII中性酶的加入量为样品体积的3-5倍；

s2、取出组织进行4℃低烈度超声后机械分离得到表皮层和真皮层，分别对其进行低温苏醒；机械分离组织时，需要将组织固定在含有PBS的加样槽中，保持组织的湿润，使用镊子使其分离；低温苏醒为将组织放于PBS中与维生素C、GLX351322、Fulvene-5和多烯磷脂酰胆碱于15-20℃共同孵育1-2h，其中维生素C用量25ug/ml-75ug/ml；GLX351322用量0.3-0.4μM；Fulvene-5用量0.5-1.0μM；多烯磷脂酰胆碱用量30-50μM，总体积设定为组织样品的2-3倍；

s3、胰酶处理提取细胞，将表皮层和真皮层剪碎后加入胰酶(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，消化过程需要在摇床中进行，温度设置为37℃，转速设置为180rpm，其中表皮层胰酶消化10-15min过滤得到角质形成细胞，真皮层胰酶消化30-45min过滤得到成纤维细胞；胰酶的添加量为组织样品的3-5倍；

s4、培养基进行细胞培养，过滤后得到的细胞沉淀需要在无血清培养基中洗脱两次，角质形成细胞需要使用不添加血清的Epilife培养基洗脱，原代用Epilife培养基培养，传代后使用特定培养基；成纤维细胞需要使用不添加血清的DMEM培养基洗脱，原代成纤维细胞的培养使用添加20％血清的DMEM培养基，传代后使用含10％血清的DMEM培养基。

作为本发明的进一步方案：在步骤s1中，所述dispaseII中性分离酶需要用10mMNaAc(PH7.5)和5mMCaAc的缓冲液或Hepe缓冲盐溶液制备终浓度为2.4u/ml的储存液，并用0.22uM滤膜过滤除菌4度保存。

作为本发明的进一步方案：在s2步骤中，低烈度超声的功率为50-80W、发射频率为20-30KHz、振幅为20-40％、时间为5-10min。

作为本发明的进一步方案：在步骤s4中，过滤所用滤网采用200目筛。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用低烈度超声处理皮肤组织，加快了表皮层和真皮层分离速度，提高了细胞提取效率；本发明采用独创的低温苏醒技术，缓解了超声对细胞的损伤，显著增强了活细胞数量。两项操作的进行更好的保持了细胞组织原有的活性。其次针对表皮层中存在角质形成细胞和成纤维细胞共存的情况，本发明独创了胰酶二次消化技术，成功的从角质形成细胞中分离出成纤维细胞，大大提高了提取的角质形成细胞的纯度。现有的技术大部分是通过增加传代次数来减少成纤维细胞的存活量，实现提高角质形成细胞的纯度，相比于现有技术，本发明减少了细胞传代次数，节约了时间，提高了提取效率，易于梳理、提取活细胞。

附图说明

图1为实施例1中角质层中原代细胞图；

图2为实施例2中角质层中原代细胞图；

图3为实施例3中角质层中原代细胞图；

图4为实施例4中角质层中原代细胞图；

图5为表皮分离后的图像；

图6为真皮分离后的图像；

图7角质形成细胞提取培养后的图像；

图8成纤维细胞提取培养后的图像。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

本发明提取手段能够有效的从皮肤组织中提取出原代角质形成细胞和成纤维细胞，为后续试验提供细胞供给基础。

为了能够有效的从皮肤组织中提取出原代角质形成细胞和成纤维细胞，为后续试验提供细胞供给基础；本发明提供一种技术方案：人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法，该方法包括以下步骤：

s1、获取人体皮肤组织时需要储存在含有双抗的PBS中，4度保存，处理组织时使用PBS清洗3-5次，尽可能除去血污和结缔组织；将待处理人体皮肤组织与dispaseII中性分离酶在37℃下处理30-60min，使用dispaseII中性分离酶与组织共孵育时，需将待处理样品剪成宽约0.5mm，长约2cm的小长条，且dispaseII中性酶的加入量为样品体积的3-5倍；

s2、取出组织进行4℃低烈度超声后机械分离得到表皮层和真皮层，分别对其进行低温苏醒；机械分离组织时，需要将组织固定在含有PBS的加样槽中，保持组织的湿润，使用镊子使其分离；低温苏醒为将组织放于PBS中与维生素C、GLX351322、Fulvene-5和多烯磷脂酰胆碱于15-20℃共同孵育1-2h，其中维生素C用量25ug/ml-75ug/ml；GLX351322用量0.3-0.4μM；Fulvene-5用量0.5-1.0μM；多烯磷脂酰胆碱用量30-50μM，总体积设定为组织样品的2-3倍；

