REG3A在制备辅助诊断或治疗肝母细胞瘤的试剂或药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及REG3A在制备辅助诊断或治疗肝母细胞瘤的试剂或药物中的应用。

背景技术

肝母细胞瘤(Hepatoblastoma)为高度恶性胚胎性儿童肝肿瘤，起源于胚胎早期停滞在肝分化发育的不同阶段的未成熟肝母细胞，具体发病机制尚不明确。肝母细胞瘤多发生于5岁以内的婴幼儿，约占儿童肝脏恶性肿瘤的80％，病情进展迅速，且在过去30年发病率逐渐增加，能否完整切除肿瘤是影响肝母细胞瘤预后的关键因素。然而由于肝母细胞瘤起病隐匿，进展迅速，初诊时约70％以上患儿为III-IV期，错过手术完全切除的机会，导致较差预后，5年生存率约60％，因此实验室辅助诊断意义重大。

AFP是目前临床上肝母细胞瘤辅助诊断的唯一血清标志物，然而约10％的患儿血清AFP水平正常或仅轻度升高，且肝脏良性病变患者AFP水平也可能升高、婴幼儿血清AFP呈天然高水平，仅通过血清AFP水平对肝母细胞瘤进行实验室辅助诊断及预后判断具有一定的局限性，且AFP水平不能指示肝母细胞瘤遗传特征的变异性，对于开发基于证据的治疗方法作用有限。

再生基因家族蛋白3A(REG3A)是一种19-kDa的钙依赖型凝集素蛋白，参与细胞增殖、凋亡和组织修复等生物学过程的调控，可分泌入血。目前，针对肝母细胞瘤发病机制的研究主要集中在Wnt/β-catenin信号通路的过度激活上，约70％的肝母细胞瘤表现出Wnt/β-catenin信号通路的异常激活。据文献报道，REG3A是Wnt/β-catenin信号通路的下游蛋白，在28例以β-catenin突变的肝母细胞瘤中，REG3A上调。

然而，目前尚无研究对肝母细胞瘤患儿血清中REG3A的表达水平进行检测，未见REG3A在肝母细胞瘤辅助诊断和治疗中的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足提供REG3A作为辅助诊断肝母细胞瘤的生物标志物方面的应用。

第一方面，本发明提供REG3A基因或蛋白作为辅助诊断标志物在制备辅助诊断肝母细胞瘤的试剂中的应用。

第二方面，本发明提供一种检测REG3A的试剂在制备辅助诊断肝母细胞瘤的试剂中的应用，所述检测REG3A的试剂为检测REG3A基因或蛋白含量的试剂，其中REG3A基因或蛋白表达水平高提示儿童肝母细胞瘤患病风险高。

作为优选，所述检测REG3A基因或蛋白含量的试剂选自特异性扩增REG3A基因的引物、特异性识别REG3A基因或其转录本的探针、特异性抗REG3A蛋白的抗体中的一种。

作为优选，检测样品为组织、血清或血浆。

作为优选，所述辅助诊断肝母细胞瘤的试剂包括但不限于核酸抽提试剂、聚合酶链反应试剂、蛋白免疫印迹试剂和酶联免疫反应试剂。

第三方面，本发明提供一种用于诊断肝母细胞瘤的试剂盒，其包含前述检测REG3A基因或蛋白含量的试剂。

第四方面，本发明提供REG3A基因或蛋白或它们的抑制剂在制备治疗肝母细胞瘤的药物中的应用。

作为优选，所述抑制剂选自小分子化合物或生物大分子。

更优选地，所述生物大分子选自以REG3A基因或其转录本为靶序列、且能够抑制REG3A蛋白表达或基因转录的小干扰RNA、dsRNA、shRNA、微小RNA、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

更优选地，所述生物大分子为REG3A基因的干扰RNA，靶点包括siREG3A-1和siREG3A-2，序列如下：

siREG3A-1：UCCCUCUGGGGUUCUUCAC(SEQ ID NO:1)

siREG3A-2：UAAUUCAUCACAUCACUGC(SEQ ID NO:2)。

第五方面，本发明提供一种筛选治疗肝母细胞瘤的潜在物质的方法，包括：

(1)用候选物质处理表达REG3A基因或蛋白的体系；

(2)检测步骤(1)所述体系中REG3A基因或蛋白的表达；若所述候选物质可降低REG3A基因或蛋白的表达，表明该候选物质是需要的潜在物质，反之则表明该候选物质是非需要的潜在物质。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明通过在16对肝母细胞瘤组织和癌旁组织中进行高通量测序分析，发现REG3A在肝母细胞瘤中高表达，并在患者血清中得到验证，表明其可作为辅助诊断肝母细胞瘤的标志物，改善其辅助诊断标志物匮乏的现状。

