桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法

技术领域

本发明属于微生物学、生物技术和生物防治技术领域，涉及桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法。

背景技术

安吉菌素（Andrimid）是一种非核糖体肽-聚酮抗生素，在过去的二十年中研究已发现多种不同的细菌分泌产生安吉菌素，包括成团泛菌 (

目前，桃色欧文氏菌首次被报道可产生安吉菌素，因此关于其发酵条件的研究仍是空白。但Matilla等人在2016年对碳氮源及温度对普城沙雷菌菌株A153产安吉菌素做了系列研究，发现在4-20℃下能够稳定产生安吉菌素，但在30℃下则检测不到，且仅局限于三角摇瓶体系中。Giuubergia等人发现了添加甲壳素可提高以溶珊瑚弧菌菌株 S2052安吉菌素的产量。但桃色欧文氏菌与上述两种菌株差异较大，不能直接借鉴二者的培养方法。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

因此，桃色欧文氏菌的发酵条件应结合菌种本身特性及安吉菌素基因簇特征进行特异性优化，以致力于获得安吉菌素最佳产量。

本发明的一个目的是提供一种最优的发酵方式用于获得最高产量的安吉菌素，该方法可在摇瓶体系到5 L发酵罐体系下进行。该发酵方式适用于具有产安吉菌素功能的桃色欧文氏菌菌株。

为此，本发明提供的技术方案为：

桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法，包括如下步骤：

1）将桃色欧文氏菌（

2）从步骤1）中生长的发酵液中收集安吉菌素。

优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，所述桃色欧文氏菌采用桃色欧文氏菌2022TIBBST187菌株（简称BST187），所述桃色欧文氏菌2022TIBBST187菌株的分类命名：桃色欧文氏菌

优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，步骤1）中，所述液体培养基以柠檬酸钠为碳源，以牛肉膏为氮源，以氯化钠为无机盐。最优发酵培养基为柠檬酸钠20g/L，牛肉膏5 g/L和氯化钠 10g/L。

优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，步骤1）中，发酵初始pH为6-7，发酵过程中调节pH保持6-7，适宜的最终pH为6.8-7.8。作为优选，发酵过程最好将pH稳定在7左右。

优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，步骤1）中，培养在5 L发酵罐中进行，且在发酵过程中维持DOI高于30%。高溶氧可以显著提高BST187的菌体生物量。

优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，步骤1）中，所述桃色欧文氏菌的种子液的接种量为1%-3%。最优选接种量为1%。

优选的是，所述的桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法中，还包括如下步骤：首先，取出保存的桃色欧文氏菌菌株的菌种，于LB固体培养基上划线活化，28℃培养箱过夜培养，然后，将活化出来的单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，28℃、200 rpm摇培过夜得到所述种子液。当然，作为优选，也可使用最优发酵培养基（柠檬酸钠20 g/L，牛肉膏5 g/L和NaCl 10g/L）、温度15-20℃下进行生产种子液。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供一株桃色欧文氏菌抑菌物质安吉菌素（andrimid）的发酵培养基和发酵条件的优化方法，本发明采用液体发酵方法，发酵时间为12-24 h、接种量1%、初始和发酵pH为6.5-7.5、维持高溶氧水平、温度为15-20℃。以最优发酵条件，5 L发酵罐发酵生产，将发酵上清液经80%硫酸铵沉淀、甲醇溶解后的安吉菌素粗提物纯度在40%-60%，浓度约为10.73 g/L，比原始发酵条件提高了3.1倍，所需成本仅为最初1/3，操作过程简化，极大的节省了人力物力。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

桃色欧文氏菌2022TIBBST187菌株（简称BST187），所述桃色欧文氏菌2022TIBBST187菌株的分类命名：桃色欧文氏菌

图 1 为本发明实施例中外标法计算安吉菌素浓度的标准曲线。

图2为本发明实施例中液体发酵和固体发酵两种方式下安吉菌素产量的比较图-OD297。

图3为本发明实施例中液体发酵和固体发酵两种方式下安吉菌素产量的比较-峰面积图。

图4为本发明实施例中不同培养基对BST187生物量影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图5为本发明实施例中不同培养基对BST187安吉菌素产量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图6为本发明实施例中接种量对BST187生物量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图7为本发明实施例中接种量对BST187安吉菌素产量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图8为本发明实施例中培养基初始pH对BST187生物量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图9为本发明实施例中培养基初始pH对BST187安吉菌素产量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图10为本发明实施例中不同初始pH培养基发酵后终pH的比较，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图11为本发明实施例中代表不同溶氧量的发酵瓶类型图。

图12为本发明实施例中溶氧对BST187生物量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图13为本发明实施例中溶氧对BST187安吉菌素产量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图14为本发明实施例中温度对BST187生物量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图15为本发明实施例中温度对BST187安吉菌素产量的影响，不同字母代表两者之间存在显著差异（