s3、胰酶处理提取细胞，将表皮层和真皮层剪碎后加入胰酶(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，消化过程需要在摇床中进行，温度设置为37℃，转速设置为180rpm，其中表皮层胰酶消化10-15min过滤得到角质形成细胞，真皮层胰酶消化30-45min过滤得到成纤维细胞；胰酶的添加量为组织样品的3-5倍；

s4、培养基进行细胞培养，过滤后得到的细胞沉淀需要在无血清培养基中洗脱两次，角质形成细胞需要使用不添加血清的Epilife培养基洗脱，原代用Epilife培养基培养，传代后使用特定培养基；成纤维细胞需要使用不添加血清的DMEM培养基洗脱，原代成纤维细胞的培养使用添加20％血清的DMEM培养基，传代后使用含10％血清的DMEM培养基。

在步骤s1中，所述dispaseII中性分离酶需要用10mMNaAc(PH7.5)和5mMCaAc的缓冲液或Hepe缓冲盐溶液制备终浓度为2.4u/ml的储存液，并用0.22uM滤膜过滤除菌4度保存。

在s2步骤中，低烈度超声的功率为50-80W、发射频率为20-30KHz、振幅为20-40％、时间为5-10min。

在步骤s4中，过滤所用滤网为200目筛。

实施例1：请参阅图1和5-8，人原代角质形成细胞和成纤维细胞的提取和培养方法，

(1)样品的获取和前期处理：从医院中将男性包皮组织放入含有双抗的PBS中，4度保存带回实验室。用PBS反复洗组织3-5次，尽量除去血污和结缔组织，将组织固定在含有PBS的加样槽中剪成宽0.5mm，长3cm的小长条，放入离心管中，加入浓度为2.4u/ml的dispaseII中性分离酶，dispaseII中性分离酶的添加体积为皮肤组织样品重量的3-5倍(ml/g)，于37℃下共孵育30-60min。随后将组织取出于4℃下低烈度超声处理。

其中低烈度超声条件，时间：5-10min，超声功率：50-80W；发射频率：20-30KHz；振幅：20-40％。

(2)低温苏醒：将超声完的组织迅速机械分离得到表皮层和真皮层，分别将表皮层和真皮层低温苏醒处理；

其中低温苏醒条件如下：将组织置于含有维生素C、GLX351322、Fulvene-5和多烯磷脂酰胆碱的PBS溶液中，于15-20℃处理1-2h，其中维生素C的终浓度为25ug/ml-75ug/ml；GLX351322终浓度为0.3-0.4μM；Fulvene-5终浓度为0.5-1.0μM；多烯磷脂酰胆碱终浓度为30-50μM，溶液总体积设定为组织样品重量的2-3倍(ml/g)。

(3)组织消解：处理完后将两种组织剪碎放入不同的离心管中，加入组织样品重量3-5倍体积(ml/g)的胰酶消化液(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，在37度，180rpm转速的摇床中消化，表皮层消化15min，真皮层消化30min，将消化好的组织分别经200目筛过滤，离心去上清。

(4)细胞提取与培养：表皮层细胞沉淀加入无血清培养基Epilife重悬洗脱两次，离心去上清，得到原代角质形成细胞，原代角质形成细胞以无血清培养基Epilife重悬并培养，传代角质形成细胞使用特定培养基培养；真皮层细胞沉淀加入无血清培养基DMEM重悬洗脱两次，离心去上清，得到原代成纤维细胞，原代成纤维细胞沉淀以含20％血清的DMEM培养基重悬并培养，传代成纤维细胞使用含10％血清的DMEM培养基培养。

(5)细胞计数：针对每0.2g皮肤组织中提取出的细胞，用10培养基重悬均匀。重悬后的细胞，取0.5ml向其中添加10ul的0.4％台朌蓝染色液，其中死细胞染蓝色，活细胞不着色并保持正常形态。染色三分钟过后观察，用血球计数板技术，显微镜下观察计算活细胞得率，活细胞得率(％)＝活细胞数/细胞总数×100％。

(6)胰酶二次消化：对正在培养的原代角质形成细胞，加入胰酶消化液(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，37℃处理2min，吸掉胰酶消化液，并以无血清培养基Epilife吹洗细胞2次，洗掉并去除脱落的成纤维细胞，重新加入无血清培养基Epilife培养，可从角质形成细胞中分离出成纤维细胞，获得纯度较高的角质形成细胞。

(7)角质形成细胞纯度检测：对于原代培养的角质形成细胞在显微镜下进行观察，通过形态学差异统计并计算角质形成细胞的纯度，其中角质形成细胞为铺路石状，成纤维细胞为梭形。角质形成细胞纯度(％)＝角质细胞数/总的细胞数×100％。

