一组戴索唑类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一组戴索唑类化合物，以及该类戴索唑化合物产生菌株、制备方法和其在制备抗肿瘤药物中的应用。属于微生物技术及其制品与医药应用领域。

背景技术

戴索唑类化合物(disorazols)是由纤维堆囊菌(Soranguiumcellulosum)产生的一类大环双内酯化合物，因其结构新颖活性独特而备受关注，目前约有30种衍生物被报道。该类化合物对多种肿瘤细胞系具有强效的细胞毒活性，半数抑制浓度大多纳摩尔至皮摩尔水平。进一步对其作用机理进行研究发现，该类化合物主要是通过抑制细胞微管蛋白的组装而发挥作用，与现在临床上使用的化疗药物长春花碱类接近，这也在一定程度上增加了其成药的可能性。

尽管目前已报到的戴索唑类化合物在体外显示了较强的抗肿瘤活性，但是在体内试验的效果大都不尽如人意，除了disorazol Z衍生后的抗体偶联药物AEZS-125到了临床二期，其余disorazols均未能进入临床试验，其中A1可能由于过高的毒性和体内不稳定未能开发为临床药物，因此有必要设计合成新的戴索唑类衍生物，为抗肿瘤药物开发提供化合物资源。申请人通过对重组菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

发明内容

针对现有抗肿瘤药物急需开发的现状，本发明的目的在于提供一组戴索唑类化合物，以及该戴索唑类化合物的产生菌株、制备方法，和其在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的一组戴索唑类化合物，其特征在于：所述戴索唑类化合物是命名为戴索唑F4的化合物1，其化学构式如式Ⅰ所示；或是命名为戴索唑F5的化合物2，其化学构式如式Ⅱ所示：

上述戴索唑类化合物的制备方法，其特征在于：戴索唑F4的化合物1是由工程菌株泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

其中：发酵条件是所述工程菌株泰国伯克氏菌在M9培养基中，30℃，200rpm发酵，3天后加入灭菌后的大孔树脂，继续培养2天，发酵结束；其中所述M9培养基的配方是：葡萄糖10g/L,磷酸氢二钠6.8g/L；磷酸二氢钠3.0g/L；氯化钠1g/L；硫酸铵1.0g/L；七水硫酸镁0.5g/L；柠檬酸钠0.5g/L。

本发明所述戴索唑类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

其中：所述戴索唑类化合物是命名为戴索唑F4的化合物1；或是命名为戴索唑F5的化合物2。

本发明提供了一种含戴索唑类化合物的抗肿瘤药物，其特征在于：所述药物含有治疗有效量的命名为戴索唑F4的化合物1或命名为戴索唑F5的化合物2和药学上可接受的载体。

本发明提供了一组生产上述戴索唑类化合物的工程菌株，其特征在于：所述生产戴索唑F4的工程菌株是基因工程菌泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

其中：所述工程菌株E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

其中：所述工程菌株E264ΔBAC::attB/3P-disDH7

上述泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

本发明提供了一组戴索唑类化合物(戴索唑F4的化合物1或戴索唑F5的化合物2)，所述化合物由重组菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

附图说明

图1：戴索唑F4的化合物1在氘代甲醇中的核磁图谱。

其中：(A)1H谱；(B)13C谱；(C)DEPT谱；(D)HSQC谱；(E)1H-1H COSY谱；(F)HMBC谱。

图2：戴索唑F5的化合物2在氘代甲醇中的核磁图谱。

其中：(A)1H谱；(B)13C谱；(C)DEPT谱；(D)HSQC谱；(E)1H-1H COSY谱；(F)HMBC谱。

图3：戴索唑F4的化合物1及戴索唑F5的化合物2关键HMBC和

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。

如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，而不应视为限制本发明的范围，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。其他实验方法及试剂或仪器如无特殊说明，均为相关领域常规方法与市售常规产品。质粒p15A-amp-ccdB获取见文献((Wang,H.；Li,Z.；Jia,R.,et al.Nat.Protoc.2016,11,1175-1190)，质粒p15A-genta-int-attP-3P-dis获取见文献(Wang Z.et al.Front.Microbiol.13:1073243.doi:10.3389/fmicb.2022.1073243)，菌株泰国伯克氏菌E264(ATCC 700388)可购自DSMZ，突变株E264ΔBAC::attB获取见文献(Wang Z.et al.Front.Microbiol.13:1073243.doi:10.3389/fmicb.2022.1073243)，菌株E.coli GB2005、E.coli GB05-redgyrA462获取见文献(Fu,J.；Bian,X.；Hu,S.,et al.Nat.Biotechnol.2012,30,440-446)，E.coli WM3064购自北京科瑞思搏生物科技有限公司。

