一种冷适性α-琼胶酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种冷适性α-琼胶酶及其应用，属于基因工程与生物技术领域。

背景技术

琼脂是一种从大型红藻(包括石花菜、江蓠和紫檀)的细胞壁中获得的亲水性多糖，凝胶强度和亲水性较高，能够吸水膨胀，还具有特别的稳定效应，被广泛地用作增稠剂、乳化剂、胶凝剂、稳定剂、赋形剂、水分保持剂等添加剂。琼脂还可以进一步制成琼脂糖，琼脂糖是由3-O-β-D-半乳糖(D-Gal)和4-O-3,6-脱水-α-L-半乳糖(L-AHG)的交替单糖残基组成的线性链，因其具有电渗小、凝胶强度高等特性，可用作电泳的介质材料等生物学应用。此外，琼脂糖可水解生产琼脂寡糖，琼脂寡糖一般含有2～20个通过糖苷键连接的糖单元，分为以D-半乳糖为还原端的琼胶寡糖和以3,6-脱水-α-L-半乳糖为还原端的新琼寡糖，均具有一定的功能活性，例如抗炎、抗氧化、抑制黑素瘤细胞、作为益生元来调节肠道菌群和用于改善雄激素源性脱发等。

目前工业上降解琼脂主要有两种方式：酸水解和酶解，酸水解法效率高、产量大，但会产生大量副产物，存在琼胶寡糖分离提纯困难、具有安全隐患等问题；而琼胶酶酶解方法具有催化效率高、底物特异性强、反应条件温和等优点，是降解琼脂多糖的首选方式。但大多数利用酶法降解琼脂多糖的研究还处于实验室研究阶段，主要问题是产琼脂酶的菌株大多数来自于海洋，菌株产酶性状不稳定、产酶量低，使生产琼胶酶的成本高，价格昂贵，难以实现商业化应用。因此，寻找水解活力高，性状稳定的琼胶酶基因，并实现异源表达成为生产琼胶酶的最经济高效的办法。

琼胶酶，可根据水解琼脂糖模式的不同分为α-琼胶酶(EC3.2.1.158)和β-琼胶酶(EC3.2.1.81)，α-琼胶酶能裂解琼脂糖的α-1,3键产生琼胶寡糖；β-琼胶酶可以水解β-1,4键生成新琼胶寡糖，该寡糖产物因具有特殊的功能活性在功能性食品、医药工业和化妆品行业而具有较高的经济价值。此外，琼胶酶在生物技术也存在应用潜力，如海藻原生质体制备和鉴定红藻中的琼脂、DNA凝胶回收等。

目前，市场上的DNA凝胶回收方法通常为首先将含目的DNA的凝胶切割出来后，添加适量化学融胶液并在在50℃以上的高温下孵育来融化胶。胶融化后，使用酚氯仿抽提，酒精沉淀或离子交换柱等方式进行清洗与洗脱。而融胶步骤中使用的融胶液通常含有硼酸、EDTA等化学成分，有毒有害，存在一定刺激性。同时需要在50℃以上的高温下加热，虽然高温可以提高反应速率，但这一过程耗费能源、增添了二氧化碳排量。因此，选择冷适性琼胶酶充当DNA凝胶回收过程中的生物融胶剂，具有安全环保、节能减排的优势，有广阔的市场应用空间。

发明内容

本发明提供了一种无需高温加热，环保无害的可用于DNA回收的冷适性α-琼胶酶，可作为环境友好的生物制剂，代替化学试剂用于DNA凝胶回收。

本发明提供了一种编码冷适性α-琼胶酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了携带所述基因的重组载体。