图16为本发明实施例中5 L发酵罐条件下BST187生物量和安吉菌的产量变化图。

图17为本发明实例中BST187解磷功能和抑菌功能的验证。

图18为本发明实例中安吉菌素粗提物液相色谱检测图。

图19为本发明实施例中安吉菌素的一级质谱图。

图20为本发明实施例中安吉菌素的二级质谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：

实例1反相高效液相色谱检测安吉菌素标准曲线的建立

前期研究用制备型液相色谱获取安吉菌素纯品10 mg。本实例利用反相高效液相色谱建立了标准曲线，通过外标定量来测定安吉菌素的发酵产量。具体做法是：1）标准溶液的配制：将10 mg安吉菌素纯品溶于甲醇中，制成浓度为10 mg/mL的母液；2）梯度稀释：将安吉菌素母液梯度稀释10、50、100、500、1000、5000、10000以及50000倍后通过反相高校液相色谱进行检测，液相色谱条件为甲醇：水：甲酸（30:70:0.1% vol/vol），紫外检测波长为297nm；3）标准曲线的建立：计算出峰时间在9-11min的物质的峰面积与物质浓度质之间的线性关系，制作标准曲线。

通过上述方法，计算出峰面积（x）与安吉菌素含量（y: mg/mL）之间的关系为y=57342x+62.829 （r

实例2发酵方式

桃色欧文氏菌2022TIBBST187菌株，所述桃色欧文氏菌2022TIBBST187菌株的分类命名：桃色欧文氏菌

比较菌株2022TIBBST187（后文简称BST187）在固体发酵和液体发酵的代谢产物中安吉菌素的含量，确定后续发酵方式。具体做法为：分别制作100 mL LB固体培养基（酵母浸粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂 15 g/L）和100 mL LB液体培养基（酵母浸粉 5 g/L，胰蛋白胨 10 g/L，NaCl 10g/L），121℃高温高压灭菌20min。其中100 mL固体培养基制作成约6个90 mm培养皿的LB固体平板，100 mL 液体培养基装于250 mL三角瓶中。将菌株BST187活化扩繁制备种子液，具体做法为：首先，从-80度冰箱取出BST187菌种，于LB固体培养基上划线活化，28℃培养箱过夜培养。次日，将活化出来的单菌落接种于5 mL LB液体培养基中，28℃ 、200 rpm摇培过夜后，将菌悬液于10000rpm，离心5min，去除上清，沉淀菌体用0.85%无菌生理盐水调节种子液OD

结果如图2、图3所示，两种方式提取的发酵物在紫外吸收波长297 nm左右处有最大吸收峰，其中固体发酵物OD

实例3发酵时间

按照实例1中的方法制备种子液，将种子液按照1:100比例加入100 mL LB液体培养基中，28℃、200 rpm摇培，并分别于2、4、6、8、10、12、18、20、24、36、48 h时取样，测量OD

结果显示，随着时间的延长，安吉菌素的产量逐渐上升，但达到一定发酵时间后，安吉菌素的产量达到最大，随后开始下降。因此，为达到最大的安吉菌素产量，需掌控好发酵时间，最佳发酵时间范围为12-24小时。

实例4培养基优化

选择基础发酵培养基（葡萄糖20 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L），采用单因素法进行BST187最佳发酵培养基的筛选。

前期实验中，将基础发酵培养基中的碳源分别替换成甘油、蔗糖、葡萄糖、柠檬酸钠、水溶性淀粉、甘露醇、麦芽提取物、木糖、果糖、山梨醇、玉米淀粉、糖蜜和葡萄糖酸钠。将氮源分别替换成硫酸铵、尿素、氯化铵、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、酪蛋白胨和豆粕粉，制成培养基，按照实例1制作种子液，将种子液以1%量接种到30 mL液体培养基中，28℃、200rpm摇培12-24 h，通过HPLC定量检测安吉菌素。结果发现最优碳源为柠檬酸钠和葡萄糖酸钠，最优氮源为酵母提取物、牛肉膏和胰蛋白胨。

分别以最优碳氮源进行相互配对制备发酵培养基（表1），以LB作为对照，培养基体积为100 mL。将种子液以1%的量接种于表1发酵培养基中，将接种后的液体培养基于28 ℃、200 rpm摇培12-24 h，测量OD

结果如图4所示，LB培养基的菌体生物量最高。如图5所示，相同氮源条件下，柠檬酸钠和葡萄糖酸钠之间的生物量相差较小，相同碳源条件下，牛肉膏和酵母提取物生物量显著高于胰蛋白胨。但以牛肉膏作为氮源，柠檬酸钠的安吉菌素产量显著高于葡萄糖酸钠，相同碳源条件下，牛肉膏作为氮源安吉菌素产量也显著高于胰蛋白胨和酵母提取物，且优于传统的LB培养基。因此最优发酵培养基为柠檬酸钠（2%），牛肉膏（0.5%）和NaCl（1%）。

实例5接种量

以选出的最优碳源、氮源为培养基。将种子液分别按照0.1%、0.5%、1%、2%、3%的接种量接种到100 mL 液体培养基中，28 ℃、200 rpm摇培12-24 h，测量OD