实施例1：泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

1.1由质粒p15A-genta-int-attP-3P-dis出发构建质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

(1)以质粒p15A-amp-ccdB为模板，以DH1

DH1

CGGCGGACCGGGCTGAACGCCCCTCGATCCCCGTGGACCGCCTGATCGCCGATGTTTAAACTAAATACATTCAAATATG

DH1

(2)从平板上挑取GB05-redgyrA462至1mL的LB培养基中(1.5mL EP管)，37℃，950rpm培养过夜。

(3)取40uL过夜培养的GB05-redgyrA462接种至1.3mL的LB液体培养基中，37℃，950rpm，培养2h。

(4)将GB05-redgyrA462置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(5)用1ml无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(6)重复步骤5，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(7)将质粒p15A-genta-int-attP-3P-dis约200ng加入菌体；

(8)用移液器将混合液转移至1mm的电转杯中

(9)1250V电击后加入1ml LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5ml EP管中，37℃，950rpm复苏60min；

(10)复苏完后9000rpm离心1min，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有Genta(庆大霉素)的LB平板上；

注：步骤2-10是将质粒电转进大肠杆菌GB05-redgyrA462中，此菌株含有诱导型red重组系统，并且GyrA亚基的462位氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸，导致E.coli细胞产生CcdB(CcdB是一种毒蛋白)抗性。

(11)挑取部分长出的克隆，接种至1mL的含有Genta的LB培养基中(1.5mL EP管)，37℃，950rpm培养过夜。

(12)取40uL过夜培养的GB05-redgyrA462/p15A-genta-int-attP-3P-dis接种至1.3mL的LB液体培养基中，30℃，950rpm，培养2h。

(13)向步骤12中的GB05-redgyrA462/p15A-genta-int-attP-3P-dis中加入20μL阿拉伯糖(10％v/w)诱导液，并转至37℃，950rpm诱导40min；

(14)将培养物置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(15)用1mL无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(16)重复步骤15，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(17)将步骤1中的PCR产物300ng加入菌体；

(18)用移液器将混合液转移至1mm的电转杯中

(19)1350V电击后加入1mL LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5ml EP管中，37℃，950rpm复苏60min；

(20)复苏完后9000rpm离心1min，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有Amp(氨苄青霉素)的LB平板上；

(21)挑取部分长出的克隆，酶切鉴定，选取酶切正确的质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

注：步骤11-21是在大肠杆菌GB05-redgyrA462中，诱导red重组酶，使加入的PCR片段与质粒p15A-genta-int-attP-3P-dis进行重组，插入amp-ccdB并引入突变序列，以Amp作为正向筛选标记。

(22)从平板上挑取GB05-redgyrA462至1mL的LB培养基中(1.5mL EP管)，37℃，950rpm培养过夜。

(23)取40μL过夜培养的GB05-redgyrA462接种至1.3mL的LB液体培养基中，37℃，950rpm，培养2h。

(24)将GB05-redgyrA462置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(25)用1mL无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(26)重复步骤25，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(27)取步骤21中质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

(28)用移液器将混合液转移至1mm的电转杯中

(29)1250V电击后加入1ml LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5mL EP管中，37℃，950rpm复苏60min；

(30)复苏完后9000rpm离心1min，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有Amp的LB平板上；

(31)挑取克隆，Amp液体培养，提取质粒，取一部分进行酶切鉴定并测序。

注：步骤22-31是将质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

(32)将重转化的质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

(33)酶切后的质粒用除盐膜除盐40分钟

(34)酶切并除盐后的质粒用DNA聚合酶T4处理，所用程序依次为25℃，30分钟，70℃，30分钟，50℃，30分钟，4℃永久保存。

(35)从平板上挑取GB2005至1mL的LB培养基中(1.5mL EP管)，37℃，950rpm培养过夜。

(36)取40uL过夜培养的GB2005接种至1.3mL的LB液体培养基中，37℃，950rpm，培养2h。

(37)将GB2005置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(38)用1mL无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(39)重复步骤38，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(40)取步骤34中酶切并除盐后的质粒约200ng加入菌体；

(41)用移液器将混合液转移至1mm的电转杯中

(42)1250V电击后加入1ml LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5ml EP管中，37℃，950rpm复苏60min；

(43)复苏完后9000rpm离心1min，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有Genta的LB平板上；

(44)挑取克隆至Genta的LB中培养，提取质粒，酶切验证并测序，得到质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

注：步骤32-44是用限制性内切酶PmeI切掉amp-ccdB，并暴露同源臂，利用T4DNA聚合酶处理同源臂，产生5’端单链，通过退火自身环化成双链，得到聚酮合酶模块1中的脱水酶结构域DH1位点失活突变的的质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