本发明还提供了表达所述冷适性α-琼胶酶，或含有所述重组载体的重组微生物细胞。

在一种实施方式中，所述重组微生物细胞是重组毕赤酵母。

在一种实施方式中，所述重组毕赤酵母以Pichia GS115为宿主，以pPIC9k质粒为载体，表达所述冷适性α-琼胶酶。

本发明还提供了所述重组毕赤酵母的构建方法，将α-琼胶酶的基因克隆到pPIC9k质粒中，线性化质粒后将所述质粒通过电转化导入毕赤酵母的基因组中。

本发明还提供了应用所述重组毕赤酵母生产α-琼胶酶的方法。

在一种实施方式中，所述方法包括：

(1)将所述重组毕赤酵母菌在培养基中培养，用甲醇诱导表达产酶；

(2)收集细胞培养液中的α-琼胶酶。

在一种实施方式中，所述方法具体为：将所述重组毕赤酵母菌接种于YPD液体培养基，过夜培养得到种子液，然后将种子液接种于BMGY培养基中培养，培养至OD

在一种实施方中，所述YPD培养基包括10g/L酵母提取物、20g/L胰蛋白胨、20g/L葡萄糖。

在一种实施方式中，所述BMGY培养基包括10g/L酵母提取物、20g/L胰蛋白胨、100mL/L磷酸钾缓冲液母液、13.4g/L YNB、2mL/L生物素母液、10mL/L甘油。

在一种实施方式中，所述BMMY培养基包括10g/L酵母提取物、20g/L胰蛋白胨、20g/L葡萄糖、100mL/L磷酸钾缓冲液母液、13.4g/L YNB、2mL/L生物素母液、5mL/L甲醇。

在一种实施方式中，所述磷酸钾缓冲液母液由0.45g K

本发明还提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的α-琼胶酶在回收DNA方面的应用。

在一种实施方式中，所述应用是在≤30℃，或≤25℃的环境下回收DNA。

在一种实施方式中，所述应用包括：

(a)将α-琼胶酶用于水解含DNA的琼脂糖凝胶；

(b)回收步骤(a)的酶解产物中的DNA。

在一种实施方式中，所述步骤(a)是在≤30℃，尤其是≤25℃的环境下进行酶解。

在一种实施方式中，所述步骤(b)包括使用使用离子交换柱进行洗脱与纯化。

在一种实施方式中，所述琼脂糖凝胶中琼脂糖的浓度为0.5～1.0％。

在一种实施方式中，所述α-琼胶酶的添加量为20～100U/g琼脂糖凝胶。

在一种实施方式中，步骤(a)酶解反应4～6h。

本发明还提供所述α-琼胶酶在制备用于DNA回收的试剂盒中的应用。

有益效果：

(1)本发明成功的采用食品安全菌株毕赤酵母菌对α-琼胶酶进行异源表达，应用该菌株生产α-琼胶酶安全、高效，且外源蛋白含量低，有利于分离纯化，生产获得的的α-琼胶酶的催化活力可高达20.1U/mg，可应用于食品、药品的生产中。

(2)本发明提供的α-琼胶酶具有较高的比酶活与良好的冷适性，在10℃仍能保持61.8％的相对酶活。

(3)本发明提供的利用α-琼胶酶进行DNA凝胶回收的方法：将该α-琼胶酶于室温下与含DNA片段的凝胶反应即可实现完全水解，所得液体纯化后得到回收率较高，达到78.0％。此方法无需添加含硼酸、EDTA的化学试剂融胶液，也无需高温加热，更加环保无害，节约能源，从而具有广阔的工业应用价值。

附图说明

图1：pPIC9k-AGA线性化验证；其中，M：蛋白质Marker；泳道1：未线性化的pPIC9k-AGA；泳道2：线性化后的pPIC9k-AGA。

图2：GS115-pPIC9k-AGA重组菌株菌落PCR验证；M：蛋白质Marker；泳道1：重组菌株GS115-pPIC9k-AGA。

图3：α-琼胶酶的SDS-PAGE分析；其中，M：蛋白质Marker；泳道1：粗酶液；泳道2：纯酶液。

图4：不同温度条件下的α-琼胶酶的相对酶活数据。

图5：α-琼胶酶回收DNA片段验证图谱；其中，M：蛋白质Marker；泳道1：未经回收的原始DNA；泳道2：使用融胶液融胶后回收的DNA；泳道3：使用α-琼胶酶水解胶后回收的DNA；泳道4：使用水后回收的DNA。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