实施例2：如图2；不进行胰酶二次消化时：

(1)样品的获取和前期处理：从医院中将男性包皮组织放入含有双抗的PBS中，4度保存带回实验室。用PBS反复洗组织3-5次，尽量除去血污和结缔组织，将组织固定在含有PBS的加样槽中剪成宽0.5mm，长3cm的小长条，放入离心管中，加入浓度为2.4u/ml的dispaseII中性分离酶，dispaseII中性分离酶的添加体积为皮肤组织样品重量的3-5倍(ml/g)，于37℃下共孵育30-60min。随后将组织取出于4℃下低烈度超声处理。

其中低烈度超声条件，时间：5-10min，超声功率：50-80W；发射频率：20-30KHz；振幅：20-40％。

(2)低温苏醒：将超声完的组织迅速机械分离得到表皮层和真皮层，分别将表皮层和真皮层低温苏醒处理；

其中低温苏醒条件如下：将组织置于含有维生素C、GLX351322、Fulvene-5和多烯磷脂酰胆碱的PBS溶液中，于15-20℃处理1-2h，其中维生素C的终浓度为25ug/ml-75ug/ml；GLX351322终浓度为0.3-0.4μM；Fulvene-5终浓度为0.5-1.0μM；多烯磷脂酰胆碱终浓度为30-50μM，溶液总体积设定为组织样品重量的2-3倍(ml/g)。

(3)组织消解：处理完后将两种组织剪碎放入不同的离心管中，加入组织样品重量3-5倍体积(ml/g)的胰酶消化液(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，在37度，180rpm转速的摇床中消化，表皮层消化15min，真皮层消化30min，将消化好的组织分别经200目筛过滤，离心去上清。

(4)细胞提取与培养：表皮层细胞沉淀加入无血清培养基Epilife重悬洗脱两次，离心去上清，得到原代角质形成细胞，原代角质形成细胞以无血清培养基Epilife重悬并培养，传代角质形成细胞使用特定培养基培养；真皮层细胞沉淀加入无血清培养基DMEM重悬洗脱两次，离心去上清，得到原代成纤维细胞，原代成纤维细胞沉淀以含20％血清的DMEM培养基重悬并培养，传代成纤维细胞使用含10％血清的DMEM培养基培养。

(5)细胞计数：针对每0.2g皮肤组织中提取出的细胞，用10培养基重悬均匀。重悬后的细胞，取0.5ml向其中添加10ul的0.4％台朌蓝染色液，其中死细胞染蓝色，活细胞不着色并保持正常形态。染色三分钟过后观察，用血球计数板技术，显微镜下观察计算活细胞得率，活细胞得率(％)＝活细胞数/细胞总数×100％。

(6)角质形成细胞纯度检测：对于原代培养的角质形成细胞在显微镜下进行观察，通过形态学差异统计并计算角质形成细胞的纯度，其中角质形成细胞为铺路石状，成纤维细胞为梭形。角质形成细胞纯度(％)＝角质细胞数/总的细胞数×100％。

实施例3：如图3；不进行低温苏醒时：

(1)样品的获取和前期处理：从医院中将男性包皮组织放入含有双抗的PBS中，4度保存带回实验室。用PBS反复洗组织3-5次，尽量除去血污和结缔组织，将组织固定在含有PBS的加样槽中剪成宽0.5mm，长3cm的小长条，放入离心管中，加入浓度为2.4u/ml的dispaseII中性分离酶，dispaseII中性分离酶的添加体积为皮肤组织样品重量的3-5倍(ml/g)，于37℃下共孵育30-60min。随后将组织取出于4℃下低烈度超声处理。

其中低烈度超声条件，时间：5-10min，超声功率：50-80W；发射频率：20-30KHz；振幅：20-40％。

(2)组织消解：将超声完的组织迅速机械分离得到表皮层和真皮层，分别剪碎放入不同的离心管中，加入组织样品重量3-5倍体积(ml/g)的胰酶消化液(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，在37度，180rpm转速的摇床中消化，表皮层消化15min，真皮层消化30min，将消化好的组织分别经200目筛过滤，离心去上清。

(3)细胞提取与培养：表皮层细胞沉淀加入无血清培养基Epilife重悬洗脱两次，离心去上清，得到原代角质形成细胞，原代角质形成细胞以无血清培养基Epilife重悬并培养，传代角质形成细胞使用特定培养基培养；真皮层细胞沉淀加入无血清培养基DMEM重悬洗脱两次，离心去上清，得到原代成纤维细胞，原代成纤维细胞沉淀以含20％血清的DMEM培养基重悬并培养，传代成纤维细胞使用含10％血清的DMEM培养基培养。