1.2由质粒p15A-genta-int-attP-3P-dis出发构建质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

(1)以质粒p15A-amp-ccdB为模板，以DH7

DH7

ACACGTCGACGTTCAGAGAGCAGCGGTTCGCCACGACCTTCACCGGCGAGGAGAT CCTCCTCTCGGACGTTTAAACTAAATACATTCAAATATGTATC

DH7

CTCCAGGTAAGCCGTGCCCGGCAGCAGGGCGCGGCCTCGGATCCGGAAGTCCGAG AGGAGGATCTCCTCGCCGGTGAAGTTTAAACAGCCCGCTCATTAG

(2)从平板上挑取GB05-redgyrA462至1mL的LB培养基中(1.5mL EP管)，37℃，950rpm培养过夜。

(3)取40uL过夜培养的GB05-redgyrA462接种至1.3mL的LB液体培养基中，37℃，950rpm，培养2h。

(4)将GB05-redgyrA462置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(5)用1ml无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(6)重复步骤5，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(7)将质粒p15A-genta-int-attP-3P-dis约200ng加入菌体；

(8)用移液器将混合液转移至1mm的电转杯中

(9)1250V电击后加入1ml LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5ml EP管中，37℃，950rpm复苏60min；

(10)复苏完后9000rpm离心1min，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有Genta的LB平板上；

注：步骤2-10是将质粒电转进大肠杆菌GB05-redgyrA462中，此菌株含有诱导型red重组系统，并且GyrA亚基的462位氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸，导致E.coli细胞产生CcdB(CcdB是一种毒蛋白)抗性。

(11)挑取部分长出的克隆，接种至1mL的含有Genta的LB培养基中(1.5mL EP管)，37℃，950rpm培养过夜。

(12)取40uL过夜培养的GB05-redgyrA462/p15A-genta-int-attP-3P-dis接种至1.3mL的LB液体培养基中，30℃，950rpm，培养2h。

(13)向步骤12中的GB05-redgyrA462/p15A-genta-int-attP-3P-dis中加入20μL阿拉伯糖(10％v/w)诱导液，并转至37℃，950rpm诱导40min；

(14)将培养物置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(15)用1mL无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(16)重复步骤15，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(17)将步骤1中的PCR产物300ng加入菌体；

(18)用移液器将混合液转移至1mm的电转杯中；

(19)1350V电击后加入1mL LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5ml EP管中，37℃，950rpm复苏60min；

(20)复苏完后9000rpm离心1min，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有Amp的LB平板上；

(21)挑取部分长出的克隆，酶切鉴定，选取酶切正确的质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

注：步骤11-21是在大肠杆菌GB05-redgyrA462中，诱导red重组酶，使加入的PCR片段与质粒p15A-genta-int-attP-3P-dis进行重组，插入amp-ccdB并引入突变序列，以Amp作为正向筛选标记。

(22)从平板上挑取GB05-redgyrA462至1mL的LB培养基中(1.5mL EP管)，37℃，950rpm培养过夜。

(23)取40μL过夜培养的GB05-redgyrA462接种至1.3mL的LB液体培养基中，37℃，950rpm，培养2h。

(24)将GB05-redgyrA462置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(25)用1mL无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(26)重复步骤25，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(27)取步骤21中质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

(28)用移液器将混合液转移至1mm的电转杯中

(29)1250V电击后加入1ml LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5mL EP管中，37℃，950rpm复苏60min；

(30)复苏完后9000rpm离心1min，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有Amp的LB平板上；

(31)挑取克隆，Amp液体培养，提取质粒，取一部分进行酶切鉴定并测序。

注：步骤22-31是将质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

(32)将重转化的质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

(33)酶切后的质粒用除盐膜除盐40分钟

(34)酶切并除盐后的质粒用DNA聚合酶T4处理，所用程序依次为25℃，30分钟，70℃，30分钟，50℃，30分钟，4℃永久保存。

(35)从平板上挑取GB2005至1mL的LB培养基中(1.5mL EP管)，37℃，950rpm培养过夜。

(36)取40uL过夜培养的GB2005接种至1.3mL的LB液体培养基中，37℃，950rpm，培养2h。

(37)将GB2005置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(38)用1mL无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(39)重复步骤38，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(40)取步骤34中酶切并除盐后的质粒约200ng加入菌体；

(41)用移液器将混合液转移至1mm的电转杯中

(42)1250V电击后加入1ml LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5ml EP管中，37℃，950rpm复苏60min；

(43)复苏完后9000rpm离心1min，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有Genta的LB平板上；

(44)挑取克隆至Genta的LB中培养，提取质粒，酶切验证并测序，得到质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