α-琼胶酶酶活测定方法如下：以Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)配制1g/L的琼脂糖底物，在0.9mL底物中加入0.1mL适当稀释的酶液，不同温度下震荡反应30min，加入1mL3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液终止酶促反应，沸水浴5min后冰浴冷却，540nm下测定吸光值，与半乳糖标准曲线比较。

酶活定义：每分钟生成1μmol还原糖(以半乳糖计)所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。

凝胶DNA回收率检测方法：将经α-琼胶酶水解凝胶后得到的液体使用离子交换柱进行结合与纯化，所得产物使用酶标仪测定浓度计算DNA含量。回收率计算方式如下：

回收率＝(切胶回收所得DNA含量/原始DNA量)×100％

实施例1：重组毕赤酵母分泌表达系统的构建

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-琼胶酶；

(2)利用限制性内切酶SnaB I和Not I双酶切载体质粒pPIC9K，双酶切反应条件为37℃酶切1h。

表1酶切反应体系

(3)使用同源重组方法将步骤(1)获得的α-琼胶酶基因和步骤(2)获得的pPIC9K质粒载体连接，同源重组条件为37℃孵育30min；之后转化大肠杆菌E.coli JM109，涂布具有10μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基，挑取转化子进行测序、双酶切验证，获取重组质粒pPIC9K-AGA。

表2同源重组反应体系

其中，LB固体培养基配方如下：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，15g/L琼脂粉。

(4)将重组表达载体pPIC9K-AGA质粒用限制性内切酶Sac I进行单酶切以实现质粒线性化，单酶切反应条件为37℃酶切1h；使用DNA凝胶电泳鉴定是否线性化完全(如图1)。

表3酶切反应体系

(5)取步骤(4)制备的10μL经线性化处理的重组质粒与80μL酵母感受态细胞轻弹混匀；尽数吸出转移到0.2cm型预冷的转化杯中电穿孔转化；电击条件：电压1500V，电阻200Ω，电容25μF，脉冲时间4.5-5.0ms，一次电击；电击后，马上在电击转化杯中加入1mL 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，混匀后吸入1.5mL无菌EP管中，置于30℃摇床静置培养1h。

(6)取500μL菌液涂布在MD平板上，30℃培养至菌落出现。

(7)将MD固体培养基上出现的单菌落悬浮于1-2mL无菌水中，按浓度梯度点接种于添加了0.25、1.0、2.0、4.0mg/mL G418(Geneticin)的YPD平板，以筛选多拷贝数的GS115-pPIC9k-AGA毕赤酵母重组菌，在30℃条件下培养2-5d，观察菌落的生长情况，挑取在高浓度生长且低浓度也生长的菌落。

其中，MD(营养组氨酸缺陷型)(g/L)：20g/L葡萄糖，13.4g/L YNB，2mL/L生物素母液，15g/L琼脂粉，1mol/L山梨醇。

(8)菌落PCR验证是否为GS115-pPIC9k-AGA毕赤酵母重组菌。以质粒与基因连接处设计引物(AGA-Z:5’-AATTACCTACGTAAAGTTCTGGTTCTGGAAGCAGAATCATTTG-3’；AGA-F:5’-TTAATTCGCGGCCGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3’)进行PCR扩增目的基因，再进行核酸电泳验证，菌落PCR结果为4500bp左右，结果正确，见图2，验证正确的菌株命名为GS115-pPIC9k-AGA。

其中所涉及的PCR扩增程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸4min，循环扩增30次，72℃终延伸5min。