2.本发明中辅助诊断标本可以是组织、血清或血液，来源丰富，易于获取。

3.本发明发现敲减REG3A能够明显抑制肝母细胞瘤细胞增殖并促进其凋亡过程，说明REG3A参与肝母细胞瘤发生发展的过程，可作为肝母细胞瘤治疗的新靶点，具有重要的科学和临床价值。

综上所述，本发明为肝母细胞瘤的临床辅助诊断和治疗提供新的手段和方法。

附图说明

图1是实施例中REG3A在肝母细胞瘤组织和细胞中高表达；A:Heatmap图指示肝母细胞瘤组织相较于癌旁组织高表达Top10的基因；B:火山图表示肝母细胞瘤组织和癌旁组织中基因差异表达；C:qPCR检测肝母细胞瘤患者肿瘤组织中REG3A mRNA表达情况；D:WB检测4对肝母细胞瘤组织中REG3A蛋白表达水平；E:WB检测不同阶段小鼠肝组织的REG3A表达水平；F:WB检测肝母细胞瘤细胞和正常肝细胞中REG3A的表达水平。

图2是实施例中REG3A在肝母细胞瘤血清中的表达水平；A:WB检测REG3A在18例肝母细胞瘤血清和18例健康体检儿童血清中的表达水平；B:ELISA方法检测44个肝母细胞瘤血清和44例健康体检儿童血清中的表达水平；C:ROC曲线分析血清REG3A水平的辅助诊断效能。

图3是实施例中干扰REG3A对肝母细胞瘤的影响；A:siREG3A处理之后检测REG3A的表达；B-C:使用CCK8方法测定siREG3A处理后HepG2和HuH6的增殖情况；D-E:使用流式方法检测siREG3A后HepG2细胞的凋亡情况。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、材料与方法

1.1研究对象纳入标准

所纳入研究的肝母细胞瘤患者及体检儿童在血液样本采集前均签署知情同意书。1)肝母细胞瘤患者组纳入标准为经病理组织学或细胞学检查确诊为肝母细胞瘤；2)健康体检儿童组纳入标准为无恶性肿瘤、无肝脏相关良恶性疾病的儿童保健科体检儿童。

1.2血清样本的收集和处理

在相同条件下收集44例肝母细胞瘤患儿和44例体检儿童的血清样本，采集后离心取血清，储存于-80℃冰箱中保存备用。

1.3肝母细胞瘤组织样本的收集和处理

肝母细胞瘤组织样本和癌旁组织标本(距离肿瘤边缘>3cm)均来自于上海儿童医学中心肿瘤外科，所有样本已取得患者同意，并通过伦理委员会批准。

1.4细胞

肝母细胞瘤细胞系Hep-G2和HUH6购买自中科院细胞库(上海)，Hep-G2细胞采用MEM培养基，HUH6采用DMEM培养基，置于5％CO

1.5荧光定量PCR检测REG3A mRNA表达

采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测REG3A mRNA的表达，提取组织或细胞总RNA后使用RNA反转录获取cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR分析，REG3A引物序列为：上游引物ATATCCCACCAGAGAGGTAAG(SEQ ID NO:3)，下游引物GGTCACATCCATCATCTTCTAC(SEQ ID NO:4)。

1.6 WB检测组织和血液中REG3A蛋白水平

采用免疫印迹(WB)检测组织和血清中REG3A蛋白表达量。向肝母细胞瘤组织裂解液或血清中加入6×LoadingBuffer，煮沸10min后，上样于SDS-PAGE凝胶，同时加入marker。80V进行电泳，溴酚蓝前沿达到分离胶时，改用15mA/板直至溴酚蓝到达胶底部。按黑色栅、吸水海绵、三张滤纸、吸水海绵、凝胶、标记好的PVDF膜、三张滤纸、吸水海绵、红色栅的顺序安装形成三明治结构放入转膜装置中，PVDF膜朝向正极、凝胶朝向负极，在恒流200mA 4℃条件下转移30min。将PVDF膜使用1×TBST漂洗5min，使用小牛血清封闭非特异性抗原位点，加入1×TBST稀释的REG3A兔多克隆抗体，4℃摇动过夜，1×TBST摇动洗膜10min共3次，加入用TBST稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔Ig室温摇动孵育1h，1×TBST摇动洗膜10min共3次。将膜放入含有过氧化氢/鲁米诺和对碘苯酚的底物混合液中摇动10min，在暗室中将X光胶片压在膜上，曝光1-3min后取出X光胶片，置于显影液中，直至出现清晰图像，取出沥干水分置于定影液中2min。清水冲洗胶片，晾干。