注：步骤32-44是用限制性内切酶PmeI切掉amp-ccdB，并暴露同源臂，利用T4DNA聚合酶处理同源臂，产生5’端单链，通过退火自身环化成双链，得到聚酮合酶模块7中脱水酶结构域DH7位点失活突变的的质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

1.3将质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

在本部分实验中，将表达质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

(1)挑取接合转移辅助大肠杆菌WM3064，接种至含有1mM DAP(二氨基庚二酸)的LB中，37℃过夜培养；

(2)取40μL过夜培养的WM3064接种至含有1mM DAP的1.3mL的LB液体培养基中，30℃，950rpm，培养2h，然后转至37℃，950rpm培养40min；

(3)将WM3064置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(4)用1ml无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(5)重复步骤4，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(6)将质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

(7)1250V电击后加入含有1mM DAP的1ml LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5ml EP管中，37℃，900rpm复苏60min；

(8)复苏完后9000rpm离心30秒，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有1mM DAP和5μg/mL Genta的LB平板，置于37℃过夜培养。

(9)在操作(8)的同时，将泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB划线接种至LB平板，同样置于37℃过夜培养。

(10)步骤(8)长出的克隆为携带质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

(11)刮取菌苔，划线于不含DAP的5μg/mL Genta LB平板上。此时，大肠杆菌WM3064由于缺少DAP，因此不生长，只有质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH1

(12)挑取克隆PCR鉴定，确定得到突变株E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

1.4将质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

在本部分实验中，将表达质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

(1)挑取接合转移辅助大肠杆菌WM3064，接种至含有1mM DAP(二氨基庚二酸)的LB中，37℃过夜培养；

(2)取40μL过夜培养的WM3064接种至含有1mM DAP的1.3mL的LB液体培养基中，30℃，950rpm，培养2h，然后转至37℃，950rpm培养40min；

(3)将WM3064置于离心机中，9000rpm离心30秒，去掉上清；

(4)用1ml无菌去离子水将菌体重悬，再次9000rpm离心30秒，去掉上清；

(5)重复步骤4，并用约50μL去离子水将菌体重悬；

(6)将质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

(7)1250V电击后加入含有1mM DAP的1ml LB培养基，将菌体充分悬浮后转移至1.5ml EP管中，37℃，900rpm复苏60min；

(8)复苏完后9000rpm离心30秒，去掉上清，并用残留的培养基将菌体重新悬浮后涂布于含有1mM DAP和6μg/mL Genta的LB平板，置于37℃过夜培养。

(9)在操作(8)的同时，将泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB划线接种至LB平板，同样置于37℃过夜培养。

(10)步骤(8)长出的克隆为携带质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

(11)刮取菌苔，划线于不含DAP的5μg/mL Genta LB平板上。此时，大肠杆菌WM3064由于缺少DAP，因此不生长，只有质粒p15A-genta-int-attP-3P-disDH7

(12)挑取克隆PCR鉴定，确定得到突变株E264ΔBAC::attB/3P-disDH7

实施例2：泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

将实施例1构建的E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

实施例3：戴索唑类化合物的分离纯化和结构鉴定

3.1目的化合物的分离纯化

将实施例2中泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH1

将实施例2中泰国伯克氏菌E264ΔBAC::attB/3P-disDH7

3.2戴索唑类化合物的结构鉴定

进一步地对上述分离到的目的化合物进行高分辨质谱、核磁的检测。

仪器型号：核磁测试为Bruker AVNEO 600MHz核磁系统；高分辨质谱用BrukerImpact HD microTOF Q III质谱仪。

目的化合物的理化性质及波谱数据(见图1、图2)如下，判定为戴索唑类化合物。

化合物1，命名为戴索唑F4：白色粉末，分子式C

化合物2，命名为戴索唑F5：白色粉末，分子式C

其化学构式如式Ⅰ(化合物1)和式Ⅱ(化合物1)所示：

表1化合物1和2在MeOH-d

根据HRESIMS推测戴索唑F4(化合物1)的分子式为C

采用同样的方式推导了化合物2的结构(见图3)。

实施例4：戴索唑类化合物的抗肿瘤细胞毒活性测试

测试样品为上述实施例3中分离精制的化合物1和2。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，用MTT法进行抗肿瘤细胞毒活性测定。

抗肿瘤细胞毒活性结果见表2。

其中：戴索唑F

表2.化合物1和2抗肿瘤细胞毒活性(IC

比较试验显示：戴索唑F4的细胞毒性比A1降低4个数量级，为微摩尔水平，戴索唑F5的细胞毒性比A1降低1个数量级，为纳摩尔水平。由于化合物1和2表现出的高效抗肿瘤细胞毒活性，表明所述戴索唑类化合物具有开发成为抗肿瘤药物的潜力，可能进一步开发成新型抗肿瘤药物。