结果如图6、图7所示，随着接种量的增加，BST187的菌体生物量出现增加趋势。在接种量为3%时达到最大，但和1%相比并无显著差异。同时安吉菌素的产量在1%接种量时达到最大，显著高于0.1%的接种量，因此BST187适宜接种量约为1%-3%。

实例6初始pH

以选出的最优碳源、氮源为培养基。将培养基的初始pH调至6.0、7、7.8、8.6。将种子液按照1%的接种量接种到100 mL液体培养基中，28 ℃、200 rpm摇培12-24 h，测量OD

结果如图8、图9所示，初始pH为7时，BST187的菌体生物量最高，但无显著差异，而pH为6-7时，安吉菌素的产量显著高于pH 7.8和8.6。因此最适宜初始pH为6-7。发酵结束后（图10），低初始pH（pH6、pH7）的BST187发酵液pH上升了0.8左右。因此适宜的最终pH为6.8-7.8，后续发酵过程需要将pH稳定在7左右。

实例7溶氧

以选出的最优碳源、氮源为培养基，利用三角瓶的挡板效应，三角瓶底部的凹槽设计形成涡流，能够加速培养液剧烈流动，增加液体表面和氧气的交换，提高溶氧量。取100mL分别加入带四个挡板、三个挡板和不带挡板的250 mL三角瓶中（图11），分别代表高溶氧、中度溶氧和低溶氧条件。将种子液按照1%的接种量接种到100 mL 液体培养基中，放置于摇床中200 rpm、28℃摇培12-24 h后，测量OD

结果如图12、图13所示，高溶氧可以显著提高BST187的菌体生物量（2.5倍）和安吉菌素产量（3.6倍）。此外，三挡板和四挡板之间并未显著差异。因此后续发酵过程需要将溶氧维持在一定的水平。

实例8温度

以LB为培养基。将种子液按照1%的接种量接种到100 mL液体培养基中，分别用15-20℃、25-28℃、30-37℃的发酵温度，200 rpm摇培12-24 h。测量OD

结果如图14、图15所示，发酵温度为15-20℃时，生物量和安吉菌素的产量出现显著提高，和25-28℃相比分别提高了1.3倍和3.4倍。因此，BST187适宜发酵温度为15-20℃。

实例9 5 L发酵罐小试

根据上述实验，确定了BST187产安吉菌素最佳发酵培养基、接种量、初始pH、发酵温度，同时发酵过程中需要补充氧气。因此在最佳条件下通过5 L发酵罐，保持一定的溶氧水平，控温、控pH进行小试，分别于9、12、15、18、21、24、32、36和45 h取样，测量OD600用于表征生物量，通过HPLC测量安吉菌素浓度。

结果如图16所示，安吉菌素峰面积最高值可达2527.7，和最初发酵条件相比，其产量提高了3.1倍。

实例10菌株BST187的分离筛选及功能鉴定

菌株BST187分离自2022年于天津东丽区采集的番茄根际土壤。具体做法如下：取1g采集土壤与99 mL 1×PBS缓冲液混匀（稀释倍数10

通过上述解磷菌分离筛选过程，我们从解有机磷培养基中分离出一株高效解磷菌，结果如图17（左）所示，将其命名为2022TIBBST187。通过分子生物学方法发现菌株BST187中1468 bp长度的16S rRNA序列与National Center for BiotechnologyInformation（NCBI）数据库中桃色欧文氏菌菌株B64的相似性为99.65%，因此结合菌体的形态特征和分子生物学，将菌株BST187鉴定为桃色欧文氏菌。

后续对菌株BST187的其他功能进行了验证，包括抑菌活性等。具体做法为：将病原细菌野油菜单胞菌辣椒斑点病致病型（

实例11安吉菌素的提取及鉴定

安吉菌素属于非核糖体肽-聚酮抗生素，含有部分活性氨基酸，因此其提取方法可以参照蛋白进行，具体方法如下。

向菌株BST187液体发酵液中加入硫酸铵至80%饱和浓度，加入过程中缓慢搅拌使其溶解，过程中会有棕色固体开始析出，将加入硫酸铵的溶液放入4 ℃过夜。次日将其于10000 rpm、4 ℃离心10 min，去上清，称量沉淀重量，加入甲醇溶解，使其浓度为0.1g/mL，沉淀溶解后，10000 rpm、4 ℃离心 5 min取上清，得到安吉菌素粗提物。硫酸铵沉淀安吉菌素法，所消耗的试剂成本低，操作过程简单，极大的节省了人力物力。

安吉菌素粗提物经超高效液相色谱-质谱联用进行了进一步定性分析，高效液相色谱分离结果如图18所示，质谱鉴定结果如图19和图20所示，通过分子式查找及二级碎片离子结构分析，可将出峰时间为9.701 min的物质定性为安吉菌素andrimid（C27H33N3O5）。按照面积归一化法计算，安吉菌素在发酵粗提物中含量为40%-60%。

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。