1.7酶联免疫吸附测定ELISA

使用提纯的REG3A捕获抗体包被至微孔板，微孔板中加入标本也设置对照标准孔，每孔加入不同终浓度的标准品50μL，样本孔每孔先加入40μL的样本稀释液再加入10μL血清标本，向各孔加入100μL辣根过氧化物酶标记液，封膜后37℃孵育1h。弃去多余液体，使用洗涤液加入每孔30s后弃去，重复5次后甩干孔内的液体。向各孔加入A、B显色剂各50μL，避光37℃孵育显色，15min后加入反应终止液，即可使用酶标仪450nm测定吸光度值。根据标准品吸光度值计算得出回归方程，从而得到患者血清标本中REG3A的浓度。

1.8人工合成针对REG3A的siRNA

设计针对REG3A的siRNA：siREG3A-1和siREG3A-2，靶点序列如下：

siREG3A-1：UCCCUCUGGGGUUCUUCAC(SEQ ID NO:1)；

siREG3A-2：UAAUUCAUCACAUCACUGC(SEQ ID NO:2)。

1.9CCK8检测细胞增殖

将细胞按照对应的密度接种到6孔板中，转染当天细胞汇合度约40-50％，转染时将siRNA加入含阳离子脂质体的OPTI-MEM中(siRNA终浓度为50nM)，细胞培养箱中孵育5-6h后更换新鲜的完全培养基，转染约48h后收取细胞备用。细胞处理好后，以每孔1000个细胞的量接种至96孔板中，分别在接种后的每天加入10μL CCK8溶液，继续培养，2h后放入酶标仪检测450nm波长处的吸光度，计算相对增殖活性。

1.10统计学方法

数据采用SPSS 20.0(SPSS，Chicago，USA)进行统计学分析，用卡方检验分析组间差异性，p＜0.05表示具有统计学差异。

2、结果

2.1转录组学分析REG3A在肝母细胞瘤患者中过表达

利用高通量测序技术分析16对肝母细胞瘤组织及其配对的癌旁组织中mRNA的表达水平对测序数据进行生信分析，以Foldchange>2，p-value<0.05作为cut-off值统计差异表达基因(图1A和1B)，发现REG3A mRNA在HB组织中高表达，根据FoldChange值排名Top1。接着利用qPCR实验在32对肝母细胞瘤组织及其配对的癌旁组织中对REG3A mRNA的表达进行验证，结果同样表明REG3A在肝母细胞瘤患者中显著高表达(图1C)。随后采用WB的方法在4对肝母细胞瘤组织和配对的癌旁组织中检查REG3A的蛋白水平，发现REG3A蛋白在肝母细胞瘤组织中高表达(图1D)。同时发现肝母细胞瘤细胞中REG3A表达量显著高于正常肝细胞(图1E)。并且随着小鼠胎肝的发育，REG3A蛋白表达水平逐渐降低，在成体组织中表达水平极低(图1E)，上述结果表明REG3A作为癌胚基因，在肝母细胞瘤组织中高表达，而在成体组织中表达水平极低，提示REG3A可能具有良好的辅助诊断及靶向治疗价值。

2.2REG3A在肝母细胞瘤患者血清中高表达

为评估REG3A作为肝母细胞瘤血清辅助诊断标志物的潜能，首先采用WB的方法检测18例肝母细胞瘤患者血清与18例健康体检儿童血清中REG3A的表达水平，结果显示REG3A在体检儿童血清中表达水平极低，而在肝母细胞瘤患者血清中显著高表达(图2A)。进一步使用ELISA方法对44例肝母细胞瘤患者与44例健康体检儿童血清中REG3A的水平进行检测。根据标准品数值分布特征，采用三次方程进行拟合(y＝3.266x

表1

表2

2.3REG3A促进肝母细胞瘤发生发展

为探索REG3A在肝母细胞瘤中的作用，使用siRNA沉默REG3A基因的表达，并使用qRT-PCR进行效率验证(图3A)，CCK8实验结果表明，敲低REG3A可抑制肝母细胞瘤细胞的增殖(图3B-C)；利用流式细胞仪检测凋亡细胞数量，发现siREG3A干扰有效诱导肝母细胞瘤细胞的凋亡(图3D-E)。综上可知，REG3A参与肝母细胞瘤发生发展的过程，在肝母细胞瘤细胞的增殖中具有重要功能，可作为肝母细胞瘤治疗的新靶点，具有重要的科学和临床价值。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。