(4)细胞计数：针对每0.2g皮肤组织中提取出的细胞，用10培养基重悬均匀。重悬后的细胞，取0.5ml向其中添加10ul的0.4％台朌蓝染色液，其中死细胞染蓝色，活细胞不着色并保持正常形态。染色三分钟过后观察，用血球计数板技术，显微镜下观察计算活细胞得率，活细胞得率(％)＝活细胞数/细胞总数×100％。

(5)胰酶二次消化：对正在培养的原代角质形成细胞，加入胰酶消化液(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，37℃处理2min，吸掉胰酶消化液，并以无血清培养基Epilife吹洗细胞2次，洗掉并去除脱落的成纤维细胞，重新加入无血清培养基Epilife培养，可从角质形成细胞中分离出成纤维细胞，获得纯度较高的角质形成细胞。

(6)角质形成细胞纯度检测：对于原代培养的角质形成细胞在显微镜下进行观察，通过形态学差异统计并计算角质形成细胞的纯度，其中角质形成细胞为铺路石状，成纤维细胞为梭形。角质形成细胞纯度(％)＝角质细胞数/总的细胞数×100％。

实施例4：如图4；不进行低烈度超声时：

(1)样品的获取和前期处理：从医院中将男性包皮组织放入含有双抗的PBS中，4度保存带回实验室。用PBS反复洗组织3-5次，尽量除去血污和结缔组织，将组织固定在含有PBS的加样槽中剪成宽0.5mm，长3cm的小长条，放入离心管中，加入浓度为2.4u/ml的dispaseII中性分离酶，dispaseII中性分离酶的添加体积为皮肤组织样品重量的3-5倍(ml/g)，于37℃下共孵育30-60min。

(2)低温苏醒：将dispaseII中性分离酶处理完的组织迅速机械分离得到表皮层和真皮层，分别将表皮层和真皮层低温苏醒处理；

其中低温苏醒条件如下：将组织置于含有维生素C、GLX351322、Fulvene-5和多烯磷脂酰胆碱的PBS溶液中，于15-20℃处理1-2h，其中维生素C的终浓度为25ug/ml-75ug/ml；GLX351322终浓度为0.3-0.4μM；Fulvene-5终浓度为0.5-1.0μM；多烯磷脂酰胆碱终浓度为30-50μM，溶液总体积设定为组织样品重量的2-3倍(ml/g)。

(3)组织消解：处理完后将两种组织剪碎放入不同的离心管中，加入组织样品重量3-5倍体积(ml/g)的胰酶消化液(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，在37度，180rpm转速的摇床中消化，表皮层消化15min，真皮层消化30min，将消化好的组织分别经200目筛过滤，离心去上清。

(4)细胞提取与培养：表皮层细胞沉淀加入无血清培养基Epilife重悬洗脱两次，离心去上清，得到原代角质形成细胞，原代角质形成细胞以无血清培养基Epilife重悬并培养，传代角质形成细胞使用特定培养基培养；真皮层细胞沉淀加入无血清培养基DMEM重悬洗脱两次，离心去上清，得到原代成纤维细胞，原代成纤维细胞沉淀以含20％血清的DMEM培养基重悬并培养，传代成纤维细胞使用含10％血清的DMEM培养基培养。

(5)细胞计数：针对每0.2g皮肤组织中提取出的细胞，用10培养基重悬均匀。重悬后的细胞，取0.5ml向其中添加10ul的0.4％台朌蓝染色液，其中死细胞染蓝色，活细胞不着色并保持正常形态。染色三分钟过后观察，用血球计数板技术，显微镜下观察计算活细胞得率，活细胞得率(％)＝活细胞数/细胞总数×100％。

(6)胰酶二次消化：对正在培养的原代角质形成细胞，加入胰酶消化液(胰蛋白酶0.25％，EDTA0.02％)，37℃处理2min，吸掉胰酶消化液，并以无血清培养基Epilife吹洗细胞2次，洗掉并去除脱落的成纤维细胞，重新加入无血清培养基Epilife培养，可从角质形成细胞中分离出成纤维细胞，获得纯度较高的角质形成细胞。

(7)角质形成细胞纯度检测：对于原代培养的角质形成细胞在显微镜下进行观察，通过形态学差异统计并计算角质形成细胞的纯度，其中角质形成细胞为铺路石状，成纤维细胞为梭形。角质形成细胞纯度(％)＝角质细胞数/总的细胞数×100％。

如下表为不同处理后细胞数量及细胞纯度；

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。