实施例2：α-琼胶酶的表达

将实施例1制备得到的菌株GS115-pPIC9k-AGA的单菌落接种于BMGY培养基，在30℃、转速300r/min条件下培养24-30h至OD600约为2。温度4℃转速3000rpm条件下离心收集菌体，弃去上清，将菌体重悬于BMMY培养基中继续培养。每24h加0.5％甲醇进行诱导表达，在培养72～96h后得到发酵液；分别取50mL的发酵液在4℃、10000rpm下离心10min，取上清液，即为胞外粗酶液，经测定，培养72h的粗酶液酶活为18.7U/mL。

实施例3：α-琼胶酶的纯化

采用镍柱对步骤(1)制备得到的重组α-琼胶酶进行纯化，平衡液(A液，pH 8.0)为500mM NaCl+50mM Tris-HCl+20mM咪唑，洗脱液(B液，pH 9.0)为500mM NaCl+50mM Tris-HCl+500mM咪唑。粗酶液调节pH至8.0，经0.45μm水系膜过滤后待纯化。在2mL/min流速下，用5～6个柱体积的缓冲液A平衡离子柱；上样，流速为2mL/min；之后先用6～8个柱体积的缓冲液A平衡离子柱，再采用20％的缓冲液B进行梯度洗脱，流速为2mL/min。根据洗脱峰收集对应洗脱液，置于透析袋中，在4℃条件下采用20mM、pH 8.0的Tris-HCl进行过夜透析，随后通过SDS-PAGE蛋白电泳(如图3所示)进行鉴定。α-琼胶酶的理论分子量为154.5kDa，与SDS-PAGE估算分子量相符。对纯化后的比酶活进行检测，结果显示，比酶活为20.1U/mg。

实施例4：α-琼胶酶的最适温度验证

检测实施例3制备得到的α-琼胶酶最适温度，具体步骤如下：分别在不同温度下(10-70℃)测定的酶活，以在35℃测定的酶活为100％，结果如表4所示。α-AGA酶的最适反应温度为35℃，在低温10℃下仍能保持61.8％的最高活力，证明该酶具有良好的冷适性。

表4α-琼胶酶的最适温度

实施例5：冷适性α-琼胶酶在DNA凝胶回收中的应用

由于SEQ ID NO.2所示的α-琼胶酶在低温下有较强的活力，应用该酶在常温下水解凝胶回收DNA。具体步骤如下：

(1)将1200ng的线性DNA加样至琼脂糖浓度为1％的琼脂糖凝胶加样孔中，恒压电泳至DNA样品泳动至距离凝胶前沿＜三分之一距离处，结束电泳，在凝胶成像仪上观察电泳条带及位置，切下含DNA片段的琼脂凝胶块并称重后捣碎。

(2)向步骤(1)得到的200mg琼脂糖凝胶中添加实施例3制备得到的纯酶液，加酶量总计为50U，在常温(25℃)的摇床中反应6h；

(3)待胶融化后，使用DNA纯化柱完成洗脱纯化，使用酶标仪测定提取的DNA的浓度与含量。

对照组参照以上相同步骤，区别在于：

实验对照组步骤(2)具体为：向步骤(1)得到的凝胶中添加与胶等体积的碧云天公司生产的融胶液，在60℃下加热10min。

空白对照组步骤(2)用等量的水替换酶液。

以未切胶回收前的DNA含量为100％，计算结果如表5所示。

表5α-琼胶酶凝胶回收DNA得率表

使用α-琼胶酶室温下处理凝胶6h可以使琼脂完全融化，水解得到的液体纯化后能达到78.0％的DNA提取率，与市场上的化学融胶液具有大致相同的效果，表明使用该α-AGA酶可以在无需高温与化学试剂的情况下，环保无害、节约能源地用于水解琼脂、DNA凝胶回收。

对比例1：

具体实施方式同实施例1～3，区别在于，将SEQ ID NO.2所示的琼胶酶替换为具有不同氨基酸序列的琼胶酶(表6所示)，按照实施例4或5的方法验证，结果显示，表6所示的琼胶酶在低温下(10-25℃)酶活较低，低于其最高活力的10％，无法充分水解琼脂糖凝胶，DNA回收率分别为6.6％与8.5％。

表6不同琼胶酶的应用效果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。